Mesenchymal stem cells (MSCs) являются мультипотентными клетками, которые обладают способностью развиваться в разные типы взрослых мезенхимных клеток. Недавно были изолированы стволовые клетки из ткани сухожилий in vitro [1-4]. Эти клетки экспрессируют маркеры, родственные стволовым клеткам, формируют слипчивые колонии в культуре и обнаруживают потенциал самообновления [1-3]. Они могут дифференцироваться в остеогенные, хондрогенные и адипогенные клоны после индукции in vitro и могут формировать сухожилия-подобные, хрящ-подобные, кость-подобные и подобные соединениям сухожилиям с костью ткани после подкожной трансплантации мышам nude или nude модельным крысам [1, 2]. Мы назвали эти клетки tendon-derived stem cells (TDSCs), чтобы показать тканевое происхождение стволовых клеток, выделенных in vitro. Хотя MSCs, выделенные из др. тканей обладают некоторыми общими для стволовых клеток свойствами, они могут обладать некоторыми тканеспецифичными характеристиками и, следовательно, функциональными отличиями [5]. Наши недавние данные показали, что TDSCs обнаруживают более высокую клоногенность, пролиферацию, потенциал мультиклональной дифференцировки по сравнению с происходящими из костного мозга MSCs (BMSCs) in vitro [6]. По сравнению с BMSCs, TDSCs экспрессируют также более высокие уровни BMP рецепторов IA, IB и II, а также обнаруживают более высокую BMP-2-индуцированную остеогенную дифференцировку [7]. Эти данные подтверждают, что TDSCs и BMSCs могут быть разными типами клеток. Однако возможность, что TDSCs и BMSCs происходят из общего родоначальника, которые постепенно приобретают тканеспецифические фенотипы под влиянием локальных ниш, не может быть исключена. Поскольку многие маркеры, связанные со стволовыми клетками, как было установлено, экспрессируются TDSCs, но ни один из ни х не является специфичным, который мог бы уникально идентифицировать TDSCs in vitro как сухожильные стволовые клетки in vivo. Более того, маркеры, экспрессируемые сухожильными стволовыми клетками in vivo могут быть изменены вследствие культивирования in vitro. Следовательно, сухожильные стволовые клетки in vivo остаются спорными. По сравнению с in vitro характеристиками их качественные особенности in vivo, ниши и роли в сухожилии менее понятны. Культивируемые сухожильные стволовые клетки, как полагают, способствуют раннему заживлению сухожилий у животных моделей [8, 9]. Однако условия не были оптимизированы. Чтобы облегчить создание новых лекарств для модулирования функций эндогенных сухожильных стволовых клеток или оптимизировать условия для культивирования ex vivo сухожильных стволовых клеток для тестирования лекарств и репарации сухожилий, необходимо лучшее понимание характеристик in vivo, ниш и ролей стволовых клеток.

Stem cell niche and its clinical implications

Мезенхимные стволовые клетки обладают ограниченной функцией вне ниш. Ниши стволовых клеток более, чем просто гистологические и анатомические места. Они являются динамичным, хорошо контролируемым 3D микроокружением, которое взаимодействует и регулирует судьбы (покой, самообновление или дифференцировку) взрослых стволовых клеток благодаря действию клеточных (физические контакты) и не клеточных (регуляторные факторы) компонентов. Удаление MSCs из их нативного окружения во врем я культивирования in vitro может объяснить снижение потенциала мультиклональной дифференцировки взрослых стволовых клеток, таких как TDSCs, во время субкультивирования [10]. Т.к. MSCs, включая сухожильные стволовые клетки, определяются по их способности к самообновления и генерации разных клеток мезодермального клона, то идентификация компонентов анатомических и функциональных ниш, которые поддерживают их свойства 'стволовости' и регулируют их дифференцировку, важна. Это важно не только для понимания биологии MSC in vivo, но и также для практических целей мобилизации эндогенных MSCs и продукции достаточных количеств MSCs, реплицирующих in vivo характеристики in vitro для терапевтического использования. Используя TDSC в качестве модели in vitro, Zhang et al. [11] сообщили, что platelet-rich plasma clot releasate (PRCR) усиленная пролиферация TDSC и дифференцировка в tenocytes и тотальная продукция коллагена, подтверждают, что PRCR, которая обычно используется клинически для лечения повреждений и беспорядков сухожилий, скорее всего безопасно и может способствовать эффектам по заживлению сухожилий. Dexamethasone, который используется для лечения повреждений сухожилий, но часто ассоциирует с разрывами сухожилий и аномальным заживлением сухожилий, снижает средний размер колоний и количество низкой плотности теноцитов в культуре по сравнению с контрольными культурами, подтверждает, что dexamethasone может ингибировать рекрутирование клеток предшественников сухожилий [12]. В др. исследовании лечение человеческими TDSCs с dexamethasone снижало клеточную пролиферацию и способствовало дифференцировке не теноцитов in vitro. Воздействие Dexamethasone, следовательно, может снижать пул стволовых клеток и приводить к образованию не сухожильной ткани, которая может делать сухожилия чувствительными к разрывам [13]. Испольуя in vitro человеческие TDSC, Haasters et al. [14] сообщили, что bupivacaine, ropivacaine, но не morphine, оказывают значительный цитотоксический эффект на человеческие TDSCs, подтверждая, что morphine может быть наилучшим аналгетиком после реконструкции передней cruciate лигаменты в клинической практике. Хондроцит-подобные клетки обнаруживаются в клинических выборках tendinopathy [15]. Используя культуру экспланта сухожилия, содержащих стволовые клетки и клетки предшественники, изолированные из здоровой и tendinopathic ткани человека, de Mos et al. [16] сообщили, что triamcinolone и плазма, богатая тромбоцитами, влияют на паттерн экспрессии хондрогенных генов, указывая тем самым, что модель может быть использована для оценки существующего и будущего терапевтического вмешательства. Посредством инкорпорации in vivo факторов ниши в культуральную систему in vitro, система тестирования лекарств in vitro на TDSC, которая использовалась и в предыдущих исследованиях, может быть в дальнейшем улучшена и лучше отражать ситуацию in vivo.

