Важность системы кровообращения доказывается её ранним появлением в развитии. У позвоночных система кровообращения является первой функциональной системой органов, критической для адекватной доставки кислорода и питательных веществ для быстро развивающихся тканей, далее это обеспечивается с помощью только диффузии.

Сосудистая сеть формируется посредством трех основных клеточных процессов: васкулогенеза, ангиогенеза и артериогенеза. Васкулогенез, образование de novo кровеносных сосудов дает первые кровеносные сосуды, формирующие первичное сосудистое сплетение. Ангиогенез, рост кровеносных сосудов из уже предсуществующих кровеносных сосудов, делает возможной драматическую экспансию сосудистого сплетения, тогда как артериогенез участвует в увеличении диаметра артериальных сосудов в ответ на повышение кровотока или касательного напряжения. Посредством этих трех механизмов формируется система кровообращения и ремоделируется в сложную сосудистую систему, которая обеспечивает широкий спектр жизненных физиологических процессов, включая снабжение кислородом, доставку питательных веществ и удаление отходов, регуляцию температуры и поддержание кровяного давления. Точная координация клеточных событий делает возможным образование и модифицирование сосудистой системы, передача молекулярных сигналов с помощью многочисленных молекул, как известно, играет жизненно важную роль в активации и модуляции этих событий.

Vasculogenesis

Развитие системы кровообращения начинается вскоре после гаструляции одновременно с формированием сомитов. Процесс образования сосудов на этой ранней стадии развития является васкулогенезом, термин предложен Risau с коллегами в 1988 (Risau and Lemmon, 1988; Risau et al., 1988) и описывается как de novo формирование кровеносных сосудов путем дифференцировки и ассоциации клеток эндотелиальных предшественников. Предыдущие исследования, изучающие васкулогенез установили, что образование кровеносных сосудов происходит как внутри, так и вне эмбриона (Reagan, 1915; Sabin, 1920). Эмбриональная мезодерма, также как и внеэмбриональный желточный мешок, аллантоис и плацента были идентифицированы как источники сосудистых эндотелиальных и клеток гематопоэтических предшественников и являются местами васкулогенеза (Caprioli et al., 2001). В желточном мешке мышей клетки предшественники мигрируют, дифференцируются и ассоциируют в кластеры, наз. кровяными островками на эмбриональный день (E) 6.5-7 (Fig. 1). Внутри кровяных островков субнабор периферически расположенных клеток кровяных островков, наз. ангиобластами, подвергается дальнейшей дифференцировке в эндотелиальные клетки на ст. E8.5, тогда как внутри расположенные клетки становятся гематопоэтическими предшественниками, которые дают кровяные клетки (Fig. 1). Термин гемангиобласт был предложен для общих предшественников кровяных островковых клеток, которые в конечном итоге дают как эндотелиальные, так и гематопоэтические клетки (His, 1900). Энтодерма, как было установлено, также является критической для дифференцировки ангиобластов.

Ангиобласты - высоко подвижные клетки, впервые обнаруживаемые во внеэмбриональных тканях и затем внутри самого эмбриона в тесной близости к энтодерме. Внеэмбриональные ангиобласты развиваются бок о бок с клетками гематопоэтических предшественников, тогда как эмбриональные ангиобласты развиваются в отдельности (Pardanaud and Dieterlen-Lievre, 1993).

Ангиобласты пролиферируют, мигрируют и ассоциируют, образуя примитивные трубко-подобные сосуды. Формирование сосудов происходит благодаря объединению ангиобластов, как происходит при конструкции дорсальной аорты или миграции ангиобластов из отдаленных мест, как это наблюдается при образовании вентральной части аорты и кардинальных вен.

Развитию сосудов предшествует дифференцировка ангиобластов в эндотелиальные клетки, формирование сосудистого просвета и закладка базальной ламины (Fig. 1). В желточном мешке васкулогенез приводит к формированию капилляров в головной мезенхиме и эндокарде. На ст. 2-х сомитов внутри- и внеэмбриональная васкулатура образует анастомозы, тогда как эмбрион всё ещё способен получать кислород путем диффузии (Risau and Flamme, 1995). Сплетение затем соединяется в развивающейся сердечной трубкой ещё до начала сердцебиений. Помимо становления первичного сосудистого сплетения, васкулогенез обеспечивает васкуляризацию ряда органов, включая печень, селезенку и лёгкие (Pardanaud and Dieterlen-Lievre, 1993; Ribatti et al., 2009). Более того, роль васкулогенеза также была описана у взрослых, напр., формирование капилляров после ишемических повреждений (Asahara et al., 1997; Tongers et al., 2010).

Signaling in vasculogenesis

По сравнению с ангиогенезом, существенно меньше известно о молекулярных сигналах, регулирующих васкулогенез. Исследования васкулогенеза в ряде моделей in vivo продемонстрировали важную роль ряда ростовых факторов.

Fibroblast growth factors

Fibroblast growth factors (FGFs) участвует в раннем сосудистом развитии. У млекопитающих семейство FGF состоит из 18 паракринных или эндокринных пептидных факторов, которые обладают гомологией стержневого домена и дифференциально активируют некоторые FGF тирозин киназные рецепторы (Beenken and Mohammadi, 2009). В частности, FGF-2 участвует в индукции мезодермы и индукции ангиобластов из мезодермы (Cox and Poole, 2000).

The hedgehog family

Семейство морфогенов hedgehog, включая sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) и desert hedgehog (Dhh), , как было установлено, играет важную роль в формировании васкулатуры на разных стадиях развития. Связывание Hedgehog лигандов с их трансмембранным рецептором, Patched, вызывает конформационные изменения, которые снижают репрессию трансмембранного белка smoothened. Активация экспрессии smoothened позволяет GLI transcriptional activators (GLI-A) накапливаться и активировать

Fig. 1. Schematic of extra-embryonic vasculogenesis. (A) Endodermal cells (orange) induce mesodermal cells (aqua), initiating vasculogenesis. (B) Hemangioblasts migrate and associate. (C) Blood islands containing centrally located hematopoietic precursor cells (purple) and peripherally localized angioblasts (blue) are formed. (D) Angioblasts differentiate to endothelial cells (blue) and hematopoietic cells (red) further differentiate. (E) Lumenization occurs, tight junctions (dark blue dashes) form between endothelial cells and a basement membrane (green) is deposited along the basolateral endothelial cell surface. The association of pericytes (magenta) is correlated with the deposition of the basement membrane and marks vessel maturation.

