Координация клеточных физиологических процессов или коммуникаций между клетками достигается двумя способами: прямым и опосредованным. Один из непосредственных способов заключается в образовании каналов щелевых соединений (GJ), которые непосредственно связывают цитоплазму соседних клеток, создавая ионный, метаболический и электрический синцитий из соединенных клеток (Evans and Martin, 2002). Непрямой способ, который обеспечивает высвобождение сигнальных молекул во внеклеточную среду, чтобы создавать локальную паракринную сигнальную среду, осуществляется посредством не имеющих противопоставленных полуканалов в плазматической мембране (Evans et al., 2006). Более того, эти полуканалы могут также обеспечивать проникновение сигнальных молекул, таких как Ca²⁺. Connexins (Cxs) и pannexins (Panx) являются семействами белков, образующих каналы, которые ответственны за эти внутриклеточные и межклеточные сигнальные процессы. Базирующиеся на Cx и Panx каналы обнаруживают относительно низкую избирательность проникающих веществ (D'Hondt et al., 2009; Scemes et al., 2007) и обеспечивают перенос разнообразных молекул, включая малые ионы, метаболиты, вторичные мессенджеры (Saez et al., 2003), короткие пептиды (Decrock et al., 2009) и молекулы microRNA (Brink et al., 2010; Katakowski et al., 2010; Lim et al., 2011).

Каждый Cx белок имеет 4 трансмембранных домена и обладает характерной топологией, когда внедрен в липидный бислой. N- и C-окончания полуканалов плазматической мембраны расположены в цитозоле, также как и одна из петель между вторым и третьим трансмембранным доменом (цитоплазматическая петля, CL). Две петли белка расположены вне клетки. Первая внеклеточная петля (E1-петля) располагается между первым и вторым трансмембранным доменом, тогда как вторая внеклеточная петля соединяет третий и четвертый трансмембранные домены. Будучи собранными в гексамерный комплекс, Cxs образуют полуканал, которые могут или соединяться голова-к-голове, чтобы сформировать GJ каналы между соседними клетками или могут оставаться не противопоставленными в плазматической мембране (Maeda et al., 2009; Unger et al., 1999).

Кстати, более 20 Cx изоформ было идентифицировано и каждая изоформа обладает своими собственными характеристиками проницаемости и регуляции (Rackauskas et al., 2010), предоставляя огромное количество возможностей контроля межклеточных коммуникаций в тканях и органах. Изоформа 43-kDa connexin (Cx43) является наиболее повсеместно экспрессируемой изоформой Cx (Laird, 2006; Saez et al., 2003). Помимо своей обычной роли в межклеточных коммуникациях, будучи расположенными в плазматической мембране, полуканалы могут также осуществлять функции во внутриклеточных компартментах. Cx полуканалы функционируют и в митохондриях (Boengler et al., 2009; Rottlaender et al., 2010), а Panx каналы были описаны как Ca²⁺-высвобождающие каналы в эндоплазматическом ретикулуме (D'Hondt et al., 2011; Vanden Abeele et al., 2006).

Очевидно, что активность Cx каналов в плазматической мембране, особенно полуканалов, могут тонко регулироваться, поскольку продолжительное их открытие может приводить к коллапсу электрохимического градиента поверх мембраны и к потере метаболитов (Decrock et al., 2009, 2011; Retamal et al., 2007a, 2007b; Saez et al., 2010). Разные физиологические стимулы регулируют активность Cx полуканалов и GJs. Эти стимулы включают трансмембранные и транс-соединительные потенциалы, изменения pH, изменения концентраций внеклеточного Ca²⁺, механическую чувствительность и различные посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование (Saez et al., 2010). Недавно было продемонстрировано, что Cx43 полуканалы, подобно полуканалам из 32-kDa connexin изоформы (Cx32) (De Vuyst et al., 2006), регулируются с помощью концентраций внутриклеточного Ca²⁺ ([Ca²⁺]i) двухфазным способом (see Fig. 1 for a schematic representation). Увеличение [Ca²⁺]i в физиологических пределах 100-500 nM стимулирует открытие Cx43-полуканалов, но этот эффект исчезает при подъёме [Ca²⁺]i выше 500 nM (De Vuyst et al., 2009; Ponsaerts et al., 2010). Следовательно, активность полуканала Cx43 характеризуется колоколообразной кривой реакции на увеличение [Ca²⁺]i.

Figure 1. Schematic overview of the Ca²⁺-dependent regulation of Cx43-hemichannel activity by contractility and intramolecular loop-tail interactions

Мы обсудим важность молекулярных взаимодействий петля-хвост для функциональной активности Cx43. На базе этих находок мы представим гипотезу, что система актомиозина функционирует как негативный регулятор взаимодействий петля-хвост и тем самым способна предупреждать аномальное открытие не противостоящих др. др. полуканалов в ответ на (пато)физиологические стрессы.

