Стволовые клетки вносят важный вклад в развитие, гомеостаз и репарацию тканей. В течение жизни организма стволовые клетки д. пролиферировать и давать дифференцированные, но коротко живущие клетки, такие как клетки крови, кожи, кишечного эпителия и спермии. Основной функцией стволовых клеток является генерация идентичных копий самих себя (самообновление) а также продукция различных дифференцированных клеток, которые представляют зрелую ткань. Многие изученные стволовые клетки, в частности, те, что от модельных систем беспозвоночных, осуществляют эти функции благодаря асимметричным клеточным делениям-т.e., одна дочерняя клетки адоптирует судьбу своей матери, тогда как др. воспринимает более детерминированную судьбу, инициируя дифференцировку.¹ Асимметричные клеточные деления являются критическим механизмом для поддержания тканевого гомеостаза, предупреждая как избыточную пролиферацию стволовых клеток, которая может приводить к образованию опухолей, так и к истощению пула стволовых клеток, это может приводить к старению/дегенерации ткани.^1,2

Исследования на нескольких модельных системах предполагают два разных механизма, с помощью которых могут быть достигнуты асимметричные клеточные деления.^1,3 Первый механизм связан с внешними судьбоносными детерминантами, проставляемыми нишами стволовых клеток, микроусловиями, которые инструктируют характеристики стволовых клеток и базируются на асимметричном расположении дочерних клеток внутри в противоположность кнаружи ниши стволовых клеток (Figure 1(a)). Дочерние клетки после деления стволовой клетки могут первоначально иметь эквивалентный онтогенетический потенциал, но они могут приобретать разные судьбы благодаря воздействию разных внешних сигналов. В большинстве изученных модельных систем, таких как Drosophila germline stem cells (GSCs), стволовые клетки делятся асимметрично благодаря ориентации их митотического веретена перпендикулярно поверхности ниши, так что только одна дочерняя клетка сохраняет контакт с нишей и сохраняет характеристики стволовой, тогда как др. дочерняя клетка смещается прочь от ниши и начинает программу дифференцировки.⁴ Альтернативно второй механизм использует внутренне присущие детерминанты судьбы и базируется на асимметричном разделении судьбоносных детерминант между дочерними клетками⁵ (Figure 1(b)). Клетки используют апикально-базальную или планарную полярность окружающей ткани, чтобы заложить ось, вдоль которой поляризуется распределение судьбоносных детерминант и ориентируется митотическое веретено так, что эти детерминанты наследуются только одной дочерней клеткой после клеточного деления. Детерминанты судьбы или внешние или внутренние в конечном итоге влияют на ядро, приводя к разными профилям экспрессии, ответственным за судьбу клетки (Figure 1(a) and (b)). Напр., в нейробластах Drosophila, Prospero, который наследуется в дифференцирующуюся дочернюю клетку [ganglion mother cell (GMC)] тогда как асимметрично сегрегирующий цитоплазматический/кортикальный фактор, транслоцируется в ядро и способствует дифференцировке.^6-8 Возможно также, что асимметрия в ядре (подобная асимметрии в эпигенетическом состоянии двух дочерних клеток) вносит вклад в асимметрию делений стволовых клеток. Хотя эпигенетические изменения безусловно играют фундаментальную роль в регуляции клеточных судеб во время дифференцировки, сегодня неизвестно, существуют ли и насколько различны эпигенетические состояния, реализуемые во время асимметричного деления стволовой клетки. Стволовые клетки, как известно, делятся симметрично путем ориентации веретена так, чтобы контакт с нишей или прирожденные детерминанты судьбы одинаково распределялись между дочерними клетками.¹ Это дает две стволовые клетки, увеличивающие количество стволовых клеток во время развития или для компенсации потери стволовых клеток вследствие повреждения. В целом, клетки используют две разные стратегии, чтобы задать ориентацию плоскости деления в ответ на внутренние и внешние сигналы. Стволовые клетки могут быть ориентированы и поляризованы в ходе клеточного цикла-др. словами, собственно ориентация веретена предетерминируется перед вступлением клеток в митозы^.4 Альтернативно, клетки могут использовать запрограммированную ротацию веретена во время митоза, чтобы приобрести соотв. расположение.^9,10 Последняя стратегия может быть особенно благоприятна в случаях, при которых клетки переключаются между симметричными и асимметричными делениями.

DROSOPHILA MALE GSCs AND SOMATIC CYSCs

Architecture of the GSC and CySC Niche

Зародышевая линия самцов и самок Drosophila является наиболее изученной модельной системой для регуляции поведения стволовых клеток и асимметричных делений стволовых клеток, контролируемых с помощью ниш стволовых клеток. Drosophila GSCs самцов располагаются в нише, которая инструктирует их самообновление. На апикальном кончике семенников приблизительно 8-10 GSCs лежат в виде розетки вокруг кластера из постмитотических поддерживающих клеток, наз. осевыми (hub) клетками, главный компонент ниши GSC.¹¹ Drosophila GSCs самцов всегда делятся асимметрично, путем удержания одной дочерней клетки, прикрепленной к hub и вытеснением др. прочь из hub, обеспечивая тем самым самообновление GSC и дифференцировку клеток, наз., gonialblast (GB), соотв.(Figure 2(a)). GBs далее подвергается 4 митотическим делениям с неполным цитокинезом, продуцируя кластер из 16 взаимосвязанных сперматогоний, которые продуцируют сперматоциты, которые оказываются детерминированными к мейозу и в конечном счете дифференцируются в спермии. Тестикулярная ниша также содержит типа вторичных стволовых клеток , наз. cyst stem cells (CySCs; известны также как cyst progenitor cells). Функция CySCs, вместе с hub клетками, создавать нишу для GSC^s12 (Figure 2(a)). Пара CySCs энкапсулирует GSC и обеспечивает важными сигналами для качественных особенностей GSC.^13,14 Подобно GSCs, CySCs делятся асимметрично, чтобы давать постоянное пополнение не митотических поддерживающих клеток, которые энкапсулируют и эскортируют дифференцирующиеся зародышевые клетки.¹⁵ Пара cyst клеток покрывает каждый GB и его потомство, обеспечивая сигналами, которые обеспечивают дифференцировку.¹⁶ GSCs и CySCs физически прикреплены к hub клеткам с помощью слипчивых соединений, состоящих из Drosophila epithelial (DE)-cadherin и β-cateninArmadillo, которые концентрируются на кортексе клеток, соседствующих с hub⁴ (Figure 3(a) and (b)). В самом деле, клеточная адгезия между GSCs и hub клетками, также как и между CySCs и hub клетками, как было установлено, необходима для поддержания стволовых клеток.¹²

