Клон остеобластов состоит из спектра клеток, начиная с остеопредшественников, происходящих из мезенхимных стволовых клеток, которые затем дифференцируются, чтобы сформировать зрелые кость-формирующие остеобласты и выстилающие кость клетки. Финальная стадия в жизненном цикле клона наступает, когда субнабор зрелых остеобластов оказывается погребенным в кости в качестве механочувствительных остеоцитов [1]. Только кость-формирующие клетки, остеобласты, важны для развития, роста и поддержания скелета [1]. Помимо своей критической роли в скелете, клетки клона остеобластов, как было установлено, важны для др. физиологических систем. Остеопредешественники могут поддерживать и модулировать эритропоэз, а зрелые остеобласты ответственны за многие эндокринные функции кости, включая регуляцию расхода энергии [3]-[5] и фертильности самцов [6]. Более того, остеоциты играют важную роль в метаболизме минералов [7] и резорбции кости [8], [9].
Генетический, молекулярный и биохимический подходы используются для идентификации большинства ключевых генов, которые необходимы для детерминации, пролиферации, дифференцировки и апоптоза предшественников остеобластов, также для активности зрелых остеобластов и остеоцитов [1]. Пример этого - открытие, что сигнальный путь Wnt играет центральную роль во многих функциональных аспектах клона остеобластов [10]. Однако эти исследования не предоставили информации о том, как ключевые сигнальные гены взаимодействуют в сложных клеточных сетях, это является критическими для полного понимания молекулярных механизмов, которые лежат в основе клеточных процессов и болезней. Во многих случаях информация относительно того, как гены взаимодействуют в сети, получается после того как выясняется процесс с использованием только традиционных подходов [11].
Системная генетика возникает как подход, который обеспечивает системного уровня перспективу роли генетической изменчивости в клеточных функциях и болезнях [12]. Системная генетика базируется на принципах и методах системной биологии, но сфокусирована на определении того, как естественно возникающая генетическая изменчивость нарушает клеточные фенотипы [13]. Основание системной генетики это набор аналитических подходов, которые включают геномные ассоциации, открытие экспрессии локусов количественных признаков (eQTL), моделирование причинности и анализ сетей [14].
Одним из наиболее мощных инструментов системной генетики является анализ сетей. Биологические сети могут базироваться на множестве разных типов взаимодействий [15], таких как генетические, межбелковые и транскрипционных факторов связывание. Однако наиболее распространённые сети, используемые в исследованиях системной генетики, базируются на коэкспрессии. В контексте системной генетики сети совместной экспрессии генерируются с использованием глобальных данных по экспрессии, собранных среди множества генетически уникальных индивидов [16]. Паттерны экспрессии генов, которые возникают из каждого уникального набора генетических нарушений, используются для количественной оценки корреляционных взаимоотношений между генами на геномной шкале. Сети коэкспрессии обычно обладают двумя важными отличительными свойствами, i) они модулярны, при этом разные модули представлены плотными кластерами генов, которые обнаруживают высокую коэкспрессию и ii) модули коэкспрессии часто концентрируются в генах, которые обладают сходными функциями [17]. Поскольку модули содержат функционально сходные наборы генов, они могут быть использованы для вычленения многих кусочков информации о системе. Напр., ряд исследований показал, что суммарные измерения поведения модуля часто коррелируют со сложными процессами или болезненными фенотипами [18]-[20]. Идентификация таких модулей создает список генов и путей, которые, скорее всего, играют роль в процессах или болезнях. Кроме того, гены внутри модуля могут быть организованы с помощью связей. Со многими связями гены называются ступицами ("hubs") и в сети коэкспрессии hub гены являются теми, которые наиболее сильно коррелируют с наибольшим количеством др. модульных генов [21]. Важны исследования, которые обнаруживают, что наличие связей коррелирует с биологически важными свойствами. Напр., ступицы в сетях дрожжей, как было установлено, скорее всего существенны для роста, чем non-hub гены [22]. Наличие связей было найдено как обязательное для жизнеспособности в модуле коэкспрессии головного мозга человека, ассоциированного с глиобластомой [23]. Недавно мы продемонстрировали, что в модуле коэкспрессии, ассоциированном с Bone Mineral Density (BMD) у человека, hub гены были, скорее всего, генетически ассоциированы с BMD, чем non-hub гены [24]. Мы показали также, что hubs внутри сетей коэкспрессии хондроцитов играют ключевые роли в дифференцировке хондроцитов [20].