Однако, идентификация ниш сухожильных стволовых клеток и определение, как функционируют сухожильные стволовые клетки локальных ниш, экспериментально затруднительно, поскольку отсутствуют специфические маркеры для отслеживания сухожильных стволовых клеток.

Where do tendon stem cells populate?

Vasculature as a perivascular niche for MSC

Полученные доказательства подтверждают, что стенки капилляров, малых сосудов и крупных сосудов содержат стволовые клетки и клетки предшественники [17-24]. Некоторые исследования далее подтвердили, что MSCs происходят из перицитов [19, 25]. Перициты (наз. также mural клетками) являются относительно недифференцированными клетками, которые расположены на противоположной просвету (abluminal) строне малых кровеносных сосудов и служат в качестве регуляторов кровотока в микроваскулатуре. Перициты и периваскулярные клетки из разных тканей, как было установлено, обладают фенотипом, который очень сильно напоминает таковой MSCs, включая hypo-immunogenicity, клоногенность, потенциал мультиклональной дифференцировки, долговременная мультипотентность, способность к миграции, а также экспрессия MSC маркеров (напр., CD44, CD90, CD73, CD105, CD166, SSEA-4, Stro-1) и маркеров перицитов (напр., 3G5, NG2, ALP, CD146, PDGF-β , α-SMA) [17-19, 21, 24, 26-31]. Используя технику генетического отслеживания клонов, Feng et al. [32] недавно продемонстрировали непосредственную дифференцировку генетически маркированных перицитов в одонтобласты как во время роста, так и репарации вследствие повреждений резцов. Однако, др. недавнее исследование поставило под вопрос концепцию, что перициты и MSCs возникают из одних и тех же клеток [33]. Вместо этого эти авт. постулировали существование разных популяций клеток с потенциалом дифференцировки в три разных клона, которые колокализуются с перицитами [33]. Помимо мелких кровеносных сосудов адвентициальная оболочка плодных и взрослых артерий также рассматривается как ниша стволовых клеток и клеток предшественников. Адвентициальные клетки формируют самый наружный слой крупных кровеносных сосудов и функционируют в качестве динамичного компартмента поставки клеток внутрь и наружу стенки артерий [34]. Последние литературные данные подтверждают существование мультипотентных MSCs внутри сосудистой адвентициальной оболочки [35-38]. Напр., Hoshino et al. [35] идентифицировали клетки предшественники в адвентиции легочных артерий человека, которые экспрессируют маркеры мезенхимных стволовых клеток и клеток предшественников, но негативны в отношении эндотелиальных и гематопоэтических клеточных маркеров и обнаруживают потенциал мультиклональной дифференцировки.

Периваскулярная локализация MSCs имеет важное биологическое и клиническое значение. Bo-первых, это может объяснить повсеместное распростране6ние MSCs в теле. Во-вторых, близость MSCs к кровеносным сосудам подтверждает, что они могут быть уникально расположены, чтобы отвечать на регуляторные сигналы из сосудистой системы, связанные с повреждением ткани или нарушениями, как из локальных, так у удаленных мест повреждений, и этом может предоставить путь модуляции функции MSC , чтобы поспособствовать заживлению ткани и лечению тканевых нарушений.