Signaling Pathways in Male GSC and CySC Niche

Ступица (hub) поддерживает самообновление GSCs и CySCs с помощью секреции коротко-действующих сигнальных лигандов, unpaired (Upd), которые активируют путь Janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) в соседних клетках^13,17,18 (Figure 2(c)). GSCs и CySCs мутантные по stat92E(STAT) или hop (JAK; кодируемый hopscotch геном) теряют свою способность к самообновлению и вместо этого дифференцируются. Кроме того, избыточная экспрессия Upd в ранних зародышевых клетках (GSCs или сперматогониях) или в ранних соматических клетках (CySCs или cyst клетках) вызывает избыточную пролиферацию недифференцированных похожих на стволовые клеток и приводит к образованию опухолей. Сегодня непосредственные нижестоящие мишени для JAK-STAT пути, который специфицирует качественные особенности GSC, не установлены, хотя гены кандидаты были описаны с помощью анализа микромассивов.¹⁹ Недавние исследования продемонстрировали, что транскрипционный репрессор zincfinger-homeodomain transcription factor 1 (zfh-1) критической нижестоящей мишенью пути JAK-STAT в CySCs.¹³ Поразительно, избыточная экспрессия Zfh-1 или вынужденная экспрессия постоянно активной JAK в CySCs ведет к избыточной пролиферации не только CySCs, но и также GSCs. Напротив, эктопическая экспрессия активной формы JAK тирозин киназы в зародышевой линии не вызывает массивной пролиферации GSCs или CySCs.¹³ Более того, GSCs, мутантные по STAT могут поддерживаться столь долго, пока CySCs содержат активный Zfh-1, демонстрируя, что CySCs являются критическим компонентом ниш GSC.¹⁴ GSCs, как полагают, нуждаются в активности STAT только, чтобы правильно ориентироваться в направлении и слипаться с hub клетками. Zfh-1, по-видимому, инструктирует GSC к самообновлению посредством передачи сигналов TGF-β-dpp/gbb.¹⁴ Decapentaplegic (dpp) и glass bottom boat (Gbb) обычно экспрессируются в hub клетках и CySCs, это в конечном итоге ведет к прекращению действия Bam (Bag-of-marbles, мастера регулятора дифференцировки) в зародышевой линии, внося вклад в самообновление GSC.²⁰ Однако интересно, что избыточная экспрессия dpp не вызывает опухолей GSC, а ведет к избыточной пролиферации сперматогоний,^20-22. указывая тем самым. что существуют дополнительные факторы, стоящие ниже Zfh-1, которые действуют совместно с передачей сигналов transforming growth factor-beta (TGF-β), чтобы обеспечить качественные особенности GSC.

Orientation of the Spindle by the Positioning of Centrosomes in Male GSCs

В контексте передачи сигналов в нише, описанной выше, митотическое веретено ориентируется перпендикулярно интерфейсу hub-GSC, это приводит к асимметричному делению. Слипчивые соединения концентрируются на GSC кортексе, соседствующем с hub, вместе с ademomatous polyposis coli 2 (APC2), обеспечивая сигналы полярности, с помощью которых GSCs оказываются ориентированными в течение всего клеточного цикла^4,23 (Figure 3(a)). В G1, одиночная центросома в каждой GSC располагается вблизи кортекса клетки, где клетка присоединяется к hub. Когда удвоенные центросомы разделяются, то одна центросома остается по соседству с hub, тогда как др. мигрирует к противоположной стороне клетки (Figure 3(a)). Эта стереотипная позиция центросом в свою очередь ориентирует митотическое веретено перпендикулярно интерфейсу GSC-hub, приводя к асимметричному делению. Интересно, что материнская центросом обычно остается по соседству с hub и наследуется GSC, тогда как вновь удвоенная центросома мигрирует к противоположной стороне клетки и наследуется GB²⁴ (Figure 3(a)). Это указывает на то, что GSCs самцов сохраняют оригинальную (очень старую) центриолю в течение длительного времени, возможно с того момента, когда впервые возникает популяция GSC во время развития. В самом деле, центросомы, маркированные с помощью временной экспрессии маркера центриолей green fluorescent protein-pericentrin/AKAP450 (GFP-PACT) во время раннего развития, сохранялись в GSCs даже на взрослой стадии.²⁴ Высокая способность материнской центросомы закреплять астральные микротрубочки может быть лежащим в основе клеточным механизмом, с помощью которого GSCs наследуют материнскую центросому во время деления. В GSCs, центросомы разделяются необычно рано, сразу после удвоения скорее, чем при переходе к G2/M: материнская центросома, по-видимому, сохраняет мощные астральные микротрубочки в ходе всего клеточного цикла, тогда как дочерняя центросома, мигрирующая к противоположной стороне клетки слабо ассоциирована с астаральными микротрубочками вплоть до поздней G2, перед началом митоза. Соответственно позиции материнской и дочерней центросом, также как и ориентация веретена были рандомизированы в GSCs, мутантных по centrosomin (cnn), которые имели сильно нарушенные астральные микротрубочки как результат дефектов околоцентриолярного материала.^25-28 Эти результаты указывают на то, что GSCs самцов воспринимают клеточные механизмы, которые поддерживают стереотипное положение центросом и ориентируют митотическое веретено, чтобы тонко регулировать исход асимметричного деления стволовых клеток внутри ниши. Интересно, что недавнее исследование продемонстрировало, что мутанты DSas-4, стержневого компонента центриолей, обычно ориентируют митотическое веретено в GSCs самцов, несмотря на полное отсутствие центриоли (а значит центросом).²⁹ Наше неопубликованное исследование показало, что в DSas-4 мутантных GSCs самцов spectrosome располагается на апикальной стороне GSC прикрепления к полюсу веретена, это напоминает механизм ориентации веретена в GSCs самок³⁰, указывая, что параллельный механизм может компенсировать потерю центросом во время асимметричного деления стволовых клеток.