гены мишени для hedgehog (Jenkins, 2009; Riobo et al., 2006). Из трех hedgehog молекул, Ihh обязателен для формирования соотв. кровяными островками в желточном мешке развития сосудов (Dyer et al.,2001) и образования эндотелиальных трубок в эмбрионах мышей (Vokes et al., 2004). Ihh-дефицитные мыши обнаруживают дефектный ангиогенез желточного мешка (Byrd et al., 2002), находка. которая недавно была подтверждена фармакологическим ингибированием передачи сигналов hedgehog (Nagase et al., 2006).

The VEGFs and VEGF receptors

Хорошо известно, что передача сигналов vascular endothelial growth factor (VEGF) играет существенную роль в васкулогенезе и ангиогенезе. Семейство VEGF белков состоит из ряда секретируемых гликопротеинов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, endocrine gland VEGF (EG-VEGF), VEGF-E, VEGF-F, VEGF-b and placental growth factor (PlGF). Из них, VEGF-A, первоначально идентифицированный как фактор проницаемости сосудов (Senger et al., 1990), оказался наиболее широко исследованным членом семейства VEGF, он участвует как в васкулогенезе, так и ангиогенезе. VEGF-B, как было установлено, играет центральную роль в развитии сердца (Aase et al., 2001; Bellomo et al., 2000). VEGF-C и VEGF-D способствуют развитию лимфатических сосудов (Karkkainen et al., 2003; Tammela and Alitalo, 2010; Tammela et al., 2005) и могут также вносить вклад в ангиогенез (Cao et al., 1998). EG-VEGF, по-видимому, является высоко специфической изоформой, которая действует только в эндотелиальных клетках эндокринных желез (LeCouter et al., 2001). VEGF-b, является сплайс-вариантом гена VEGF-A, он обладает анти-ангиогенной активностью (Bates et al., 2002; Woolard et al., 2004). PlGF, первоначально идентифицированный в плаценте (Maglione et al., 1991), обнаруживается на низких уровнях у эмбрионов и взрослых и изучен прежде всего при патологических условиях, при которых стимулируется ангиогенез в координации с VEGF-A (Carmeliet et al., 2001).

4основные изоформы VEGF-A возникают в результате дифференциального сплайсинга гена Vegf человека. Изоформы аминокислот 121, 165, 189 и 206 отличаются по своей способности связывать heparan sulfate proteoglycans и neuropilin. Самая крупная изоформа (VEGF 206 и VEGF 188) связывает heparan sulfate с высоким сродством и ассоциирует с внеклеточным матриксом, тогда как самая маленькая изоформа (VEGF 121) обладает низким сродством к heparan sulfate и свободно диффундирует и тем самым образует градиент в направлении прочь от источника секреции. VEGF 165, которая обладает промежуточным сродством связывания,, как было установлено, обладает самой сильной митогенной реакцией (Keyt et al., 1996).

Члены семейства VEGF взаимодействуют с тремя основными рецепторами, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR у человека и Flk-1 у мыши) и VEGFR-3 (Flt-4), все они являются тирозин киназными рецепторами и членами семейства рецепторов PDGF. VEGF рецепторы обладают внеклеточным доменом, состоящим из immunoglobulin повторов, отвечающих за связывание VEGF, и внутриклеточных tyrosine kinase доменов (Fig. 2). VEGF-A, VEGF-B и PlGF соединяются с VEGFR-1. VEGF-A, расщепленные формы VEGF-C и VEGF-D, VEGF-E и VEGF-F и VEGF-b связывают VEGFR-2, тогда как не подвергшиеся процессингу формы VEGF-C и VEGF-D соединяются с VEGFR-3 (Fig. 2). VEGF-A и его рецепторы VEGFR-1 и VEGFR-2 экспрессируются в раннем эмбриональном развитии. VEGFA экспрессируется во внеэмбриональной энтодерме и мезодерме, когда собираются кровяные островки, и во внутриэмбриональной энтодерме на ст. E8.5 (Patan, 2000). VEGFR-2 является ранним маркером клеток эндотелиальных и гематопоэтических предшественников в кровяных островках (Choi et al., 1998; Yamaguchi et al., 1993).

Генетические исследования продемонстрировали потребность в VEGF и VEGF рецепторов в васкулогенезе. Эмбрионы, лишенные VEGFR-2, погибают в раннем развитии ~ E9 из-за неспособности инициировать васкулогенез и гематопоэз (Shalaby et al., 1995). Отсутствие образования сосудов и кровяных клеток, как полагают, является результатом образования дефектных кровяных из-за нарушения клеточной миграции (Shalaby et al., 1997). Эмбрионы, лишенные VEGF, сходным образом являются эмбриональными леталями из-за тяжелых сосудистых дефектов. Делеция даже одного VEGF аллеля приводит к эмбриональной летальности на ст. E11 с дефектами в формировании дорсальной аорты и развития кровяных клеток (Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al., 1996). Эмбрионы, лишенные VEGFR-1 также являются эмбриональными леталями и обнаруживают сосудистые дефекты. В этом случае ангиобласты, ассоциированные с кровяными островками, локализовались непосредственно в центральных регионах кровяных островков вместо периферии (Fong et al., 1995), указывая на избыточный рост эндотелиальных клеток скорее, чем их ингибирование. Это привело к предположению, что VEGFR-1 может ингибировать передачу сигналов VEGF путем его секвестрации. Дефицит VEGFR-3, который экспрессируется в кровяных островах в раннем развитии сосудов, но позднее оказывается ограниченным лимфатическими сосудами, также влияет на развитие кровеносных сосудов, хотя его основная роль связана с развитием лимфатических сосудов. Эмбрионы, лишенные VEGFR-3, инициируют васкулогенез и ангиогенез, но крупные сердечно-сосудистые дефекты приводят к гибели на ст. E9.5, задолго до начала формирования лимфатических сосудов. Точная роль VEGFR-3 в формировании кровеносных сосудов неясна.