Vascular and non-vascular sources of tendon stem cells

Для сухожилий имеются также доказательства, что сосуды сухожилий могут обладать стволовыми клетками. Базируясь на in vitro и in vivo исследованиях было также показано, что периваскулярные клетки капилляров сухожилия supraspinatus человека экспрессируют как маркеры сухожильных клеток (Scx, collagen type I, collagen type III, smad8), так и маркеры стволовых клеток и клеток предшественников (CD133, Musashi-1, Nestin, CD44, CD29), помимо ассоциированного с перицитами маркера α-SMA [39]. Используя маркеры стволовых клеток, SSEA-4 и Sca-1, Mienaltowski and Bir [40] сообщили, что сухожильные стволовые клетки локализуются в основном в рыхлой ткани, окружающей Ахиллово сухожилие крыс, где присутствует большинство кровеносных сосудов по сравнению с самим сухожилием. Наши результаты также показали, что большинство iododeoxyuridine (IdU) label-retaining cells (LRC) обнаруживается в peritenon по сравнению с собственно сухожилием, а некоторые, но не все LRC, наблюдались в периваскулярных регионах peritenon у крыс надколенном сухожилии [41].

Однако, собственно сухожилие содержит мало сосудов по сравнению с др. тканями и получает он кровоснабжение в основном из endotenon и paratenon [42]. TDSCs крыс, хотя и позитивны в отношении маркера перицитов α-SMA, как показывает иммуноцитохимическое окрашивание [3], они не обнаруживают на своей поверхности экспрессии CD146, PGDFR-β и NG-2 во время культивирования in vitro, как показывает проточная цитометрия (unpublished results). Культивируемые TDSCs человека также не экспрессируют маркер перицитов CD146 на клеточной поверхности, как показывает проточная цитометрия [43]. Bi et al. [1] также продемонстрировали отсутствие экспрессии на поверхности CD106, сосудистого клеточного маркера, экспрессируемого BMSCs, вTDSCs in vitro . Сухожильные стволовые клетки или могут терять перицитарные маркеры во время субкультивирования in vitro и/или может существовать более одного источника сухожильных стволовых клеток в сухожилиях и TDSCs, используемые в нашем исследовании, могут представлять не сосудистый источник сухожильных стволовых клеток. TDSCs, используемые в нашей лаб., были выделены из собственно сухожилия после удаления peritenon, который содержит большинство кровеносных сосудов. Bi et al. [1] сообщили о расположении и выстраивании LRC между длинными параллельными коллагеновыми фибриллами, содержащими biglycan и fibromodulin и не наблюдали сосудов [1]. В согласии с этой находкой, мы наблюдали присутствие LRC между параллельными коллагеновыми фибриллами в собственно надколенном сухожилии крыс [41]. В самом деле, помимо периваскулярных регионов маркеры стволовых клеток и клеток предшественников, такие как nestin и Musashi-1 обнаруживались также в клетках сухожилий в плотном extracellular matrix (ECM) [39]. Эта находка подтверждает, что имеется не сосудистый источник стволовых клеток в сухожилиях. Недавно, Mienaltowski et al. [44] сообщили о выделении двух разных популяций стволовых клеток и клеток предшественников из peritenon и собственно Ахиллесова сухожилия мыши. Оба источника клеток оказались негативными в отношении перваскулярного поверхностного маркера CD133. Хотя обе популяции стволовых клеток и клеток предшественников были мультипотентными, только клетки, изолированные только из собственно сухожилия, были способны продуцировать кальцифицированный матрикс. Стволовые клетки и клетки предшественники, выделенные из peritenon, обнаруживали более высокий уровень мРНК endomucin (сосудистого маркера), но низкий уровень tenomodulin и scleraxis, по сравнению с клетками, выделенными собственно из сухожилия. Авт. поэтому предположили, что разные популяции стволовых клеток и клеток предшественников существуют в разных нишах в собственно сухожилии и peritenon; и стволовые клетки и клетки предшественники в peritenon могут быть более сосудистыми по происхождению. Kurth et al. [45] сообщили, что MSCs, идентифицированные in vivo в синовиальной оболочке коленного сустава отличались от перицитов. Эти MSCs пролиферируют и дифференцируются в хондроциты в областях метаплазии хряща внутри синовиальной оболочки вследствие повреждения суставного хряща [45]. В подтверждение этих находок Feng et al. [32] также сообщили об не-pericyte источнике помимо pericyte источника MSCs в пульпе зуба. Лишь небольшой процент одонтобластов управляется с помощью перицитов во время роста резцов и репарации после повреждения [32]. Популяция MSC-подобных клеток наблюдалась непосредственно мигрирующей из шеечного конца резца в направлении поврежденной области и вносили вклад в большинство одонтобластов [32]. Вклад периваскулярной ниши в регуляцию судьбы MSC в любой данной ткани, следовательно, может быть изменчив и может зависеть от степени развития сосудистой сети. В тканях с низким содержанием сосудов, таких как сухожилия, вклад периваскулярных ниш в регуляцию судьбы MSC может быть меньшим, чем в тканях с более экстенсивным кровоснабжением.