Anaphase Spindle Repositioning in CySCs

Совместное взаимодействие GSCs и CySCs поддерживает сперматогенез. Поскольку каждая GSC энкапсулирована с помощью двух CySCs, а GB с помощью пары cyst клеток, CySCs д. подвергаться двум делениям на каждое деление GSC в среднем. Недавние исследования подтвердили, что CySCs подвергаются согласованным асимметричным делениям.¹⁵ Однако, GSCs и CySCs используют сильно отличающиеся клеточные механизмы, обеспечивающие асимметричные деления: GSCs всегда ориентируют своё веретено перпендикулярно hub (Figure 3(a)), это отражает соотв. поляризацию центросом в ходе множественных раундов клеточных циклов, тогда как CySCs вторично определяют положение веретена во время анафазы (Figure 3(b)). CySCs вступают в митозы с веретеном в случайной ориентации, но они переустанавливают его так, что один из полюсов веретена близок к hub клеткам во время или перед началом анафазы.¹⁵ CySC веретена очень динамичны, оба полюса веретена раскачиваются взад и вперёд во время метафазы и затем один из полюсов веретена быстро подтягивается к hub-CySC интерфейсу во время анафазы (Figure 3(b)). Остается неясным, существует ли асимметрия между двумя полюсами веретена в GSCs самцов (т.e., полюсами, содержащими материнскую или дочернюю центросомы, или полюсами с разной микротрубочки организующей активностью). Детальные молекулярные механизмы репозиционирования веретена в CySCs ещё не прояснены полностью. Тем не менее, репозиционирование веретена CySCs нуждается в следующем: (1) Cnn, интегральный компонент центросом, которые также необходим для центросомы GSC и ориентации веретена; (2) dynein, моторный белок, которые тянет полюс веретена в направлении кортикального сайта мишени, как в случае с нейробластами Drosophila, где dynein комплекс регулирует ориентацию веретена; и (3) moesin (Moe), белок связывающий кортекс с актиновым цитоскелетом, который важен для изменений формы клетки и стабильности веретена во время митозов культивируемых клеток. Молекулярные механизмы, которые ориентируют веретена,, по-видимому, различны для GSCs и CySCs у самцов: поскольку GSCs нуждаются в Cnn и Apc2, но не в Moe, CySCs нуждаются в Cnn и Moe, но не в Apc2 (Figure 3(a) and (b)). Мы может только предполагать, почему GSCs и CySCs используют такие разные клеточные механизмы, чтобы ориентировать веретено и делиться асимметрично. В противоположность GSCs, которые являются круглыми в ходе всего клеточного цикла, CySCs принимают уплощенную и сложную форму, наматываясь на GSCs, это, по-видимому, отражает функцию CySCs как компонента ниши для GSCs. С такой плоской и сложной формой клетки поддержание ориентации веретена с началом митоза может быть затруднено. Поэтому CySCs могут использовать репозиционирование веретена во время митоза, когда клетки становятся более округлыми, как это наблюдается в культивируемых клетках, чтобы разделится асимметрично без нарушения своей роли по оборачиванию вокруг GSCs во время интерфазы. Несмотря на эти различия имеется сходство в базовой схеме закрепления и притягивания полюса веретена к hub-GSC или hub-CySC интерфейсу у GSCs и CySCs: кортикальная сеть слипчивых соединений и актиновый цитоскелет, служащие в качестве платформы затягивания центросом посредством действия моторных белков (Figure 3(a) and (b)). Эти исследования указывают на существование разных клеточных механизмов, используемых стволовыми клетками, чтобы делиться асимметрично, в зависимости от др. факторов, таких как форма клеток и анатомия ткани.

Effect of Aging on Centrosome and Spindle Orientation in Male GSCs

Уменьшение в количестве или активности стволовых клеток может приводить к дегенерации ткани, связанной с возрастом и болезнью. В самом деле, зависимое от возраста снижение в экспрессии Upd в hub, как было установлено, вносит вклад в потерю GSC в преклонном возрасте.³¹ Сходным образом количество GSC у самок также снижается с возрастом из-за изменений в GSCs, а также в клетках ниш.³² Внутренние и внешние изменения стволовых клеток, по-видимому, являются генеральными характеристиками старения стволовых клеток, как это наблюдается в стволовых клетках млекопитающих.^33-36 Помимо изменений в ориентации стволовых клеток относительно ниш, которые предшествуют снижению количества GSC, вносящее вклад в снижение сперматогенеза: перед снижением количества GSC становится существенным то, что GSCs уже замедлили свою пролиферацию из-за повышения неправильной ориентации центросом.³⁷ GSCs, содержащие неправильно ориентированные центросомы, прогрессивно накапливаются с возрастом и эти GSCs арестовываются или задерживаются в клеточном цикле и не заканчивают митоза. Как результат старые самцы Drosophila содержат существенную фракцию арестованных GSCs. Поразительно. этот арест клеточного цикла, по-видимому, временный и GSCs повторно вступают в клеточный цикл после коррекции ориентации центросом. Последнее указывает на то, что существует новый механизм КПП, который блокирует ход митоза независимо от того, правильно ли расположены центросомы рядом с местом прикрепления к hub.