Соединение VEGF лигандов с их соотв. рецепторами вызывает гомодимеризацию или гетеродимеризацию рецепторов, это активирует активность рецепторной киназы, аутофосфорилирование рецептора и нижестоящей передачи сигналов. Активация VEGFR-2 ведет к строгому аутофосфорилированию, тогда как активация VEGF-1 приводит к слабому аутофосфорилированию и передаче сигналов. Взаимодействие VEGFs м VEGFR-2 было широко изучено и оно, по-видимому, играет центральную роль в стимуляции миграции, дифференцировки, пролиферации и жизнеспособности эндотелиальных клеток.

VEGF рецепторы обладают множественными остатками тирозина, которые были идентифицированы как места аутофосфорилирования, при этом некоторые остатки регулируют прирожденную киназную активность (Eichmann et al., 1997), а др. остатки функционируют как места присоединения сигнальных молекул (Fig. 3). Фосфорилирование по Tyr1054 и Tyr1059 необходимо для максимальной активации VEGFR-2 (Kendall et al., 1999). Tyr1175 из VEGFR-2 действует как сайт пристыковки для phospholipase Cgamma (PLC-γ), которая активирует mitogen-activated protein kinase (MAPK) , чтобы способствовать пролиферации эндотелиальных клеток (Lyttle et al., 1994; Takahashi et al., 2001). PLC-γ в свою очередь ведет к высвобождению кальция и активации путей protein kinase C (PKC). Эти пути индуцируют транскрипционные факторы NFAT и EGR-1, соотв., чтобы

Fig. 2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors and their ligands. VEGFR-1 (orange), VEGFR-2 (blue) and VEGFR-3 (green) are depicted. Ligands known to activate the receptors are displayed above each receptor. Neuropilins-1 (red) and -2 (purple), co-receptors for VEGF receptors, are also shown adjacent to the receptors with which they associate.

запустить ангиогенную реакцию (Hofer and Schweighofer, 2007; Mechtcheriakova et al., 1999; Mechtcheriakova et al., 2001). PLC-γ/PKC также активируют фосфорилирование с помощью protein kinase D (PKD) histone deacetylase 7 (HDAC7), что ведет к пролиферации и миграции эндотелиальных клеток (Wang et al., 2008). Src homology 2 and β cell (Shb), phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) адапторная молекула также присоединяется к фосфорилированному остатку Tyr1175 в VEGFR-2 (Holmqvist et al., 2004) и способствует миграции эндотелиальных клеток. PI3K активирует путь Akt/PKB, который обеспечивает жизнеспособность эндотелиальных клеток (Dayanir et al., 2001; Fujio and Walsh, 1999; Olsson et al., 2006) и проницаемость сосудов путем активации endothelial nitric oxide synthase (eNOS) (Fukumura et al., 2001). Фосфорилирование VEGFR-2 по Tyr1214 способствует миграции эндотелиальных клеток путем активации ремоделирования актинового цитоскелета, обеспечиваемое с помощью Cdc42 и p38 MAPK (Lamalice et al., 2004). VEGFR-2 Tyr951 представляет собой сайт стыковки для T-cell specific adaptor (TsAd), который ассоциирует с Src, чтобы стимулировать миграцию эндотелиальных клеток и проницаемость сосудов (Matsumoto et al., 2005). Посредством активации Rac, Src также индуцирует сосудистую проницаемость (Gavard and Gutkind, 2006). Др. молекулы используются для регуляции подвижности эндотелиальных клеток вследствие активации VEGFR-2 посредством focal adhesion kinase (FAK) и paxillin, и IQ containing GTPase activating protein (IQGAP) (Suchting et al., 2007; Taylor et al., 2002) (Fig. 3). VEGFR-1, как полагают, взаимодействует с рядом сигнальных молекул, включая phospholipase C-γ, growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) и Nck (Kowanetz and Ferrara, 2006; Olsson et al., 2006).

Fig. 3. The vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) signaling cascade and effects. The VEGFR-2 homodimer (blue) and its phosphorylated residues known to facilitate signaling are shown. Proteins that bind to VEGFR-2 are depicted (green) along with their downstream targets (purple). Phosphorylation of VEGFR-2 Tyr1054 and Tyr1059 residues are required for maximal receptor activation. Binding of TsAd to phosphorylated residue Tyr951 enhances endothelial cell migration and vascular permeability through Src activation. Phosphorylation of residue Tyr1175 recruits PLC?, which activates PKC to activate endothelial cell proliferation and migration through PKD or the MAPK pathways. Tyr1175 is also a docking site for Shb, which activates endothelial cell migration or endothelial cell survival through the PI3K and AKT/PKB pathway. Phosphorylation of Tyr1214 subsequently activates cdc42 and p38 MAPK to induce endothelial cell migration. Finally, phosphorylation of VEGFR-2 also activates FAK and paxillin and IQGAP to stimulate endothelial cell motility. Abbreviations: VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2); TsAd (T-cell specific adaptor); Tyr (tyrosine); FAK (focal adhesion kinase), IQGAP1 (IQ motif containing GTPase activating protein 1); PLC? (phospholipase C gamma); Shb (Src homology 2 and ? cells); PKC (protein kinase C); MEK (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase); MAPK (mitogen-activated protein kinase); PKD (protein kinase D); HDAC7 (histone deacetylase 7); PI3K (phophatidylinositol 3'-kinase); PKB (protein kinase B); eNOS (endothelial nitric oxide synthase).