Мы установили, что LRCв сухожилиях являются гетерогенной популяцией клеток, т.к. ни один из протестированных маркеров индивидуальных MSC не метил все LRC и значит были не-LRC, которые были позитивны по MSC маркерам (unpublished results). Функционально различающиеся маркированные LRC, следовательно, могут существовать в сухожилии. Используя иммунофлюоресцентное мечение, CD146+ и α-SMA+ клетки были обнаружены по всей ткани сухожилия, помимо кровеносных сосудов, в надколенном сухожилии крыс [41]. Большинство LRC, включая те, что не были локализованы в кровеносных сосудах, было позитивным по CD146 и α-SMA, но не наоборот, указывая тем самым, что LRC, или располагаются вблизи кровеносных сосудов или нет, подобно перицитам [41]. Представляют ли не-perivascular, но похожие на перициты LRC клетки, которые мигрируют из стенки капилляров в окружающую ткань, ещё предстоит выяснить, это важно для мобилизации сухожильных стволовых клеток, расположенных дистально от сосудов, чтобы способствовать заживлению сухожилий и для лечения нарушений сухожилий посредством сосудистой системы.

Possible niche signals regulating tendon stem cells

Oxygen tension

Гипоксия является мощным супрессором митохондриального окисления [46] и, как было установлено, способствует 'stemness' взрослых и эмбриональных стволовых клеток (ESCs) [47-50]. Нет сообщений об измерениях или математических подсчётах напряжения кислорода в сухожилиях человека. Однако, разумно предположить, что напряжение кислорода внутри сухожилий низкое, т.к. кровоснабжение плохое, лишь треть от мышц [51]. Среда в сухожилии, скорее всего, гипоксична. Сравнение человеческих TDSCs, культивируемых в гипоксических и в нормальных условиях (2% и 20% напряжения кислорода) показало, что пролиферативная способность человеческих TDSCs лучше поддерживается (25% higher) в первых условиях [43]. Кроме того, гипоксия удваивала количества colony-forming unit-fibroblasts (CFU-F), обнаруживаемых на день 14, тогда как обратным образом супрессировалась дифференцировка TDSCs, что важно для жизненно необходимого поддержания стволовости [43]. Эти данные подтверждают, что гипоксия увеличивает не только пролиферативную способность, но и также пластичность TDSCs. Культивирование TDSCs в условиях гипоксии, следовательно, может сокращать время и лучше поддерживать потенциал мультиклональной дифференцировки этих клеток для репарации сухожилия и тестирования лекарств.

Extracellular matrix

Изменения структуры и состава ECM может нарушать баланс цитокинов и ростовых факторов, хранящихся в ECM, а также модулировать форму клеток и сигнальные события в сухожильных стволовых клетках, влияя в конечном итоге на их судьбу. Bi et al. [1] показали, что biglycan и fibromodulin являются важными компонентами ниш in vivo, т.к. истощение biglycan и fibromodulin у дважды нокаутных модельных мышей нарушено формирование надколенного сухожилия [1]. TDSCs, выделенные из дважды накаутированных модельных животных формировали кость-подобную помимо сухожилий-подобной ткань, тогда как дикого типа TDSCs формировали только сухожилие-подобную ткань, подтверждая, что biglycan и fibromodulin могут регулировать судьбу сухожильных стволовых клеток [1]. Это подтверждает роль ECM в патогенезе tendinopathy, т.к. изменения в составе ECM в повышенным отложением протеогликана часто наблюдаются у пациентов с аномалиями сухожилий [52]. Важность сухожильного ECM в поддержании стволовости сухожильных стволовых клеток подтверждена в недавнем исследовании, показавшем, что кроличьи TDSCs, культивируемые на матриксе сухожилия, лишенном клеток, обнаруживают более высокую пролиферацию и лучшие свойства стволовости по сравнению с TDSCs, культивируемыми на поверхности культурального пластика [53]. Биоактивность матрикса сухожилия, лишенного клеток, может быть результатом компонентов матрикса и/или связанных ростовых факторов. Необходимы дальнейшие исследования для понимания механизма поддержания с помощью матрикса сухожилия стволовости TDSCs. Помимо состава, микро- и нано-архитектуры ECM может также испускать топографические сигналы, которые могут регулировать судьбу стволовых клеток. В этой связи култивирование TDSCs на выровненных нанофибрильных каркасах способствует их детерминации в сухожильные клетки, тогда как культивирование TDSCs на случайно расположенных нано-волокнах увеличивает их остеогенную дифференцировку in vitro [54]. Цитоскелетная структура TDSCs может быть ответственна за обеспечение их взаимодействия с ECM [54]. Использование соотв. субстрата или каркасов для культивирования TDSC in vitro позволяет лучше поддерживать in vivo их свойства или способствовать их дифференцировке в сухожилия при репарации сухожилий.