Поразительно, многие неправильно ориентированные GSCs возникают в результате дедифференцировки сперматогоний, механизм, по-видимому, ответственный за поддержание популяции стволовых клеток после длительного периода времени.^38,39 В ходе всего взрослого периода Drosophila индивидуальные GSCs теряются с определенной скоростью.^40,41 Дедифференцировка частично дифференцированных сперматогоний для замещения потерянных стволовых клеток может быть особенно важной в зародышевой линии самцов, поскольку неправильная ориентация веретен или симметричные деления стволовых клеток редко наблюдаются в GSCs дикого типа. Такие дедифференцированные GSCs обнаруживают высокий показатель неправильно ориентированных центросом и подвергаются аресту клеточного цикла пока не возникнет вновь соотв. ориентация центросом в отношении к hub, наблюдается увеличение средней длины клеточного цикла GSCs, даже если ни одна из них не арестована надолго (i.e., quiescent). Это может коррелировать с тем фактом, что зародышевые клетки, которые детерминированы к дифференцировке не наследуют 'очень старую' центросому и что дедифференцированные GSCs теряют свою 'очень старую' центросому как только они детерминируются к дифференцировке.⁴² Необходимы дальнейшие исследования для выяснения необходимо ли возвращение зародышевыми клеткам якоря относительно старой центросомы вблизи соединения между GSCs.

Эти исследования показывают, что старение стволовых клеток, которое в конечном итоге ведет к тканевому и организменному старению, является многофакторным процессом, который использует внутренние и внешние сигналы.

DROSOPHILA FEMALE GSCs

Architecture of the Female GSC Niche

Овариальная ниша Drosophila состоит из двух типов соматических клеток: клетки терминальной филаменты (TF) на конике гермариума (на переднем кончике каждой овариолы, которая является яйца-продуцирующей единицей оварий), и клеток шапочки в основании TF клеток (Figure 2(b)). В каждом гермариуме от двух до трех клеток GSCs физически прикреплены к 5-7 cap клеткам посредством слипчивых соединений, которые содержат как β-catenin, так и DE-cadherin (Figure 3(c)). Потеря любого из этих белков из GSCs ведет к потере стволовых клеток, указывая тем самым, что адгезивность ниш является важной для подержания стволовых клеток maintenance.⁴³ После деления GSC, одна из дочерних клеток остается ассоциированной с нишей и сохраняет характеристики стволовых клеток, тогда как др. теряет контакт с нишей и становится цитобластом, готовым к дифференцировке. Цитобласт проходит 4 дополнительных раунда временных умножающих делений с неполным цитокинезом, чтобы сформировать кисту из взаимосвязанных клеток, которые прекращают митотическую пролиферацию. В конечном итоге одна из 16 клеток становится ооцитом, тогда как др. 15 подвергаются множественным раундам эндорепликации, чтобы продуцировать мРНК и белки для поддержки продукции ооцита в качестве питающих клеток (Figure 2(b)). Овариальная ниша GSC содержит также др. типа соматические клетки, наз. escort стволовые клетки (ESCs), которые морфологически напоминают CySCs самцов. ESCs также тесно ассоциированы с cap клетками и энкапсулируют GSCs цитоплазматическими расширениями (Figure 2(b)). Однако, в отличие от CySCs в семенниках, ESCs, также как и их дочерние эскортные клетки, по-видимому, обычно пассивны, а развивающиеся зародышевые клетки проходят через ESCs и экскортные клетки до тех пор, пока не окажутся энкапсулированными фолликулярными клетками.⁴⁴

Signaling Pathways in Female GSC Niche

Cap клетки секретируют два bone morphogenetic protein (BMP) лиганда, Dpp и Gbb, которые активируют type I и type II BMP рецепторы Tkv и Sax в GSCs, приводя непосредственно к транскрипционной репрессии Bam, ключевой фактор, способствующий дифференцировке^45-47 (Figure 2(d)). Помимо этого неизвестный сигнал, регулируемый с помощью Piwi/Yb в TFs и cap клетках, также участвует в репрессии экспрессии Bam и тем самым способствует поддержанию самообновления GSC.^48,49 Пока неясно пересекаются ли BMP сигнал и Piwi-регулируемый сигнал из cap клеток выше, чтобы репрессировать экспрессию Bam или Piwi/Yb участвует в регуляции продукции BMP в нише. Тем не менее, принудительная экспрессия Bam в GSCs заставляет их дифференцироваться, а потеря Bam дает цитобласты, которые продолжают пролиферировать подобно стволовым клеткам, приводя к образованию опухолей яичников.⁴¹ Как и у GSCs самцов, JAK-STAT сигнальные пути играют критическую роль в функционировании овариальных ниш и действуют как в cap клетках, так и в ESCs. Недавние исследования показали, что передача сигналов JAK-STAT в cap клетках позитивно регулирует экспрессию dpp, внося тем самым вклад в самообновление GSC.^50,51 ESCs также нуждаются в передаче сигналов JAK-STAT, чтобы специфицировать качественные особенности ESC и GSC. Удаление STAT из ESCs приводит к быстрой потере GSCs, тогда как избыточная экспрессия Upd (JAK-STAT лиганд) в ESCs приводит к увеличению числа как ESCs, так и GSCs, что приводит иногда к образованию опухолей зародышевой линии. В соответствии с идеей, что GSCs самцов нуждаются в сигналах как от hub, так и от CySCs для самообновления, GSCs самок, по-видимому, не только нуждаются в Dpp сигнале от cap клеток, но и также в дополнительном неизвестном сигнале, продуцируемом ESCs, который обеспечивается активацией передачи сигналов JAK-STAT внутри ESCs⁵² (Figure 2(d)).