Neuropilins

VEGFs также передают сигналы посредством neuropilins. которые действуют как ко-рецепторы для VEGF рецепторов. Neuropilins являются трансмембранными гликопротеинами с короткими цитоплазматическими доменами; пока неясно, способны ли neuropilins к независимой передаче сигналов (Gaur et al., 2009). Передача сигналов neuropilin происходит благодаря ассоциации с plexins или VEGF рецепторами. Plexins является семейством из 9 крупных трансмембранных белков, которые передают сигнал на semaphorin, связанный с neuropilins. Эндотелиальные клетки дифференциально экспрессируют neuropilins; neuropilin-1 обнаруживается в артериальном эндотелии, тогда как neuropilin-2 ограничивается венозным и лимфатическим эндотелием. VEGF-A, VEGF-B, VEGF-E и PlGF соединяются с neuropilin-1, который ассоциирует или с VEGFR-1 или VEGFR-2. Neuropilin-2 связывает VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и PlGF, затем образует комплексы с VEGFR-1, VEGFR-2 или VEGFR-3. Мутационные исследования показали участие neuropilins в васкулогенезе. Neuropilin-1 мутанты обнаруживают сосудистые дефекты (Kawasaki et al., 1999), тогда как neuropilin-2 мутанты не обнаруживают аномалий кровеносных сосудов, но обнаруживают дефектный лимфангиогенез (Chen et al., 2000; Giger et al., 2000). Однако вместе neuropilins, как полагают, играют роль в васкулогенезе, поскольку мыши, лишенные обоих neuropilins, неспособны к васкулогенезу желточного мешка и лишены первичного сосудистого сплетения (Takashima et al., 2002).

TGF-β and TGF-β receptors

Transforming growth factor-β (TGFβ) является цитокином, как известно, функционирующим во время васкулогенеза. Семейство TGFβ содержит ряд членов, включая TGF-βs (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), bone morphogenetic proteins, activins и inhibins (Rossant and Howard, 2002). Члены семейства TGF-β соединяются с двумя типами рецепторов, type I и type II. После активации рецепторов семейства Type 1, которые включают 7 членов, smads фосфорилируются, затем транслоцируются в ядро, чтобы активировать транскрипцию генов мишеней (Chen et al., 1998; Hoodless and Wrana, 1998). Пять рецепторов Type II, включая TGF-βRII, подвергаются конформационным изменениям после присоединения лиганда и активируют рецепторы type I. Эндотелиальные клетки экспрессируют TGF-βRII, serine threonine kinase рецептор, и type I рецепторы Alk1 и Alk5. Alk1 фосфорилирование активирует smad1, smad5 и smad8, тогда как Alk5 активирует smad2 и smad3, которые затем образуют комплекс с smad4, чтобы активировать транскрипцию в ядре. Эндотелиальные клетки также экспрессируют endoglin, ко-рецептор, который может изменять реакцию на передачу сигналов TGF-β (Barbara et al., 1999; Letamendia et al., 1998).

Исследования, проверяющие эффекты TGF-β на эндотелиальные клетки, дали противоречивые данные, подчеркивая сложность передачи сигналов TGF-β. In vitro исследования первоначально показали, что TGF-β ингибирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (Baird and Durkin, 1986; Frater-Schroder et al., 1986). Однако др. исследования показали митогенную роль TGF-β на эндотелиальные клетки (Iruela-Arispe and Sage, 1993, RayChaudhury and D'Amore, 1991; Sutton et al., 1991). Эти различия в действии TGF-β могут быть обусловлены различиями в дозе, поскольку низкие дозы TGF-β активируют ангиогенные факторы, тогда как высокие дозы, по-видимому, ингибируют рост эндотелиальных клеток (Hofer and Schweighofer, 2007). Противоречивые результаты наблюдались также в in vivo исследованиях, показавших как про-ангиогенную, так и анти-ангиогенную роли TGF-β (Li et al., 2001; Roberts et al., 1986). Воздействие TGF-β на эндотелиальные клетки индуцирует ряд генов, ассоциированных с внеклеточным матриксом, включая fibronectin и collagens I, IV и V (Rossant and Howard, 2002).

При целенаправленной делеции TGF-β1, половина мутантных эмбрионов погибает на ст. E9.5-E10.5 из-за дефектного васкулогенеза желточного мешка, тогда как половина живет в течение нескольких недель прежде чем уступить воспалению (Dickson et al., 1995; Goumans and Mummery, 2000; Letterio et al., 1994). Устранение TGF-βRII также приводит к эмбриональной летальности на ст. E10.5 благодаря дефектам васкулогенеза в желточном мешке и у эмбрионов (Larsson et al., 2001; Oshima et al., 1996). Наконец, делеция endoglin ведет к летальности на ст. E11.5 благодаря крупным васкулярным и ангиогенным дефектам, а также благодаря задержке роста и аномальному развитию сердца (Li et al., 1999). Делеция Alk1 или Alk5 сходным образом вызывает летальность эмбрионов из-за васкулярных дефектов, указывая, что эти TGF-β сигнальные пути не перекрываются. У человека мутации в endoglin и Alk1 приводят к hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT), сосудистому нарушению, характеризующемуся артерио-венозными нарушениями, внешней кровоточивостью и телангиэктазиями (Azuma, 2000).

Angiogenesis

Ангиогенез определяется как формирование новых сосудов путем разрастания эндотелиальных клеток предсуществующих сосудов или путем intussusceptive ангиогенеза (IA), инсерцией в просвет тканевых столбов внутри существующих капилляров, чтобы сформировать новые сосуды. Ангиогенез начинается у эмбрионов на ст. E9.5 и обеспечивает формирование большинства эмбриональных кровеносных сосудов. Ангиогенез также отвечает за васкуляризацию органов, происходящих из эктодермы-мезодермы, включая головной моз и почки.