В данном исследовании мы реконструировали сеть коэкспрессии кости, используя Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) и профили микромассивов экспрессии генов из выборок бедра, собранных от 96 Hybrid Mouse Diversity Panel (HMDP) линий. Полученная в результате сеть была использована для идентификации основного модуля генов (module 9; M9), специфичного для клеток остеобластного клона. Затем мы продемонстрировали, что вершиной двух M9 hub генов были регуляторы функции остеобластов и один был регулятором BMD
in vivo. Кроме того, мы показали, что локальная eQTL регулирует экспрессию секретируемого secreted frizzled-related protein 1 (Sfrp1), организующего транскрипционное поведение M9. Отметим, что Sfrp1 является антагонистом передачи сигналов Wnt, которая является основным про-остеобластным сигналом, а Sfrp1 трансгенные и нокаутные мыши обнаруживают альтерации в BMD и в функции остеобластов [25], [26]. Далее мы продемонстрировали физиологически важную природу M9 путем идентификации строгого нелинейного взаимоотношения между M9 и BMD в HMDP и что M9 обогащен генами, участвующими в регуляции BMD у человека, посредством изучения геномных ассоциаций. Итак, наши результаты начали прояснять состав и роль клеточных сетей в клоне клеток остеобластов.
Discussion
В данном исследовании мы генерировали сеть коэкспрессии для костей, которая состоит из 21 "модуля", каждый из которых содержит гены, которые обладают сходными паттернами экспрессии и обогащены функционально сходными генами. Затем мы сфокусировались на одном модуле, M9, который, как предполагалось, специфичен для клеток клона остеобластов. Мы продемонстрировали, что пертурбации M9 hub генов изменяют пролиферацию и дифференцировку остеобластов и для одного hub гена, Maged1, меняющего BMD in vivo. Кроме того, мы установили, что Sfrp1 локальный eQTL является ключевым драйвером экспрессии M9 генов, что M9 ассоциирует с BMD в HMDP и является обогащенным гомологами генов, участвующих в регуляции BMD, что определено посредством GWA изучения у человека.
Традиционные генетические и молекулярные подходы являются мощными инструментами для выявления клеточной функции, однако, reductionist техники могут оказаться неспособными уловить общую организацию клеточных взаимодействий. Системная генетика является подходом, который может предоставить беспристрастное и более исчерпывающее мнение не только о генах, участвующих в клеточной функции, но и также о ключевых межгенных взаимодействиях. Путем использования сотен тысяч генетических нарушений, которые существуют в HMDP, чтобы идентифицировать корреляционные паттерны между генами на геномной шкале, мы оказались способны к открытию стержневой группы из 354 генов, которые коэкспрессируются на высоком уровне и функционируют совместно в сети. Мы полагаем, что эта сеть действует, чтобы распространять или модулировать основные остеобластные стимулы, такие как передача сигналов Wnt. Важно, что M9 представляет богатую информацию, которая может быть разработана в будущих экспериментах, чтобы повысить наше понимание генов и взаимодействий, которые являются критическими для собственно функции клона остеобластов.
Использование анализа сетей предоставляет ряд уникальных преимуществ. Во-первых, WGCNA предоставляет нам возможность сгруппировать гены в модули, исходя из их in vivo паттернов экспрессии в целой кости, и даже определить, какой модуль наиболее подходит клеткам клона остеобластов. Во-вторых, при традиционном анализе дифференциальной экспрессии в разных линиях только небольшой процент M9 генов может быть идентифицирован как дифференциально экспрессируемый и потенциально важный для кости. В-третьих, открытие, что M9 связанность высоко скоррелирована с GS, может быть установлена только посредством анализа сетей. Наконец, анализ интегрирующих сетей и GWA идентифицировали Sfrp1 в качестве регулятора M9. Хотя Sfrp1, как известно, играет важную роль в клоне остеобластов, наш анализ идентифицировал всю сеть генов, которые являются новыми нижестоящими мишенями для Sfrp1.