Orientation of the Spindle by the Spectrosome in Female GSCs

Подобно GSCs самцов, GSCs самок обычно подвергаются асимметричным клеточным делениям, чтобы поддерживать баланс между числом стволовых клеток и дифференцирующихся клеток. Однако GSCs самок используют иной клеточный механизм, чем GSCs самцов, чтобы ориентировать свои митотические веретена перпендикулярно поверхности ниши. Хотя митотическое веретено в GSCs самцов устанавливается с помощью стереотипичного позиционирования центросом. как описано выше (Figure 3(a)), веретено GSCs самок ориентируется путем закрепления одного из полюсов веретена на spectrosome, на специальной богатой spectrin сферической органелле в цитоплазме GSCs в яичниках^30,53 (Figure 3(c)). В соответствии с этим элиминация спектросомы из GSCs самок ведет к случайной ориентации веретена.³⁰ Цитоплазматический dynein, как было установлено, участвует в закреплении полюса веретена на спектросоме.⁵⁴ В соответствии с тем фактом, что спектросома закрепляет митотическое веретено в GSCs самок, асимметричное расположение спектросомы вблизи интерфейса hub-GSC сохраняется в течение всего клеточного цикла GSCs, тогда как позиции центросом, как было установлено, случайны во время интерфазы GSCs и не нужны для ориентации веретена.⁵⁵ Напротив, в GSCs самцов, расположение спектросомы не обнаруживает соотв. локализации относительно hub клеток в интерфазе,⁴ и ориентация центросомы/веретена не нарушается в отсутствие спектросомы (our unpublished results).

GSCs самок спорадически теряются из своих ниш с периодом полужизни приблизительно в 4-5 недель.⁴¹ В противоположность GSCs самцов. которые редко имеют веретена параллельные hub клеткам, GSCs самок могут делиться, когда их митотические веретена параллельны cap клеткам, давая симметричные деления стволовых клеток, при этом обе дочерние клетки сохраняют контакт с нишей и качественные характеристики стволовых клеток.⁵⁶ Зародышевые клетки самок также обладают потенциалом подвергаться дедифференцировке.³⁹ Т.о., оба механизма дедифференцировки и симметричных делений, могут вносить вклад в поддержание количества GSC в яичниках.

OTHER STEM CELL SYSTEMS: VARIATION ON A THEME

В большинстве случаев молекулярные детали ориентации веретена и их значение (напр., какие клетки являются компонентами ниш, какие сигнальные пути участвуют в этих клетках и значение ориентации веретена относительно этих клеток ниш) изучены недостаточно. Однако в соответствии с ориентацией веретена, наблюдаемой у разных типов стволовых клеток, подразумевается, что ориентация веретена служит в качестве регуляторного механизма поведения стволовых клеток. Однако существуют также типы стволовых клеток, которые не обнаруживают соотв. ориентации веретена. Здесь мы суммируем такие примеры стволовых клеток, где ориентация веретена и/или ниши охарактеризованы достаточно хорошо, даже если картина в целом неясна.

Drosophila ISCs

Средняя кишка Drosophila содержит мультипотентные intestinal стволовые клетки (ISCs), которые поддерживают кишечный эпителий, генерируя энтероциты, а также энтероэндокринные клетки.^57-59 Notch передача сигналов, с лигандом Delta, исходит из ISCs, регулирует дифференцировку ISC дочерних клеток. ISCs обнаруживаются вдоль базальной мембраны внутри кластеров из 2-3 диплоидных клеток, которые разбросаны среди полиплоидных энтероцитов, выстилающих кишечник. ISCs, по-видимому, делятся асимметрично с неслучайной ориентацией веретена, обеспечивая типичное поддержание ISCs на более значительной области поверхности контакта с базальной мембраной по сравнению с их дифференцирующимися дочерними клетками.⁵⁸ Интересно, что wingless лиганд из мышиных клеток, которые обнаруживаются непосредственно под базальной мембраной, активирует передачу сигналов wingless внутри ISCs для их самообновления.⁶⁰ Возможно, что наблюдаемая ориентация веретена в ISCs ведет к асимметричному наследованию контакта с источником wingless. Хотя механизм, который регулирует ориентацию митотического веретена ещё не охарактеризован.

Mammalian ISCs

ISCs млекопитающих, как полагают, локализуются внутри или в четвертой позиции (+4 cells) от дна крипты.⁶¹ Недавнее исследование показало, что crypt base columnar (CBC) клетки, специфически экспрессирующие Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 (Lgr5), располагаются на дне крипты и представляют собой ISCs. В самом деле, одиночные Lgr5⁺ стволовые клетки могут формировать долгоживущие, самообновляющиеся 'minigut' или 'organoid' клетки при культивировании в соотв. условиях.⁶² Было показано, что терминально дифференцированные Paneth клетки, которые происходят из fLgr5⁺ стволовых клеток, составляют нишу для стволовых клеток в кишечных криптах.⁶³ Paneth клетки секретируют epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-alpha (TGF-α), Wnt3 и Notch лиганд Dll4, все они необходимы для поддержания стволовых клеток в кишечных криптах. Соотв., кокультивирование Lgr5⁺ стволовых клеток с уже дифференцированными Paneth клетками продуцируют organoids с более высокой эффективностью.⁶³ Др. исследование показало, что Bmi-1⁺ клетки в четвертой позиции крипт представляют собой ISCs.⁶⁴ Взаимоотношение между Lgr5⁺ и Bmi-1⁺ клетками пока неизвестны.

Ориентация веретена в ISCs пока спорна. Одни сообщения утверждают, что клетки внутри компартмента Lgr5⁺ стволовых клеток стремятся располагать свои митотические веретена перпендикулярно просвету крипты, которые оказываются рандомизированными в apc мутантных криптах,⁶⁵, а более недавнее сообщение зафиксировало случайную ориентацию веретена в ISCs.⁶⁶ Клональный анализ Lgr5⁺ ISCs продемонстрировал, что эта популяция поддерживается с помощью нейтральной конкуренции между симметрично делящимися стволовыми клетками.⁶⁷ Более того, основной компонент ниш, Paneth клетки, перемешиваются с ISCs/CBC,⁶³ затрудняя наблюдение, как ориентация веретена перпендикулярно просвету вносит вклад в асимметричные деления стволовых клеток. Эти данные не согласуются с идеей, что ориентация веретена вносит вклад в асимметричные деления ISC. Следовательно, наблюдаемая ориентация веретена в Lgr5⁺ клетках может отражать др. биологические процессы, чем асимметричные деления стволовых клеток.