Большинство исследований механизма ангиогенеза проводилось после того как Judah Folkman предположил, что ингибирование ангиогенеза является средством лечения опухолей (Folkman, 1971). Базируясь на ряде исследований, сегодня мы понимаем, что разрастающийся ангиогенез это серия скоординированных событий, нацеленных на эндотелиальные клетки (Karamysheva, 2008; Patan, 2000). Сосудистые разрастания осуществляются специализированными эндотелиальными "tip cells", которые чувствительные к ангиогенным стимулам (Gerhardt et al., 2003) и соединены с эндотелиальными стебельчатыми (stalk) клетками, которые участвуют в образовании трубок. Прогрессия ангиогенеза начинается с локальной деструкции базальной мембраны сосуда и диссоциации перицитов от капилляров, это сопровождается миграцией кончиковых (верхушечных) клеток в направлении ангиогенного стимула. Пролиферация и построение эндотелиальных клеток продолжается до тех пор, пока в сформированных эндотелиальными клетками трубках не образуется просвет. Ассоциация с ними перицитов и/или гладкомышечных клеток и откладка базальной мембраны обеспечивают стабилизацию сосудов.

IA, др. механизм ангиогенеза, это экспансия капиллярной сети посредством сложного процесса ремоделирования, который связан с инсерцией столбов ткани внутри существующих сосудов (Makanya et al., 2009; Patan, 2000). IA состоит из трех самостоятельных процессов, включая intussusceptive microvascular growth (IMG), intussusceptive arborization (IAR) и intussusceptive branch remodeling (IBR). IMG инициируется за счет контакта между эндотелиальными клетками противоположных стенок капилляра, которые преобразуются в структурные элементы, наз. pillar core внутри сосуда. Пери-эндотелиальные клетки, включая перициты и миофибробласты, прорастают в pillar core, после чего синтезируются коллагеновые фибриллы, которые стабилизируют pillar core. Образование базальной мембраны завершает процесс (Patan, 2000). IAR вносит вклад в экспансию сосудистого древа благодаря образованию более мелких сосудов (Djonov et al., 2000). Наконец, IBR делает возможной модуляцию структуры и количества сосудов в ответ на локальные потребности в кровоснабжении (Djonov et al., 2002).

Regulation of angiogenesis

Цель ограничения роста кровеносных сосудов опухолях привела к многочисленным исследованиям ангиогенеза и его регуляции в норме и при болезни. Как часть этой работы был идентифицирован ряд белков, которые модулируют ангиогенез, и механизмы их действия. Семейство VEGF белков и их рецепторов играет критическую роль в стимуляции ангиогенеза, как ранее это было описано для васкулогенеза. Помимо VEGFs, описан ряд дополнительных факторов, важных для собственно регуляции ангиогенеза.

Notch signaling

Передача сигналов Notch участвует в детерминации судеб множественных типов клеток. Семейство Notch рецепторов и их лиганды также контролируют разрастание эндотелиальных клеток во время эмбрионального сосудистого развития. 4 Notch рецептора (Notch 1, 2, 3 и 4) экспрессируются у млекопитающих. 5 Notch лигандов было идентифицировано, включая Jagged1, Jagged2, Delta like ligand (Dll)1, Dll3 и Dll4. В сосудистой сети Notch 1 и 4 экспрессируются в эндотелии, тогда как Notch 3 функционирует в гладкомышечных клетках. Активация Notch рецепторов приводит к протеолитическому расщеплению рецептора по двум самостоятельным сайтам. A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) первоначально расщепляет рецептор внутри его внеклеточного домена, приводя к высвобождению внеклеточного домена со связанным с ним его лигандом (Jakobsson et al., 2009). Этот комплекс способен транс-эндоцитозироваться соседними клетками, где он может влиять на передачу сигналов. Расщепление с помощью ADAM, как полагают, индуцирует конформационное изменение в рецепторе, позволяя gamma secretase вызывать второе расщепление внутри мембраны, в результате высвобождается Notch intracellular domain (NICD). NICD затем перемещается в ядро, где он взаимодействует с транскрипционным фактором C promoter binding factor 1 (CBP), чтобы активировать транскрипцию нижестоящих мишеней, включая Hes и Hey helix-loop-helix гены (Shawber et al., 2003).

Генетические исследования выявили участие сигнального пути Notch в регуляции ангиогенеза. Notch 1 нулевые мыши погибают на ст. E11 и хотя они имеют нормальное первичное сосудистое сплетение, они в конечном счете обнаруживают дегенерацию сосудов и аномальное ремоделирование сосудов (Krebs, 2000). Notch 1 и 4 двойные гомозиготные мутанты обнаруживают усиленное разрушение сосудов по сравнению с Notch 1 нулевыми гомозиготами, включая дефекты образования крупных сосудов, это указывает на роль как Notch 1, так и Notch 4 в развитии сосудов (Krebs, 2000). Постоянно активная передача сигналов Notch в эндотелиальных клетках сходным образом ведет к нарушению образования сосудов, приводящему к эмбриональной гибели на ст. E10 (Uyttendaele t al., 2001). Делеция Jagged1 приводит к гибели на ст. E10 из-за дефектов формирования сомитов, отсутствия вителлиновых сосудов и сосудистых геморрагий (Hrabe de Angelis et al., 1997; Xue et al., 1999). Dll4, который соединяется с Notch 1 и Notch 4, оба экспрессируются в эндотелиальных клетках, по-видимому, играет критическую роль в ангиогенезе. Делеция одиночной копии Dll4 приводит к эмбриональной гибели (Krebs et al., 2004).