Mechanical loading

Т.к. сухожилия функционируют, чтобы передавать нагрузку с мышц на кости, то клетки внутри сухожилия постоянно подвергаются механической нагрузке. Недавние находки продемонстрировали, что TDSCs чувствительны к механическим нагрузкам [55-57]. Zhang and Wang [56] сообщили, что низкие циклические в одном направлении механическое растяжение при 4% ('clamp-to-clamp' engineering strain) и 0.5 Hz в течение 12 ч способствуют дифференцировке в сухожильные клетки TDSCs, засеянных в микроборозды, ориентированные вдоль оси растяжения, тогда как более сильное нятяжение в 8% и 0.5 Hz вызывали дифференцировку не в сухожилия некоторых TDSCs in vitro . Бег по бегущей дорожке в течение 1 недели тренировок при скорости 13 m/min. в течение 15 min./day, сопровождаемый 3 недельными упражнениями по 50 min./day и 5 дней в неделю вызывало удвоение скорости пролиферации TDSCs, выделенных из надколенного и Ахиллового сухожилий у мышей [57]. Мы установили, что циклические повторяющиеся растягивающие нагрузки в 4% и 8%, 0.5 Hz, в течение 4 ч способствуют выстраиванию клеток вдоль направления нагрузки и продукции BMP-2 в TDSCs [55]. Результаты этих исследований показали, что мы может модифицировать функцию сухожильных стволовых клеток in vivo, а значит и сухожилий посредством упражнений. В самом деле, чрезмерное использование выступает в качестве одного из факторов риска возникновения аномалий сухожилий, тогда как эксцентрические упражнения, как было установлено, снижают боль и улучшают функции сухожилий [58]. Контролируемые упражнения также рекомендованы для ускорения заживления сухожилий после повреждений. Дальнейшие исследования реакции TDSCs или сухожильных стволовых клеток на механические нагрузки позволят лучше понять патогенез нарушений сухожилий и разработку оптимального протокола упражнений для усиления заживления сухожилий с меньшим образование рубцовой ткани и срастаний сухожилий.

Biological factors

Судьбы сухожильных стволовых клеток могут контролироваться биологическими факторами, такими как BMPs и Wnts. TDSCs, выделенный от модельных животных, подвергнутых двойному нокауту по biglycan и fibromodulin, обнаруживают повышенную чувствительность к передаче сигналов BMP-2 [1]. Наблюдается увеличение экспрессии хондро-остеогенных BMPs и Wnt3a в клетках заживающего сухожилия, хондроцит-подобных клеток и оссифицированных отложений у модельных животных и в клинических выборках аномальных сухожилий [15, 59, 60]. Wnt3a способствует остеогенной дифференцировке TDSCs in vitro [60], тогда как BMP-2 способствует дифференцировке в не tenocyte и отложению proteoglycan TDSCs in vitro [55, 61]. Из-за мультипотентности сухожильных стволовых клеток, молекулярный механизм защиты может быть помещен, чтобы предупреждать ошибочную дифференцировку сухожильных стволовых клеток в не-tenocytes. Предыдущее исследование показало, что активированная форма белка Smad8 ингибирует BMP-2-вызываемую остеогенную дифференцировку MSCs в то же время способствует дифференцировке в сухожилия [62]. MSX2, как было установлено, действует как молекулярный механизм защиты для предупреждения оссификации фибробластов связок [63]. Функционируют и эти молекулы, чтобы регулировать судьбу сухожильных стволовых клеток, вопрос нуждается в подтверждении.

