Наше понимание эмбрионального развития и сравнительной генетики зависят от визуализации паттернов генной экспрессии. Поскольку гены и их продукты оперируют в трехмерной тканевой топологии, то трехмерная (3D) визуализация генных продуктов in situ является фундаментальной для исследований функции генов у эмбрионов, мутантов и экспериментально преобразованных экземпляров. Необходимость 3D картин молекулярных зондов подчеркивается в частности недавними исследованиями классической проблемы развития конечностей (Boehm et al., 2010; Fisher et al., 2011). Исследования формирования паттерна скелета конечностей (Woltering and Duboule, 2010) уже используют процесс-ориентированное моделирование (Newman et al., 2008; Zhu et al., 2010), но отсутствует высокое разрешение картирования генных продуктов, которое необходимо для решения широкомасштабных проблем, таких как приобретение качественных особенностей пальцами (Tamura et al., 2011) и детерминация паттерна конечностей (Zeller et al., 2009). Необходимы новые инструменты для 3D анализа.
Современные методы демонстрации генных продуктов в трехмерных органах или эмбрионах базируются или на реконструкции объектов из серийных срезов или на получении непосредственных картин выборок в целом. Техника секционных (Streicher et al., 2000) или episcopic (Geyer et al., 2009; Yamada et al., 2010) картин может реконструировать 3D молекулярные сигналы с гистологическим разрешением с помощью рассеченных пластин образца и затем с реконструкцией исходного объекта или из картин отдельных срезов или из картин оставшихся block face. Помимо деструкции образца, эти методы д справляться с выравниванием срезов и возможными повреждениями ткани. Среди современных недеструктивных 3D imaging методов, конфокальная микроскопия (Pawley, 2006; Wanninger, 2007) способна давать высокого разрешения 3D микроскопическую визуализацию и может использовать в большой набор флюоресцентных зондов, но она в общем-то ограничена выборками не толще чем приблизительно в 300 µm (за некоторыми специальными исключениями: MacDonald and Rubel, 2010). Более новые технологии optical projection tomography (OPT; Sharpe et al., 2002; Sharpe, 2004) нашли применение (Alanentalo et al., 2007; Moreno-Bravo et al., 2010; Welten et al., 2011) для среднего разрешения картин флюоресцентных зондов в небольших прозрачных выборках.
X-ray microtomography (microCT) стала использоваться наиболее широко для получения морфологических картин эмбрионов и мягких тканей (Nagase et al., 2008; Metscher, 2009b, 2010; Degenhardt et al., 2010), для количественного анализа развития и вариаций (Hallgrimsson et al., 2007; Parsons et al., 2008), а также для решения важных эволюционных вопросов (Rowe et al., 2011). Недавно было продемонстрировано in vivo получение молекулярных изображений с использованием спечиально сконструированных липосом для контрастирования рентгеновских лучей (Wyss et al., 2009). Имеющиеся в продаже lab-based microCT системы дают превосходные микроморфологические изображения не минерализованных биологических выборок и обладают разрешением, сравнимым с маломощной световой микроскопией гистологических препаратов (Metscher, 2009a, 2010).
Мы описываем впервые использование высокого разрешения microCT для прямого и количественного 3D наблюдения молекулярных зондов у целых эмбрионов. Поскольку метод использует обычные enzyme-conjugated вторичные антитела и использует уже доступные реагенты для получения рентгеновского контраста, он может быть использован в практически любой схеме молекулярного мечения, которая включает вторичную иммунодетекцию. Мы использовали метод получения 3D изображений распределения двух белков у эмбрионов кур, внутриклеточного (ацетилированного α-tubulin) и внеклеточного (типа II коллагена). Выборки collagen II в конечностях были проанализированы в деталях в отношении его способности предоставлять количественные данные по созреванию хряща. Встроенная калибровка по размеру изображений позволяет делать аккуратные пространственные измерения доменов генной экспрессии и реконструировать значения интенсивности на микротомографических изображениях, что делает возможным количественную оценку относительной молекулярной плотности.
DISCUSSION
Мы продемонстрировали откровенно метод получения microCT изображений молекулярных зондов для изучения развития. Ключевой ступенью для визуализации молекулярных сигналов в рентгеновских изображениях является энзимами обеспечиваемое отложение серебра в местах стандартных chromogen реакций. Это сопровождается использованием доступного в продаже kit (Nanoprobes EnzMet) и обычно используемых реагентов. Благодаря этому мы ожидали, что метод может быть использован в любой схеме молекулярной детекции, которая работает с peroxidase-конъюгироанными вторичными антителами.