Mammalian Skin Stem Cells

Стволовые клетки в развивающемся эпидермисе располагаются внутри наиболее внутреннего (базального) слоя эпителия, который покоится на базальной мембране. Кожные стволовые клетки базируются на сигналах от базальной мембраны, чтобы поддерживать качественные особенности стволовых клеток. Они дифференцируются как только выходят из ниши и перемещаются в супрабазальное положение. На ранних стадиях эмбрионального развития большинство веретен ориентировано параллельно базальной мембране в однослойном эпидермисе (Figure 4(a)). Позднее, начиная с эмбрионального дня (E)14, совпадающего со стратификацией, большинство веретен ориентировано перпендикулярно, генерируя одну базальную и одну супрабазальную клетку⁶⁸ (Figure 4(b)). Эти перпендикулярные, а значит асимметричные деления в самом деле необходимы для ст ратификации эпидермиса.⁶⁹

Ориентация веретена закладывается с помощью эволюционно законсервированных детерминантов апикально-базальной полярности, таких как partitioning defective-3 (Par-3), atypical protein kinase C (aPKC), Leucine-Glycine-Asparagine tripeptides in its N-terminal region (LGN, известен также как GPSM2) и inscuteable (INSC), который взаимодействует с компонентами митотического веретена, такими как nuclear mitotic apparatus 1 (NuMA1) и компонентом dynactin p150Glued, чтобы управлять ориентацией веретена. Интересно, что поляризованная локализация этих белков базируется на integrins и cadherins, связывающих внутриклеточную полярность с тканевой полярностью. Более того, как и в нейробластах Drosophila асимметричное деление этих стволовых клеток использует сигнальный путь Notch.^5,69

Недавняя работа продемонстрировала, что каждая эпидермальная клетки может подвергаться как асимметричному, так и симметричному делению, которые регулируются с помощью экспрессии INSC и локализации NuMA.⁷⁰ Это предоставляет прямое доказательство, что каждая стволовая клетка может переключаться между асимметричным и симметричным делениями, по крайней мере, в этой системе, в результате будут возникать различающиеся субпопуляции, которые подвергаются только симметричными или асимметричным делениям.

Поскольку доказательства для популяции стволовых клеток и их асимметричных клеточных делений посредством ориентации веретена весомы, то поведение стволовых клеток во взрослом эпидермисе менее известно. Клональный анализ показал, что одиночная популяция, обозначаемая как детерминированные предшественники, которая делится и самообновляется и дифференцируется стохастически, поддерживает гомеостаз взрослого эпидермиса.⁷¹ Это скорее напоминает случай стволовых клеток кишечных крипт, которые поддерживают популяцию за счет нейтральной конкуренции симметрично делящихся стволовых клеток. Поэтому необходимо определить, играет ли ориентация роль в гомеостазе взрослого эпидермиса.

Mouse Satellite Cells

Сателлитные клетки это стволовые клетки для мышечных волокон, они выполняют важную роль в поддержании гомеостаза мышечной ткани и способствуют репарации мышц после повреждений. Сателлитные клетки располагаются под базальной ламиной, по соседству со зрелыми миофибриллами. Эти стволовые клетки поддерживаются с помощью сигналов от мышечных волокон хозяина.^72,73 Помимо присоединения к базальному листку, который состоит из laminin, collagen и протеогликанов, он важен также для поддержания качественных характеристик стволовых клеток.⁷⁴ Сателлитные клетки обычно молчащие, но могут быть индуцированы к вступлению в клеточный цикл после повреждения. Недавние исследования продемонстрировали, что Pax7⁺Myf5^- сателлитные стволовые клетки могут асимметрично генерировать др. Pax7⁺Myf5^- стволовые клетки и Pax7⁺Myf5⁺ детерминированные дочерние клетки.⁷⁵ Со стороны базального листка сателлитные клетки экспрессируют integrin α7β1 рецепторы, которые взаимодействуют с laminin, тогда как апикальная сторона экспрессирует молекулы клеточной адгезии M-cadherin, которые закрепляют сателлитную клетку на и трансдуцируют сигналы с мышечных волокон.^76,77 Как результат планарная ориентация веретена, дает две дочерние клетки, которые подвержены как апикальным, так и базальным сигналам, в результате возникают две дочерние клетки с судьбой стволовой клетки. Напротив, при апикально-базальной ориентации возникают две дочерние клетки, одна остается в контакте с базальным листком и воспринимает судьбу стволовой клетки, а др. дочерняя клетка, которая теряет контакт с базальным листком воспринимает специфицированную судьбу.⁷⁵ В случае острого повреждения, которое требует быстрого вмешательства сателлитных клеток по соседству из неповрежденных мышц, сателлитные клетки, как было установлено, преимущественно делятся симметрично.^78,79 Молекулярные механизмы, которые устанавливают полярность сателлитных клеток и ориентацию митотического веретена пока не установлены.

Caenorhabditis elegans GSCs: No Spindle Orientation

C. elegans GSCs является интересным и впечатляющим примером, где вклад и расположение ниши стволовых клеток очевиден, пока веретено не будет ориентировано в отношении ниши. У C. elegans, distal tip cell (DTC) на дистальном конце взрослых гонад создают нишу для GSCs. DTC сигналы к зародышевой линии посредством сигнального пути Notch обеспечиваются с помощью Delta/Serrate-подобных лигандов LAG-2 и APX-1, которые продуцируются с помощью DTC и germline proliferation-1/Notch рецептора, присутствующего на поверхности зародышевых клеток.^80,81 Соотв. дочерние клетки в тесной близости к DTC будут сохранять качественные характеристики стволовых клеток, а дочерние клетки удаленные от DTC начнут дифференцировку. В отличие от делений Drosophila GSC, которые ориентированы перпендикулярно к нише, как было описано выше, зародышевые клетки C. elegans не обнаруживают какой-либо склонности к ориентации вдоль дистально-проксимальной оси гонад.⁸² Т.о., очевидно. что количество C. elegans GSCs контролируется исключительно соприкосновениями с клеточными компонентами ниши, вместо того, чтобы быть следствием асимметричного деления каждой GSC. Это указывает на то, что мы не обязательно способны 'узнавать' популяции стволовых клетки внутри ткани, базируясь на их склонности к определенной ориентации веретена.