Interstitial cells

Поведение сухожильных стволовых клеток может критически регулироваться путем взаимодействия с соседними клетками в их локальном микроокружении, как путем непосредственных контактов, так и с помощью секреции растворимых ростовых факторов и цитокинов. Теноциты являются основным типом в сухожилиях и формируют трехмерную сеть из клеточных отростков по всему сухожилию [64]. Теноциты, следовательно, могут модулировать судьбу сухожильных стволовых клеток посредством непосредственных межклеточных контактов или за счет продукции растворимых медиаторов. В смешанной культуральной системе TDSC-теноциты, обнаруживается более высокая продукция коллагена в смешанной культуре с TDSCs из надколенного или Ахиллового сухожилия от мышей тренирующихся на беговой дорожке по сравнению с TDSCs, выделенными от контрольных мышей, что подтверждает возможное взаимодействие между сухожильными стволовыми клетками и теноцитами in vivo [57]. Т.к. не проводилось разделения клеток в этом исследовании смешанных культур, то остается неясным, продуцируется коллаген TDSCs, дифференцированными TDSCs или теноцитами, поэтому молекулярный механизм остается неясным. Исследования совместных культур с или без межклеточных контактов, сопровождаемые выделением клеток, смогут ответить на этот вопрос. Лучшее понимание взаимодействия между сухожильными стволовыми клетками и теноцитами in vivo может предоставить информацию по подержанию пластичности TDSCs во время культивирования in vitro и для разработки новых стратегий по репарации сухожилий.

Telocytes (TC) новый тип клеток, который идентифицирован в строме различных тканей и органов, включая сердце, скелетные мышцы и кожу [65]. Они являются клетками с небольшими клеточными телами, обычно с в 2-3 раза более длинными (вплоть до десятков/сотен µm) и тонкими (в основном меньше 0.5 µm) продолжениями, наз. telopodes [65]. Ранее они упускались из-за их тонких и извилистых продолжений, которые могут быть обнаружены только в ЭМ. Они обладают формой, отличающейся от интерстициальных фибробластов по ультраструктуре, фенотипу и функции [65]. Поскольку функция фибробластов в основном связана с продукцией белков внеклеточного матрикса, то TC способствуют межклеточным коммуникациям или за счет непосредственных контактов посредством соединительных белков или удаленно посредством внеклеточных пузырьков [65]. Благодаря свои телоподиям, TC, как было установлено, объединяют разного типа клетки для передачи сигналов на длинные расстояния, что важно для кардиального обновления [66]. Следовательно, TC, как полагают, являются нишами для стволовых клеток. TC обнаруживаются в тесной близости от кардиальных предшественников разных стадий дифференцировки [67]. После экспериментального инфаркта миокарда, TC, как было установлено, вносят вклад в соединенные тандемно резидентные стволовые клетки, чтобы повысить скорость регенерации клеток в пограничной зоне области инфаркта и окружении [68]. TC не были обнаружены в сухожилиях. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы посмотреть, могут ли быть идентифицированы TC в сухожилии и их вклад в клетки ниш сухожильных стволовых клеток и клеток.

Possible sources and roles of tendon stem cells in tendon healing and failed healing

Evidence that tendon stem cells participate in tendon healing or failed healing

Поскольку сухожильные стволовые клетки располагаются в ткани сухожилия, то логично ожидать, что сухожильные стволовые клетки играют роль в заживлении сухожилий и в неудачных заживления после повреждений. Нет исследований, которые бы непосредственно исследовали судьбу и роли сухожильных стволовых клеток после повреждений суходилий in vivo. TDSCs, выделенные из collagenase-индуцированного неудачного заживления надколенного сухожилия после повреждения у крыс, выявили пониженную tenogenic способность по сравнению с TDSCs, выделенными из здоровых сухожилий [69]. Последующий анализ показал, что TDSCs, выделенные из этой модели неудачного заживления, экспрессируют высокие уровни BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMP рецепторов и были более чувствительны к BMP-2-индуцированной активации smad по сравнению с TDSC, выделенными из здорового сухожилия, это может быть связано с вкладом в хондро-оссификацию и неспособностью заживления у этой животной модели [70]. Эти данные подтверждают, что TDSCs, скорее всего, участвуют в заживлении сухожилия или в неудачном заживлении.

Sources of TDSCs that contribute to tendon healing or failed healing

Т.к. ниши стволовых клеток динамичны, то судьба стволовых клеток и источников, вносящих вклад в TDSCs, выделенных из сухожилий in vitro, может меняться в зависимости от физиологических и патологических состояний ткани. В зависимости от стадии после повреждения сухожилия стволовые клетки из разных источников могут быть рекрутированы в поврежденное сухожилие. Следовательно, состав TDSCs it может варьировать в зависимости от стадии повреждения сухожилия in vivo. Мезенхимные клетки из соседней ткани и системного кровообращения могут вносить вклад в заживление сухожилия [71]. Предыдущее исследование показало, что мезенхимные клетки, происходящие из кровообращения и мезенхимные клетки, происходящие из сухожилия, вносят вклад в разные фазы заживления сухожилия после повреждения [72]. Используя две green fluorescent protein (GFP) химерные крысиные модели, авт. продемонстрировали, что зависимые от кровообращения мезенхимные клетки появляются на инициальной стадии повреждения сухожилия и они со временем замещаются мезенхимными клетками, происходящими из сухожилия [72]. Как только сухожилие соединяется с мышцей, то стволовые клетки и клетки предшественники скелетных мышц [73] могут быть также источником MSCs для репарации сухожилия после повреждения. Жировая ткань является богатым источником MSCs. Расположенная под коленной чашечкой жировая подушка находится ниже надколенного сухожилия, следовательно, также может быть возможным источником MSCs для репарации сухожилия, когда надколенное сухожилие повреждено [74]. По сравнению TDSCs, выделенными из здорового сухожилия, экспрессия позитивных и негативных маркеров стволовых клеток в TDSCs, изолированных из collagenase-индуцированного неудачного заживления повреждения надколенного сухожилия, остается неизменной, за исключением более низкой поверхностной экспрессии CD73 (60.6% против 98%) и CD44 (63.1% против 79.5%) [69]. Точные источники изолированных TDSCs и сухожильных стволовых клеток in vivo после повреждения сухожилия остаются неясными.