Ряд недавних работ идентифицировал "module quantitative trait loci (mQTL)" ( [35], [39], [40]). Здесь мы идентифицировали Sfrp1 как ген и его локальную eQTL в качестве механизма, лежащего в основе mQTL, регулирующего M9 eigengene. Это является одной из первых успешных попыток идентификации молекулярной основы mQTL. Это оказалось возможным благодаря способности выявлять высокого разрешения геномные ассоциации в HMDP и инструментам системной генетики. Это исследование подчеркивает преимущества в распутывании генетики регуляции модуля коэкспрессии с использованием высокого разрешения генетической референсной популяции, такой как HMDP.
Мы наблюдали, что M9 эпиген обратным образом скоррелирован с BMD у мышей с небольшой костной массой и позитивно скоррелирован с BMD у мышей со значительной костной массой. Эта нелинейная ассоциация, скорее всего, обусловлена сложной ролью клеток клона остеобластов в кости [1]. Остеобласты непосредственно контролируют образование кости и секретируют Osteoprotegerin, сильный ингибитор резорбирующих кость остеокластов [1]. Более того, пре-остеобласты и недавно остеоциты, как было установлено, секретируют RANKL, который способствует генезу остеокластов и резорбции кости [8], [9], [41]. Следовательно, M9 "activity" , скорее всего, представляет баланс между остеобластами обеспечиваемым образованием кости и остеобластами и остеоцитами обеспечиваемой резорбцией кости. Возможно, что дифференциальный эффект высокой активности M9 в HMDP обусловлен клеточным составом (напр., различиями в относительных количествах остеопредшественников, зрелых остеобластов и остеоцитов) или др. факторами, которые предопределяются генетическим фоном. В соответствии с ролью генетического фона, многие с низким BMD HMDP линии с высокой экспрессией M9 эпигена принадлежат к AXB рекомбинантному инбредному набору. Более детальное фенотипирование линий с высокой экспрессией M9 и низкой или высокой BMD необходимо для прояснения различий. Во всяком случае ассоциация между M9 и BMD указывает на то, что она отражает физиологически важные различия в активности клеток остеобластного клона.
Мы идентифицировали строгую корреляцию между M9 коммуникабельностью (kme) и GS. Эта находка важна, поскольку она подтверждает, что не только M9 гены важны, но и топология M9 сети также важна для функции клеток клона остеобластов. Эта находка позволяет нам использовать kme информацию, чтобы назначить приоритеты генам для придания законной силы (validation). Поскольку большинство сильно связанных генов были наиболее скоррелированы с GS, то мы выбрали вершины двух ступиц (hubs) для дальнейших исследований. Большинство из вершин десяти hubs, как известно, функционируют в остеобластах (Table 2); однако, две вершины, Maged1 и Pard6g, как было установлено, не участвуют непосредственно в пролиферации. дифференцировке или минерализации остеобластов. Используя RNA interference, мы продемонстрировали, что оба гена играют роль в активности остеобластов.