The Spindle Orientation Mechanism is Conserved in Systems that Do Not Rely on the Niche

Drosophila эмбриональные и личиночные нейробласты подвергаются асимметричным делениям, чтобы генерировать самообновляющийся нейробласт и GMC, которая делится более одного раза, чтобы продуцировать две клетки, которые будут терминально дифференцированы. В нейробластах Drosophila белки Par-3, Par-6, aPKC, INSC, Pins, Gai и Mud накапливаются на апикальной стороне клеточного кортекса и преимущественно наследуются нейробластом.^5,83 Эти белки, как полагают, не влияют на судьбы клеток непосредственно. Вместо этого они индуцируют асимметричное расположение детерминант клеточных судеб, таких как Numb, Pon, Miranda, Prospero и Brat на базальной стороне и их сегрегацию в GMC. Поразительно, недавние исследования вживую показали, что результат деления нейробласта (т.e., симметричного в противоположность асимметричному) управляется с помощью соотношения апикальных к базальным детерминантам при нормальных уровнях экспрессии.⁸⁴ Асимметричное распределение апикальных Par белков закладывает ось полярности в нейробласте.⁸⁵ Как ожидалось, у мутантов par митотические веретена ориентированы случайно , а детерминанты клеточной судьбы распределены униформно по кортексу клетки.

Интересно, что недавнее исследование подтвердило, что асимметрия центросом используется для асимметричного деления нейробластов Drosophila.^86,87 Одна центросома остается связанной с апикальным кортексом, тогда как др. перемещается на др. сторону клетки, чтобы заложить необходимую ориентацию веретена. В противоположность Drosophila GSCs самцов, однако, дочерняя центриоля наследуется нейробластом после деления с помощью запрограммированной инактивации материнской центросомы и активации дочерней центросомы во время каждого клеточного цикла.^88,89 Нарушения функции центросом (или у cnn или DSas-4 мутантов) ведет к симметричным делениям нейробластов.^90,91 Асимметричные деления нейробластов были также нарушены, когда количество центросом было умножено.⁹² Однако эти условия приводили только с умеренному увеличению количества нейробластов (как в случае cnn мутантных GSCs⁴). Итак, поскольку эти данные демонстрируют важный вклад клеточных биологических различий между материнской и дочерней центросомами, они также аргументируют против роли в детерминации судьбы материнской или дочерней центросомы.

Клетки предшественники радиальной глии в коре мозга эмбрионов мышей преимущественно подвергаются асимметричным делениями после начала нейрогенеза. Во время их асимметричных делений ориентация веретена тонко регулируется так, что только одна дочерняя клетка наследует в апикальной коре находящийся Par-3, подобно нейробласту Drosophila.⁹³ Интересно, что как у Drosophila GSCs самцов, клетки предшественницы радиальных клеток преимущественно наследуют материнскую центросому после деления,9⁴ это указывает на эволюционную консервацию асимметрии центросом как стратегию для асимметричных делений. Потеря ninein, белка. специфичного для зрелых центриолей, приводит к потере предшественников радиальной глии, что заставляет авт. предположить, что наследование материнской центросомы является критическим для поддержания стволовых клеток (radial glial progenitor cells).⁹⁴ Однако остается возможность, что потеря функции центросом скорее, чем материнская центросома per se, ведет к нарушению поддержания клеток предшественников радиальной глии. В случае GSCs самцов, сперматогонии, которые потеряли свою оригинальную материнскую центросому после инициации дифференцировки, могут вернуться обратно к GSC путем дедифференцировки, указывая тем самым, что качественные особенности GSC не абсолютно базируются на существовании материнской центросомы.³⁷ Тем не менее, исследования врожденной микроцефалии у человека выявило мутации в генах, кодирующих центросомальные белки,^95,96 демонстрируя важность функции центросом в поддержании клеток нейральных предшественников.

FURTHER IMPLICATION OF SPINDLE ORIENTATION: BEYOND FATE DETERMINATION

Как было рассмотрено выше координация детерминантов судьбы и ориентация веретена являются общим механизмом для асимметричных делений стволовых клеток. Др. линии исследований показали, что веретено может быть использовано для асимметричной сегрегации др. факторов, которые не являются детерминантами судьбы per se, но связаны с или ассоциированы с клеточными судьбами стволовой клетки или дифференцирующейся дочерней клетки. Такие факторы могут вести себя подобно попутчиками (hitchhiker), которые используют веретено, чтобы сегрегировать асимметрично, с конечной целью, напр., защиты стволовых клеток.