Potential functions of tendon stem cells

Т.к., MSCs обладают потенциалом мультиклональной дифференцировки, то считается, что они способствуют репарации ткани путем направленной дифференцировки в специфический тип клеток. Недавние исследования показали, что MSCs могут также способствовать заживлению путем секреции иммуномодулирующих и трофических факторов. Ряд биоактивных молекул, секретируемых с помощью MSCs, оказались способны способствовать цитопротекции, неоваскуляризации, миграции, иммунорегуляции, клеточной пролиферации, синтезу и ремоделированию ECM [23, 75, 76]. Участвуют ли сухожильные стволовые клетки в замещении поврежденного сухожилия или в становлении регенеративного микроокружения для репарации сухожилия, пока неясно. Оба могут возникать in vivo после повреждения сухожилия. Наше предыдущее исследование показало, что большинство трансплантированных аллогенных TDSCs удаляется из надколенного сухожилия, держа открытой рану 4 недели, что способствует репарации сухожилия у крыс [7]. Очень немногие, если вообще, TDSCs присутствуют в месте раны и они были позитивными в отношении proliferating cell nuclear antigen (PCNA) на 4-й неделе у животных моделей (unpublished results).

Possible strategies to track the in vivo identity of tendon stem cells

Информация о in vivo нише для сухожильных стволовых клеток д. приносить пользу мобилизации и ex vivo культивированию сухожильных стволовых клеток для репарации сухожилия. Суммируем возможные стратегии, которые могут быть пригодны для отслеживания судьбы сухожильных стволовых клеток in vivo. Маркеры MSC in vitro могут быть использованы для локализации позитивных клеток in vivo? используя иммуногистохимию или гибридизацию in situ. Этот подход, хотя и чувствителен, сегодня ограничен благодаря отсутствию специфических маркеров MSC или сухожильных стволовых клеток. Некоторые из маркеров MSC, такие как CD44, CD90, CD73, CD29 и CD105 был не специфичны для MSCs и экспрессировались также фибробластами [77, 78]. Др. подход связан с инъекцией меченных культивируемых стволовых клеток в кровообращение, чтобы проанализировать их тканевое распределение in vivo. Эта стратегия может быть менее аккуратной для изучения естественного распределения сухожильных стволовых клеток in vivo, поскольку клетки могут проникать не специфически в разные органы и специфические, приглашающие домой, сигналы могут быть необходимы для рекрутирования инъецированных стволовых клеток в сухожилия. Сухожилия обладают плохим кровоснабжением и это также может влиять на рекрутирование инъецированных клеток в здоровые сухожилия. Инъекции культивируемых стволовых клеток непосредственно в поврежденное сухожилие возможно, но невыполнимо для интактного сухожилия с плотной упаковкой и организованными коллагеновыми волокнами. Как вызванное инъекцией повреждение сухожилия может повлиять на результат, остается неясным. Dudhia et al. [79] сравнивали количества меченных BMSCs в повреждениях сухожилий лошадей с tendinopathies или desmopathies, используя введение в место повреждения, внутривенно и региональную перфузию. Они показали, что при введении в повреждение BMSCs сохраняется наивысшее количество клеток, за этим следуют региональные перфузии. Внутривенные инъекции BMSCs приводят к распределению клеток в основном в легочных полях и поэтому клетки не обнаруживаются в повреждения сухожилий [79]. Экзогенные инъекции сухожильных клеток хотя и могут быть менее аккуратными для изучения естественного распределения и функционирования сухожильных стволовых клеток и оно может не отражать или даже нарушать эндогенные активности сухожильных стволовых клеток. Использование bromodeoxyuridine (BrdU) мечения для идентификации label-retaining cells (LRC) с продолжительных клеточным циклом или асимметричными клеточными делениями с неслучайной хромосомной совместной сегрегацией теоретически пригодно для локализации сухожильных стволовых клеток in vivo, так как они поддерживаются в молчащем состоянии и сохраняют метку, в то время как дифференцированные клетки пролиферируют и теряют BrdU сигнал быстро во время периода разбавления [80]. Используя систему мечения клеток двойными аналогами нуклеозидов (IdU/CldU), Kurth et al. [45] описали идентификацию популяции молчащих, медленно делящихся, не гематопоэтических, не эндотелиальных, MSC-подобных стромальных