Нокдаун siRNA Maged1 усиливает пролиферацию первичных остеобластов свода черепа. Это также усиливает раннюю экспрессию щелочной фосфатазы, маркера зрелых остеобластов. Удивительно, мы установили, что это снижает образование узелков минерализации. Maged1 является коактиватором транскрипции, участвующем в широком круге клеточных процессов, таких как регуляция миогенной дифференцировки, циркадные ритмы, половое поведение и ожирение [30], [31], [42]. Maged1, как было установлено, соединяется с гомеодоменовым белком DLX5 и необходим для его транскрипционной функции [32]. В соответствии с влиянием на функцию остеобластов Maged1 посредством DLX5, образование узелков минерализации в остеобластах у Dlx5-/- нокаутных мышей также низкое. Однако пролиферация Dlx5-/- остеобластов также снижена в противовес усилению пролиферации, наблюдаемому при нокдауне Maged1. Эффект Maged1 на пролиферацию остеобластов, однако, согласуется с наблюдениями, что он ингибирует пролиферацию в др. типах клеток [43], [44]. Это предполагает, что Maged1 может оказывать эффекты на функцию остеобластов независимо от активности DLX5. Увеличение щелочной фосфатазы и экспрессии Sp7 на 4 день после дифференцировки (оба маркера дифференцировки остеобластов) трудно примирить со снижением образования узелков минерализации на 14 день после дифференцировки. Следует отметить, что Sp7 и Akp2 были единственными маркерами остеобластов, которые увеличивались, это подтверждает, что нокдаун Maged1 может избирательно приводить к увеличению экспрессии Sp7 и Akp2 без индукции полного каскада дифференцировки. Однако, как было предположено выше, это может также отражать разные роли Maged1 в остеобластах. Альтернативное объяснение заключается в том, что конфликт раннего увеличения и позднего снижения дифференцировки является результатом временной природы нокдауна Maged1 с помощью siRNA. Наиболее важно, однако, то что мы продемонстрировали, что дефицит Maged1 in vivo приводит в результате к снижению BMD. Это согласуется со снижением образования узелков минерализации in vitro. Это также согласуется с Maged1, осуществляющим свои эффекты на функцию остеобластов посредством DLX5, поскольку Dlx5 дефицитные мыши также обнаруживают снижение костной массы [33]. Необходимы дальнейшие работы, чтобы определить точную роль Maged1 в остеобластах и как она транслируется в пониженную костную массу.
Семейство белков Par6 (partition defective) впервые было идентифицировано у C. elegans и Drosophila в качестве белков, необходимых для становления клеточной полярности [45]. Существует три гомолога Par6 у млекопитающих, PARD6A, 6B и 6G [46]. siRNA нокдаун Pard6g снижает пролиферацию и дифференцировку остеобластов. Возможно, что эти дефекты Pard6g обусловлены исключительно тем фактом, что клеточная полярность существенный процесс и возможно отражает функцию Pard6g в остеобластах. Однако, мы чувствуем что это мало вероятно, учитывая его членство в M9 и тот факт, что его экспрессия в остеобластах высокая и его экспрессия не связана с функцией дифференцировки остеобластов. Кроме того, Par6, как было установлено, участвует в скелетогенезе и биоминерализации у морского ежа [47]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы предполагать, что Pard6g участвует в передаче сигналов Wnt. Неканоническая передача сигналов Wnt является основным регулятором клеточной полярности и M9 содержит неканонические Wnts, такие как Wnt4 (также ген, ассоциирован с BMD у человека) [48].
Путь передачи сигналов Wnt является основным про-остеобластным стимулом [10]. В остеобластах Wnts связывают frizzled (Fzd) рецепторы и их корецепторы (LRP5 и LRP6) и вызывают стабилизацию и транслокацию β-catenin в ядре [10]. Sfrp1 противодействует передаче сигналов Wnt путем вмешательства во взаимодействие между Wnts и Fzd рецепторами [49]. Sfrp1 нокаутные мыши устойчивы к связанному с возрастом снижению трабекулярной костной массы и обнаруживают снижение апоптоза остеобластов/остеоцитов и усиление пролиферации и дифференцировки остеобластов [50]. Напротив, Sfrp1 трансгенные мыши обнаруживают снижение трабекулярной и кортикальной BMD и уменьшение пролиферации и дифференцировки остеобластов [25]. Используя геномные ассоциации, мы идентифицировали Sfrp1 в качестве регулятора M9. Базируясь на его известной роли в клетках клона остеобластов, его открытие в качестве главного регулятора M9 согласуется с M9, представляющим стержневую сеть, оперирующую в остеобластах/остеоцитах.