Asymmetric Inheritance of Chromosome Strands during Asymmetric Cell Division

была предложена 'immortal strand hypothesis' (ISH) в качестве механизма, с помощью которого взрослые стволовые клетки могут ограничивать накопление мутаций, возникающих в результате ошибок репликации ДНК. ISH предполагает, что взрослые стволовые клетки могут сохранять старую (бессмертную) нить ДНК во время асимметричных делений, исключая, тем самым, все индуцированные репликацией мутации в дифференцирующиеся дочерние клетки.⁹⁷ Эта гипотеза интенсивно исследовалась в последние годы в разных популяциях стволовых клеток. В этих исследованиях короткие пульсовые воздействия bromodeoxyuridine (BrdU) во время S фазы часто были использованы для мечения вновь синтезируемых нитей ДНК, что сопровождалось отслеживаемым периодом без BrdU, во время которого отслеживалась сегрегация BrdU-меченных хромосом (Figure 5(a)). Эти BrdU pulse-chase эксперименты подтвердили, что ISH в некоторых системах стволовых клеток (эпителиальные клетки молочных желез,⁹⁸ сателлитные клетки скелетных мышц,^78,79 взрослые нейральные стволовые клетки,99,100 и Drosophila GSCs самок¹⁰¹), но не в др. системах (эпидермальные клетки,¹⁰² стволовые клетки волосяных фолликулов,¹⁰³ эмбриональные неокортикальные клетки предшественники,¹⁰⁰ мышиные гематопоэтические стволовые клетки,¹⁰⁴ и Drosophila GSCs самцов¹⁰⁵). В некоторых случаях встречались противоречивые результаты в отношении одного и того или сходного типа клеток (стволовые клетки мышиных кишечных крипт^65,66). В большинстве систем неясно, стволовые клетки или всегда делятся асимметрично или переключаются между асимметричными и симметричными делениями. Кроме того, одновременное наблюдение за судьбами дочерних клеток (стволовые клетки в противовес дифференцирующимся дочерним клеткам) и характером расхождения BrdU затруднено во многих системах. Эти осложнения затрудняют чёткую интерпретацию экспериментальных данных, иногда даже одного и того же типа стволовых клеток. Следовательно, вопрос ISH нуждается в дальнейших исследованиях. Недавняя работа использовала технику Chromosome orientation-fluorescence in situ hybridization, с помощью которой нить-специфические зонды гибридизировались только со старыми нитями хромосом, которые не включали BrdU, чтобы исследовать сегрегацию хромосомных нитей.¹⁰⁶ Они идентифицировали 'plus' и 'minus' матричные нити ДНК мышиных хромосом, используя зонды, специфические для центромерных и теломерных повторов. С помощью этого метода они наблюдали достоверную неслучайную сегрегацию хромосом в субнаборе эпителиальных клеток крипт толстой кишки, тогда как хромосомные нити, по-видимому, случайно распределялись в культивируемых фибробластах легких и эмбриональных стволовых клетках.

Недавно мы предположили, что материнская центросома, которая стереотипно сохраняется в некоторых стволовых клетках, таких как Drosophila GSCs самцов и мышиные предшественники радиальной глии, могут быть использованы в качестве способа закрепления бессмертной нити ДНК.¹⁰⁷ Однако наша недавняя работа продемонстрировала, что Drosophila GSCs самцов не соответствуют модели бессмертной нити-хотя их центросомы сегрегировали асимметрично. Следовательно, 'бессмертная' материнская центросома не обязательно ведет к сегрегации бессмертной нити ДНК.¹⁰⁵

Asymmetric Inheritance of Misfolded Proteins

Старение на клеточном уровне в целом характеризуется снижением клеточной функции и скоррелировано с накоплением поврежденных или неправильно упакованных белков. Избыток неправильно упакованных белков формирует aggresomes, которые не могут быть деградированы с помощью протеосом. Прижизненные исследования митотических клеток человека продемонстрировали, что экспериментально индуцированные aggresomes накапливаются вблизи одной из центросом и т.о., наследуются только одной дочерней клеткой.¹⁰⁸ Rujano et al. показали, что такие aggresomes наследуются только одной дочерней клеткой после деления с помощью ассоциированных центросом.¹⁰⁹ Стволовые клетки крипт тонкого кишечника от пациентов с болезнью укладки белков, были лишены aggregates, хотя дифференцированные клетки накапливали неправильно упакованные белки, это привело авт. к предположению, что асимметричное расхождение aggresomes в дифференцирующиеся дочерние клетки является механизмом защиты стволовых клеток (Figure 5(b)). Однако было показано, что Lgr5⁺ ISCs делятся симметрично, как описывалось ранее,⁶⁷ и поэтому неясно, как aggresomes могут расходиться асимметрично во время митозов. Всё же асимметричная сегрегация aggresomes и симметричные деления ISC не обязательно взаимно исключающие: сегодня дефинитивные маркеры стволовых клеток, такие как Lgr5 и Bmi-1 доступны, сегрегация aggresome в ISC и компартменты дифференцирующихся клеток д. быть пересмотрены тщательно. В том же сообщении также было показано, что Drosophila нейробласты, сконструированные, чтобы экспрессировать фрагмент huntingtin, обнаруживают поляризованное распределение huntingtin в митозах, хотя в этом случае aggresomes сегрегируют в нейробласт, оставляя GMC свободными от aggregates.¹⁰⁹ Это ведет к предположению, что клетки с более длительным периодом жизни (которые являются нейронами скорее, чем нейробластами в случае Drosophila нейронального клона) защищены от накопления неправильно упакованных белков (Figure 5(b)).

CONCLUSION

In this article, we reviewed the mechanism of asymmetric стволовые клетки division by means of spindle orientation. Accumulating knowledge illuminates the importance of spindle orientation as a common strategy conserved in many стволовые клетки. Spindle orientation in the context of tissue anatomy is precisely regulated such that стволовые клетки division occurs in a desired way (asymmetric vs symmetric division) for tissue development and homeostasis. The gap between our current understanding of стволовые клетки-specific factors such as master transcription factors of stemness and our current understanding of generic cellular components such as microtubules and cell–cell junctions has only begun to be filled. We foresee exciting years to come during which this gap will be filled, bringing about a comprehensive understanding of how the стволовые клетки program controls its cellular components to achieve their remarkable function.

Spindle positioning in the stem cells niche Swathi Yadlapalli, Yukiko M. Yamashita WIREs Developmental Biology Volume 1, Issue 2, pages 215–230, March/April 2012

Spindle positioning in the stem cells niche
Swathi Yadlapalli, Yukiko M. Yamashita
WIREs Developmental Biology Volume 1, Issue 2, pages 215–230, March/April 2012