клеток, присутствующих как в слое выстилки, так и sublining ткани синовия коленного сустава in vivo. Однако этот метод не специфичен для стволовых клеток и может метить клетки, которые прекратили пролиферацию по разным причинам (напр., дифференцировка) и поэтому могут быть предметом ложно-позитивных результатов. Способность к самообновлению стволовых клеток, как полагают, коррелирует с активностью теломеразы [81]. Базируясь на этом признаке стволовых клеток , Breault et al. [82] создали mTert-GFP-трансгенных мышей в качестве модельной системы для мечения самцовых зародышевых клеток, гематопоэтических клеток (HSCs) и клеток кишечных крипт (ISCs) in vivo. Пригодность этой системы для мечения сухожильных стволовых клеток нуждается в дальнейших исследованиях. Как и в случае BrdU мечения, этот метод также не специфически метит резидентные стволовые клетки в сухожилиях и, следовательно, относительный вклад стволовых клеток из разных источников в заживление сухожилий или неудачное заживление не может быть выявлен и нуждается в комбинированном использовании тканеспецифических маркеров для выяснения механизма. Чтобы систематически наблюдать ниши в ткани сухожилий, идеальный метод заключается в маркировании сухожильных стволовых клеток с использованием техники слежения, базирующейся на генетическом клонировании, и отслеживания их клонов. Информация, связанная с развитием ткани, обычно принимается во внимание при выборе соотв. маркеров для отслеживания клона и, следовательно, этот метод более специфичен. Используя такой подход, Feng et al. [32] использовали NG2-происходящий Cre для отслеживания перицитов. Кроме того, Lounev et al. [83] использовали MyoD-Cre, Tie2-Cre и smooth muscle myosin heavy chain-Cre (SMMHC-Cre), чтобы отслеживать возможное участие стволовых клеток скелетных мышц, эндотелиальных предшественников и сосудистых гладкомышечных клеток, соотв., при гетеротопической мышечной оссификации [83]. Speer et al. [84] использовали SM22-Cre для генетического отслеживания клеток, происходящих из гладкомышечных клеток и установили, что гладкомышечные клетки дают подобные остеохондрогенным предшественникам и хондроцитам клетки в кальцифицированных кровеносных сосудах у matrix Gla protein дефицитных (MGP-/-) мышей. Недавно, как было предположено, tenomodulin, scleraxis и thrombospondin 4 являются более специфичными биомаркерами сухожильных фибробластов [85]. Могут ли быть использованы эти связанные с сухожилиями маркеры для отслеживания клонов сухожильных клеток и, следовательно, понимания in vivo качественных особенностей и ролей сухожильных стволовых клеток, нужны дальнейшие эксперименты. Table 1 суммирует возможные стратегии, их преимущества и ограничения для отслеживания in vivo сухожильных стволовых клеток. Table 1. Possible strategies, their advantages and limitation in tendon stem cell tracking in vivo В оригинале статьи

Conclusion

In conclusion, current evidence suggests that tendon stem cells are heterogeneous and could be identified in both peritenon and tendon proper. There were likely both vascular and non-vascular sources of stem cells in tendons. Based on the current in vitro data, the fate of tendon stem cells is likely to be regulated by oxygen tension, mechanical loading, composition and topographical cues of extracellular matrix, biological factors such as BMPs and Wnts as well as tenocytes. The exact in vivo role of tendon stem cells is unknown, but they might contribute to tendon homeostasis and tendon pathologies via both direct cell differentiation and production of trophic factors. Potential strategies for understanding the in vivo niche of tendon stem cells have been discussed. Information about the in vivo identity of tendon stem cells, if known, would shed light on the design of new drugs for therapeutic manipulation of endogenous tendon stem cells for the re-establishment of a functional niche or for the ex vivo amplification and differentiation of tendon stem cells for tendon repair.

Identity of tendon stem cells – how much do we know? Pauline Po Yee LuiJournal of Cellular and Molecular Medicine Volume 17, Issue 1, pages 55–64, January 2013

Identity of tendon stem cells – how much do we know?
Pauline Po Yee Lui
Journal of Cellular and Molecular Medicine Volume 17, Issue 1, pages 55–64, January 2013