Передача сигналов Notch и VEGF, по-видимому, интимно ассоциирована с ангиогенезом. VEGF, как было установлено, индуцирует экспрессию Dll4 и передачу сигналов Notch (Liu et al., 2003). Повышенная экспрессия Dll4 и VEGFR-2 выявлена в кончиковых клетках по сравнению с соседними стебельковыми клетками (Benedito et al., 2009). У модельных животных блокада VEGF вызывает снижение Dll4 в сосудах и ингибирует разрастание (Suchting et al., 2007) , тогда как применение VEGF индуцирует экспрессию Dll4 (Lobov et al., 2007). Передача сигналов Notch также влияет на экспрессию рецепторов VEGF, приводя к подавлению VEGFR-2, что демонстрируется снижением уровней VEGFR-2 после активации Notch в эндотелиальных клетках и у Dll4-дефицитных мышей (Suchting et al., 2007; Taylor et al., 2002). Т.о., Notch, по-видимому, действует как механизм негативной обратной связи, чтобы регулировать передачу сигналов VEGF. Такая регуляция может объяснить наблюдение, что снижение VEGFR-2 делает возможной локальную дифференцировку эндотелиальных верхушечных клеток перед инициацией разрастания с действием VEGF на верхушечные клетки, приводящим к экспрессии Dll4 и активации передачи сигналов Notch, это, в свою очередь, подавляет VEGFR-2 в соседних стебельковых клетках. Верхушечные клетки с более высокой экспрессией VEGFR-2 должны поэтому быть готовы отвечать на VEGF, тогда как стебельковые клетки с меньшим числом рецепторов д. быть менее чувствительны. Интересно, что верхушечные клетки не пролиферируют в ответ на VEGF, а скорее образуют филоподии и мигрируют в направлении градиента VEGF; вместо этого стебельковые эндотелиальные клетки растущей капиллярной веточки пролиферируют (Gerhardt et al., 2003).

Semaphorins

Semaphorins являются семейством секретируемых или связанных с мембранами гликопротеинов, которые первоначально были идентифицированы как медиаторы ведения аксонов во время нейрального развития. 4 класса semaphorins позвоночных, классы 3-7, были идентифицированы, а буквы означают индивидуальных членов этих классов. Все semaphorins обладают высоко консервативным N-терминальным sema доменом, который необходим для их функции (Capparuccia and Tamagnone, 2009).

Класс 3 semaphorins, которые соединяются с neuropilins, как было установлено, действуют как ингибиторы ангиогенеза. Класса 3 semaphorins представлены 7 растворимыми, секретируемыми гликопротеинами, обозначенными A-G. После связывания semaphorin, neuropilins комплекс с plexins инициирует внутриклеточную передачу сигналов. Класса 3 semaphorins обнаруживают дифференциальное связывание в neuropilins; Sema3A преимущественно связывает neuropilin-1, Sema3F и Sema3G соединяются с neuropilin-2, а Sema3B,Sema3C и Sema3D соединяются с обоими neuropilin-1 и 2. Sema3E, по-видимому, не вступает во взаимодействие ни с одним neuropilin, а вместо этого соединяется непосредственно с plexin D1, запуская передачу сигналов (Gu et al., 2005). Sema3A и Sema3F обладают анти-ангиогенными эффектами, включая ингибирование пролиферации, миграции и жизнеспособности эндотелиальных клеток (Bielenberg et al., 2004; Guttmann-Raviv N, 2007; Kessler et al., 2004; Miao et al., 1999) , а также ингибирование опухолевого роста и опухолевого ангиогенеза (Bielenberg et al., 2004; Kessler et al., 2004; Kigel et al., 2008). Sema3B и Sema3F, как полагают, функционируют в качестве опухолевых супрессоров благодаря своему подавлению раковых опухолей у человека (Brambilla et al., 2000; Roche et al., 1996; Tse et al., 2002; Xiang et al., 2002). Интересно, что Sema3C, как было установлено, выявляет про-ангиогенную реакцию, повышая активность integrin в эндотелиальных клетках (Banu et al., 2006).

Netrins

Netrins, сходны с semaphorins, участвуют в регуляции как ведения аксонов, так и ангиогенеза. Семейство секретируемых белков, netrins соединяются с рецепторами или deleted in colorectal cancer (DCC) или uncoordinated-5 (UNC5). рецептор UNC5 был идентифицирован в артериальном эндотелии и эндотелиальных верхушечных клетках. Мыши, лишенные функционального UNC5 погибают на ст. E12.5 из-за дефектов в ветвлении капилляров (Lu et al., 2004). В целом роль netrins в ангиогенезе противоречива, поскольку исследования демонстрируют как про-ангиогенные, так и анти-ангиогенные эффекты. Netrin-1 и netrin-4, как полагают, осуществляют проангиогенные эффекты посредством стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток (Park et al., 2004; Wilson et al., 2006), с эффектами netrin-1, обеспечиваемыми посредством nitric oxide. Напротив, др. сообщения указывают на то, что netrins ослабляют разрастание капилляров посредством взаимодействия с UNC5B рецептором (Lu et al., 2004).

Slits and roundabouts

Slits, секретируемые гликопротеины, а их roundabout (Robo) рецепторы являются др. семейством лигандов и рецепторов, которые функционируют как в нейральном развитии и наведении, так и в ангиогенезе. Из 4-х известных Robo рецепторов, Robo1 был идентифицирован в ряде клеточных типов, включая эндотелиальные клетки, тогда как Robo4 (также известен как magic Roundabout), по-видимому, экспрессируется исключительно сосудистым эндотелием (Huminiecki and Bicknell, 2000). Эффект Slit-Robo взаимодействий на ангиогенез противоречив, есть сообщения, указывающие как на про-ангиогенныеs, так и анти-ангиогенные реакции в Slit-обработанных эндотелиальных клетках. Благодаря взаимодействию с Robo1, Slit2 способствует образованию эндотелиальных трубок in vitro. Также уровни Slit2 были определены как повышенные в опухолях человека (Ahmed and Bicknell, 2009; Park et al., 2003; Wang et al., 2003). Генетические модели на мышах и рыбках данио были использованы для выяснения роли Robo4 в ангиогенезе. RNAi Robo4 у рыбок данио приводили к дефектам сосудистого разрастания и формирования паттерна (Bedell et al., 2005) , а использование растворимого Robo4 ингибировало эндотелиальную пролиферацию и миграцию in vitro и ингибировало ангиогенез in vivo на мышиной модели (Suchting et al., 2005).