Данные прямого томографического получения изображений представляют новый способ оценки молекулярных паттернов в развивающихся эмбрионах. В отличие от световых или флюоресцентных микрографов томографические изображения по своей природе позволят подсчитывать репрезентации исходных экземпляров с громадным потенциалом для количественного анализа развития. Измерения такого типа представляют значительный интерес для современного исследования конечностей, помимо др. областей и такие инструменты для 3D анализа необходимы для объяснения процесса развития в терминах физических, химических и механических свойств клеток и тканей и генных продуктов, которые управляют этими свойствами и процессами во время онтогенеза.
Паттерны, возникающие в результате иммуноокрашивания и гибридизации обычно интерпретируются как распределения бинарных сигналов (on/off) белков или мРНК или иногда как обладающие сравнительными значениями (higher/lower), или иногда в виде градиентов. MicroCT изображения предоставляют более детальные наблюдения пространственных распределений молекул среди тканей и их относительные количества представлют собой новый ценный инструмент для связи активности генов с тканями, в которых они проявляются. Превалирующий объем данных изображений, полученных с помощью световой микрофотографии от онтогенетических образцов, это снижение диапазона полноты информации в изображениях, представляющих поверхность, которые затем изображаются как as a solid-выглядящий объект. Напротив, microCT изображения сохраняют полный набор изобразительных данных и если представлены как объёмные изображения, то предают полный набор доступной сигнальной информации в изображении.
Как и в любой системе иммунодетекции, базирующейся на преципитации энзимного продукта, "enzyme metallography" является результатом фоновых отложений преципитата, в данном случае серебра. Фоновое окрашивание хорошо видно на сканах, проиллюстрированных на Figure 1, в частности на наружных поверхностях образцов и в полостях и щелях, таких как узкие пространства между конечностью и стенкой тела. Контрольные выборки (не показаны) указывают, что это в основном обусловлено не ферментами управляемыми отложения серебра скорее, чем неспецифическим связыванием антител.
Реконструированные значения интенсивности объемного элемента являются относительными измерениями на линейной шкале локальных концентраций молекул мишеней. Если скорость отложения металла постоянна и стоихометричная в отношении локальной концентрации энзима, тогда общая масса отложенного металла может быть приблизительно пропорциональной количеству энзим-конъюгирующих молекул, связанных с этим местом и поэтому также с локальной плотностью частиц антигенов. Т.о., отложенные массы серебра, измеренные с помощью реконструированных x-ray attenuation значений для каждого объемного элемента могут быть использованы для относительного линейного измерения количеств антигенного белка, присутствующего в этом voxel объеме. При соотв. калибровке возможно также измерить абсолютные массы металла, накапливающегося в тканях при использовании microCT (Hainfeld et al., 2010).
Система конечностей позвоночных, выбранная в данном исследовании иллюстрирует пригодность объемлющих 3D молекулярных изображений для анализа многошкального феномена развивающихся усложнений. Теоретическое моделирование развития конечности достигло стадии, на которой динамика основных регуляторных сетей генной активности может быть связана с ключевыми признаками формирования скелетного паттерна, реализуемого в разных таксонах позвоночных (Zhu et al., 2010). Такие in silico модели нуждаются в реальных организменных измерениях формирования молекулярного паттерна, с помощью которого модели могут быть протестированы. Трехмерные microCT изображения предоставляют такие эмпирические экземпляры для теоретических моделей. Так дебаты по качественным особенностям пальцев в конечностях позвоночных (Tamura et al., 2011; Young and Wagner, 2011), напр., перешли со сравнительной морфологической шкалы на молекулярную шкалу. Новые модели, базирующиеся на взаимоотношениях между экспрессией shh и др. молекулярными доменами со скелетогенными зачатками в почке развивающейся конечности свидетельствуют о том, что качественные характеристики трех пальцев в крыльях птиц являются I-II-III (Tamura et al., 2011) или фактически сдвинуты, приводя к новым качественным особенностям (Young and Wagner, 2011). Тогда как наша демонстрация подтверждает четко наличие зачатка 5 пальца в II-III-IV интерпретации классической эмбриологии, техника представленная здесь более подходит для получения более точных аргументов, исходя из молекулярных механизмов формирования качественных характеристик.
The challenge of calculable quantification in the field of evolutionary developmental biology (Muller, 2007; Mitteroecker, 2009; Salazar-Ciudad and Jernvall, 2010; Jamniczky and Hallgrimsson, 2011) demands comprehensive 3D imaging techniques in development. Quantitative visualization of molecules in their functional contexts is an essential step toward the ultimate goal of linking morphogenesis and organ-level processes with genome-level functions. The method presented here offers an enabling technology for realizing this central objective of EvoDevo research.