Bodine et al. продемонстрировали, что piperidinyl diphenylsulfone sulfonamide д. связывать и ингибировать активность SFRP1 [51], [52]. Однако существует беспокойство, что Sfrp1 является плохой лекарственной мишенью из-за его широкой тканевой экспрессии и связи между передачей сигналов Wnt и различными раковыми опухолями [26]. Принимая во внимание, что Sfrp1 регулирует экспрессию M9 генов, очень вероятно, что многие M9 гены являются нижестоящими мишенями Sfrp1 и в целом передачи сигналов Wnt. Это мнение подтверждается наблюдением, что пертурбации экспрессии Maged1 и Pard6g вызывают сходные эффекты на pcOBs, как это делают альтерации Sfrp1 [25]. Целенаправленное воздействие M9 генов д. способствовать увеличению образования кости более специфическим для кости образом.
Недавние исследования продемонстрировали, что коэкспрессия модулей может быть законсервирована между видами; поэтому серьёзный интерес к тому. могут ли гомологи M9 генов человека функционировать в виде подобных сетей. Это предмет будущих исследований, однако тот факт, что консервативные пути (прежде всего, передача сигналов Wnt), присутствующие в M9, подтверждают, что большинство M9 генов также должны играть роль в функционировании клеток клона остеобластов у человека. Кроме того, тот факт, что почти 10% генов, задействованных в наиболее объемлющем BMD GWA мета-анализе, являются членами M9, это также подтверждает мнение, что M9 имеет отношение к регуляции BMD у человека. Следует отметить, что 4 из 5 M9 BMD генов человека участвуют непосредственно в передаче сигналов Wnt, это снова подтверждает, что 'jn сигнальный путь является основным компонентом M9.
Наш подход не без изъянов. Одно из возможных ограничений, которое также может иметь преимущество, это генерация данных экспрессии на базе костной ткани. Альтернативный подход будет заключаться в получении профиля из популяций изолированных клеток. Это может оказаться более информативным, поскольку ясно, что разные клетки в остеобластном клоне выполняют разные часто противоречащие функции. С др. стороны, получение профилей костных клеток в их нативном сложном клеточном окружении может давать профили экспрессии, которые более представительны в отношении истинного состояния in vivo. Во всяком случае, мы верим, что это будет информативным в будущих исследованиях, повторяющих этот анализ с использованием популяций изолированных клеток, т.к. это может удалять некоторые шумы, связанные с усреднением экспрессии от многих типов клеток. Второе ограничение, это использование нами siRNA в первичных остеобластах свода черепа, чтобы оценить роль Sfrp1, Maged1 и Pard6g. В терминах Sfrp1, мы нарушали его экспрессию in vitro в одной из временных точек в остеобластах, изолированных из новорожденных мышей. Хотя эта система позволяет нам тестировать гипотезу, что Sfrp1 преимущественно модулирует экспрессию M9 генов, она не полностью воспроизводит эффекты различий в экспрессии Sfrp1 в HMDP. Известно, что Sfrp1 оказывает множественные эффекты на остеогенные предшественники, зрелые остеобласты и остеоциты [50]. Было бы идеальным протестировать эффект пертурбаций Sfrp1 in vivo, это могло бы стать фокусом будущих исследований. То же самое верно для Maged1 и Pard6g. Хотя мы четко продемонстрировали их участие в пролиферации и дифференцировке остеобластов, возможно, что мы упустили многие аспекты их функции, сфокусировавшись на двух стадиях в сложном жизненном цикле клеток клона остеобластов. Это особенно верно в случае гена Maged1, для которого мы наблюдали, что его уменьшение усиливает определенные аспекты дифференцировки ранних остеобластов, но по позднее снижает образование узелков минерализации.
Итак, мы использовали подходы системной генетики, состоящие из анализа сетей коэкспрессии, eQTL анализа, геномных ассоциаций и моделирования причинности для идентификации модуля (M9) коэкспрессируемых генов, которые играют важную роль в функционировании клеток клона остеобластов. Эти данные улучшают наше понимание важности генных сетей для функционирования остеобластов и демонстрируют способность системной генетики выявлять генные сети, участвующие в сложных клеточных процессах.