Sprouty

Семейство белков sprouty, включая 4 sprouty белка (spry 1-4) и 4 sprouty-related (spred) белка, которые содержат консервативный sprouty-related domain (SPR), также регулируют ангиогенез (Cabrita and Christofori, 2008). Spry белки модулируют передачу сигналов receptor tyrosine kinase (RTK). Эти белки активируются с помощью сигнальных каскадов факторов роста; передачи сигналов VEGF и FGF приводят к фосфорилированию spry белков. После активации spry белки подвергаются транслокации в ядро, где они ингибируют путь MAPK, создавая петлю негативной обратной связи. Spry1 и Spry2, по-видимому, ослабляют FGF и VEGF-индуцированную передачу сигналов MAPK (Impagnatiello MA, 2001). Spry4, как было установлено, взаимодействует с Raf1, ингибируя VEGF-индуцированную передачу сигналов MAPK (Sasaki et al., 2003).

Vessel maturation

Стабилизация формирующихся капилляров является критической для собственно функции и целостности сосудов и включает ассоциацию пристеночных клеток (перициты и гладкомышечные клетки) с наружной поверхностью капилляров. Неполная стабилизация может приводить к повышенной проницаемости сосудов. ведущей к отекам, или в случае опухолевых сосудов, к повышению показателя метастазирования. Как и при регуляции ангиогенеза несколько ростовых факторов функционируют при созревании соудов.

Platelet derived growth factor

Platelet-derived growth factor (PDGF) является главным эффектором в обеспечении созравания стенок сосудов. Семейство PDGF состоит из 4-х разных изоформ (PDGFA, PDGFB, PDGFC и PDGFD), которые образуют гомодимеры или PDGF-AB гетеродимеры. Рецепторы для PDGFs включают PDFGRα и PDGFRβ, оба являются рецепторными тирозин киназами. PDGF-B, секретируется пролиферирующими эндотелиальными клетками, соединяется со своим рецептором, PDGFRβ, который экспрессируется локальными недифференцированными мезенхимными клетками, чтобы рекрутировать их в сосуды. Мыши, лишенные PDGFB или PDGFRβ обладают выраженным снижением количества гладкомышечных клеток и перицитов, ассоциированных с сосудами, это приводит к отеку и эмбриональной гибели (Hellstrom et al., 1999). Кроме того, уровни VEGF-A повышены у мутантных эмбрионов, сходным образом вносят вклад в дальнейшее увеличение отека (Hellstrom et al., 2001). Экспрессия PDFG, как было установлено, наивысшая в верхушечных клетках, где секреция, по-видимому, устанавливает градиент PDGF, делая возможным эффективное рекрутирование перицитов (Gerhardt et al., 2003).

The angiopoietins and Tie receptors

Передача сигналов посредством рецепторов Tie, Tie1 и Tie2, вызывает повышение стабильности сосудов. Tie1 и Tie2 являются тирозин киназными рецепторами, которые экспрессируются по всей васкулатуре. Из двух рецепторов, лучше всего изучена роль Tie2. Angiopoietins, 4 секретируемых гликопротеина, действуют как лиганды для Tie2 рецептора. Связывание angiopoietins 1 (Ang1) и 4 (Ang4) с Tie2 ведет к фосфорилированию рецептора и передаче сигналов, при этом angiogpoietins 2 (Ang2) и 3 (Ang3) индуцируют слабую активацию и, как полагают, функционируют как антагонисты рецепторов (Maisonpierre et al., 1997; Valenzuela et al., 1999).

Сигнальный каскад angiopoietin/Tie2, как было установлено, важен для рекрутирования пристеночных клеток в формируемые сосуды. Ang1 секретируется перицитами и гладкомышечными клетками и посредством их взаимодействует с Tie2 на эндотелиальных клетках, облегчая взаимодействия двух типов клеток (Sato et al., 1995; Suri et al., 1996). Напротив, продукция Ang2 эндотелием дестабилизирует взаимодействие и ассоциирует с сосудистой пролиферацией.

Эмбрионы, лишенные Tie2 погибают в раннем эмбриогенезе, между E9.5 и E10.5. Хотя первичные сосудистые сплетения у этих эмбрионов, по-видимому, не затронуты, наблюдается дефектное ремоделирование сосудов и покрытие их пристеночными клетками, что приводит к отекам и геморрагиям (Dumont et al., 1994; Sato et al., 1995; Suri et al., 1996). Это фенокопируется у эмбрионов, дефицитных по Ang1 , а также у эмбрионов с избыточной экспрессией Ang2 (Davis et al., 1996). Избыточная экспрессия Ang1 приводит к гиперваскуляризации, где формируются многочисленные небольшие стабильные сосуды.

Эффекты сигнального пути angiopoietin-Tie2 модифицируются с помощью VEGF. В присутствии VEGF Ang2 стимулирует ангиогенез, тогда как в отсутствие VEGF сосуды регрессируют (Maisonpierre et al., 1997). Хотя пристеночные клетки отсоединяются от сосудов и подвергаются апоптозу, подлежащие эндотелиальные клетки оказываются с большей способностью реагировать на VEGF, это стимулирует ангиогенез (Holash et al., 1999; Karamysheva, 2008).

Hypoxic regulation of angiogenesis

Сосудистая система начинает формироваться по ходу развития у эмбриона потребности к кровоснабжению; первичное сосудистое сплетение устанавливается, когда эмбрион ещё продолжает снабжаться кислородом посредством диффузии, демонстрируя, что организм стермится избежать нехватки кислорода, Однако, гипоксия, обычно появляющаяся при физиологических или патологических условиях, также влияет на ангиогенез. Напр., опухоли более 1 mm³ могут снабжаться кислородом исключительно с помощью диффузии, но рост за этими размерами нуждается в кровоснабжении. Показано, что гипоксия, по крайней мере, является одним из стимулов, управляющих ангиогенезом опухолей. Соответственно, молекулярные механизмы, лежащие в основе гипоксией управляемого ангиогенеза, стали предметом интенсивных исследований.

Hypoxia-inducible factor

Hypoxia-inducible factor (HIF) это транскрипционный фактор, состоящий из двух субъединиц, постоянно активной HIF-1β субъединицы и чувствительной к кислороду HIF1α субъединицы. При нормальном снабжении кислородом, HIF-1α синтезируется и деградирует, тогда как гипоксия ведет к накоплению HIF-1α. HIF-1α димеризуется с HIF-1β и связывает ДНК, чтобы активировать транскрипцию ряда генов мишеней, включая многие факторы, участвующие в регуляции ангиогенеза, таких как VEGF, PLGF, Ang1, Ang2 и PDGF (Kelly et al., 2003). При нормальном снабжении кислородом, von Hipple-Lindau tumor suppressor protein (VHL) рекрутирует комплекс, содержащий ubiquitin лигазу, на HIF-1α (Salceda and Caro, 1997). Соединение VHL с HIF-1α обеспечивается гидроксилированием остатков пролина, реакция. которая зависит от кислрода (Ivan et al., 2001; Jaakkola et al., 2001). Если кислрод в изобилии, VHL гидроксилируется, а VHL обусловленное убиквитилирование вызывает деградацию HIF-1α. В условиях гипоксии, гидроксилирование VHL подавляется и накапливается HIF-1α. HIF-1α сам по себе также является предметом зависимого от кислорода гидроксилирования (Peet and Linke, 2006). Гидроксилирование HIF-1α предупреждает его взаимодействие с транскрипционными ко-активаторами, включая p300 и CBP (Semenza, 2007).

Генетические исследования выявили потребность в HIF-1α в развитии эмбриональных сосудов. HIF-1α^-/- эмбрионы погибают в середине беременности и обнаруживают аномальную эмбриональную и желточного мешка васкулатуру (Iyer et al., 1998). Избыточная экспрессия HIF-1α вызывает васкуляризацию без увеличения сосудистой проницаемости в противовес избыточной экспрессии VEGF, которая вызывает извилистый и чрезвычайно проницаемый рост сосудов (Detmar et al., 1998; Springer et al., 1998). Это указывает на то, что HIF-1α также регулирует гены, которые участвуют в стабильности сосудов. Соотв. избыточная экспрессия HIF-1α в сетчатке вызывает существенную неоваскуяризацию и одновременно увеличивает уровни мРНК VEGF, PLGF, Ang1, Ang2 и PDGF (Kelly et al., 2003). HIF-1α также индуцирует экспрессию stromal cell derived factor-1 (SDF-1), который функционирует, чтобы мобилизовать клетки эндотелиальных предшественников в костном мозге (Ramirez-Bergeron et al., 2006).

Arterial and venous specification

Ephrins and Ephs

Спецификация артерий и вен, как полагают, происходит ещё до образования собственно кровеносных сосудов и это приписывается дифференциальной экспрессии семейства белков ephrin и их рецепторов, Ephs. Эндотелий развивающихся артерий экспрессирует ephrinB2, тогда как его рецептор, EphB4, ограничивается эндотелием развивающихся вен (Wang et al., 1998). Ephrin B2 и EphB4, по-видимому, необходимы для собственно развития сосудов, поскольку мыши, лишенные любого из этих белков, погибают на ст.E10.5 и обнаруживают дефекты в формировании паттерна сосудов как ы желточном мешке, так и внутри самого эмбриона (Gerety et al., 1999; Wang et al., 1998). Ephrins также, по-видимому, влияют на формирование артерио-венозных анастомозов путем ингибирования стимулирования с помощью VEGF и Ang1 эндотелиальных клеток (Gerety et al., 1999; Wang et al., 1998).

Др. белки. которые дифференциально экспрессируются в артериях и венах включают neuropilins и члены семейства Notch (Ribatti et al., 2009). Neuropilin-1 экспрессируется в артериальном эндотелии, а neuropilin-2 экспрессируется в венозном эндотелии во время раннего эмбрионального васкулогенеза, а также перед началом кровоснабжения (Herzog et al., 2005). Члены семейства Notch ограничены артериальной системой, включая Notch 3, DDL4 и GRIDLOCK.

Роль Notch в ремоделировании первичного сосудистого сплетения и поддержании дифференцированных артерий описана у Hirashima (2009).

Conclusions

Abnormal vessel development is central to a number of diseases such as cancer, psoriasis, rheumatoid arthritis, age-related vision loss (including diabetic retinopathy and age-related macular degeneration), ulcers, cardiovascular disease and stroke. A host of anti-angiogenic therapeutics is currently FDA-approved and used for treatment of cancers, vision loss and other diseases. In addition, numerous therapeutic angiogenesis agents, aimed at stimulating angiogenesis, are being developed for use in the clinic. It is clear that the molecular signaling that occurs in vasculogenesis and angiogenesis is both complex and diverse. Precise coordination of these signals in multiple cell types is critical for appropriate vascular development and function. The need for additional research into the signaling pathways involved in vasculogenesis and developmental angiogenesis is clear. Not only will such research further our mechanistic knowledge of vessel formation and development, but it will also have practical applications to human disease and pathological states.

Signal transduction in vasculogenesis and developmental angiogenesis SUNITA PATEL-HETT and PATRICIA A. D’AMORE Int. J. Dev. Biol. 55: 353-363 2012 doi: 10.1387/ijdb.103213sp

Signal transduction in vasculogenesis and developmental angiogenesis
SUNITA PATEL-HETT and PATRICIA A. D’AMORE
Int. J. Dev. Biol. 55: 353-363 2012 doi: 10.1387/ijdb.103213sp