Activation of the actomyosin contractile system in non-muscle cells inhibits Cx43-hemichannel responses

Различные механизмы, как известно, активируют актомиозиновую сократительную систему в не мышечных клетках за счет увеличения активности myosin II-ATPase. Важным событием, которое усиливает активность myosin II-ATPase является фосфорилирование 20-kDa regulatory myosin light chain (MLC20) по Ser19 ('mono-phosphorylated Ser19 MLC'). Дополнительное фосфорилирование MLC20 по Thr18 ещё больше увеличивает ATPase активность myosin II ('di-phosphorylated Ser19/Thr18 MLC') (Umemoto et al., 1989; Vicente-Manzanares and Horwitz, 2010). Thrombin известен как мощный усилитель фосфорилирования MCL20 посредством множественных внутриклеточных сигнальных путей (Essler et al., 1998). После воздействия тромбина, активность Cx43-полуканала сильно ингибируется в bovine corneal endothelial cells (BCECs) и это ингибирование может быть устранено фармакологически с помощью MLC киназного ингибитора ML-7, Rho-associated protein kinase (ROCK) ингибитора Y-27632 и protein kinase C (PKC) ингибитора chelerythrine (D'Hondt et al., 2007). Эти фармакологические агенты блокируют внутриклеточную передачу сигналов, которые ответственны за thrombin-вызываемое MLC фосфорилирование в BCEC (Satpathy et al., 2004). Чтобы продемонстрировать контрактильную реакцию клеток, необходимую для thrombin-индуцированного ингибирования Cx43-полуканала, мы избирательно блокировали myosin II-обусловленные сокращения за счет ингибирования myosin II-ATPase активности, используя (-)-blebbistatin (Allingham et al., 2005; Ponsaerts et al., 2008). В качестве контроля использовали неактивный зеркальный изомер (enantiomer) (+)-blebbistatin.

Т.к. De Vuyst et al. (2009) установили, что высвобождение АТФ через Cx43 полуканалы, обнаруживающее колоколообразную зависимость в отношении [Ca²⁺]i и высокого уровня в цитозоле [Ca²⁺], как известно, усиливает фосфорилирование MLC и последующие контракции actomyosin, то мы предположили, что актиновый цитоскелет может быть ответственен за индуцированное высоким [Ca²⁺]i исчезновение активности Cx43-полуканалов за счет закрытия каналов. Тот факт, что (-)-blebbistatin, но не инактивный (+)-blebbistatin, преодолевает ингибирование Cx43 полуканалов при высоком уровне [Ca²⁺]i в Cx43-экспрессирующих клетках HeLa и C6 глиомных клетках указывает на то, что система актомиозина вносит вклад в этот механизм ингибирования (Fig. 1).

C-terminal tail of Cx43 hemichannels as potential link to the contractile system

В попытке выяснить механизм молекулярной связи между Cx43 полуканалом и системой актомиозина, мы исследовали возможное вовлечение белка zonula occludens-1 (ZO-1). Этот ассоциированный с плотными соединениями белок участвует в поддержании и регуляции динамики Cx43 в бляшке GJ. Хотя взаимодействие Cx43 с ZO-1 не существенно для формирования GJ (Giepmans, 2006), ZO-1 регулирует срастание Cx43-каналов в GJ, тем самым влияет на размер бляшки (Hunter et al., 2005). Более того, ZO-1, как известно, взаимодействует с актином посредством актин-связывающего домена (Fanning et al., 1998). ZO-1 взаимодействует с C-terminal (CT) концом Cx43 посредством своего PDZ-2 домена и был идентифицирован PDZ-2-связывающий домен (DDLEI382) (Fanning et al., 1998). С помощью проведения экспериментов surface plasmon resonance (SPR), мы подтвердили более ранние находки Giepmans and Moolenaar (1998), что , по крайней мере, последний остаток Cx43 (Ile382) важен для взаимодействия PDZ-2 домена в ZO-1 человека с Cx43 (Ponsaerts et al., 2010). Чтобы разрушить возможное эндогенное взаимодействие между Cx43 и ZO-1, клетки подвергали действию пептида, который содержал 10 последних аминокислот из Cx43 (Cx43CT10), конъюгированных с TAT последовательностью, чтоб гарантировать поступление в клетку (TAT-Cx43CT a.k.a. TAT-Cx43CT10). Сходный подход ранее был применен Gourdie et al. (2006), чтобы успешно разрушить эндогенное взаимодействие ZO-1 с CT концом Cx43 (Hunter et al., 2005).

Мы установили, что TAT-Cx43CT10, но не её обратная последовательность (TAT-Cx43CT10rev), может преодолевать вызванное контрактильностью ингибирование активности Cx43 полуканала (Ponsaerts et al., 2010) (Fig. 1). Используя SPR, мы далее продемонстрировали, что пептид Cx43CT10 значительно сильнее эффективен в блокировании конкурентного взаимодействия PDZ-2 домена с CT концом в Cx43 по сравнению с пептидом Cx43CT10ΔI , который лишен последнего isoleucine. Однако, т.к. TAT-Cx43CT10ΔI действительно столь же мощен как и TAT-Cx43CT10 в преодолении ингибирующего эффекта контрактильности на реаекцию Cx43 полуканалов, как и ZO-1 не обнаруживал специфической ко-иммунопреципитации с фракцией Cx43 полуканала, это происходит независимо от того, что ZO-1 является линкером, с помощью которого Cx43 полуканал ощущает сокращения. Тем не менее, наши результаты показали, что CT хвост Cx43 механистически участвует в ингибировании реакции Cx43 полуканала на усиленные контракции актомиозина.

Для дальнейшего исследования роли CT хвоста в ингибировании активности Cx43 полуканала, вызываемой контрактильностью, мы предприняли эксперименты с клетками HeLa, содержащими Cx43 полуканалы, которые лишены полностью CT хвоста (HeLa-Cx43M239). Хотя укорочение CT в Cx43 всё ещё сказывается на образовании функциональных GJ каналов, было установлено, что Cx43M239 полуканалы действительно неспособны высвобождать АТФ в противоположность полуканалам дикого типа (Fig. 1). Интересно, что эта 'нечувствительность' может быть преодолена с помощью TAT-Cx43CT10, но не с помощью её негативного контроля (TAT-Cx43CT10rev) (Ponsaerts et al., 2010). Эти результаты показывают, что взаимодействие CT10 с CT-укороченным Cx43 полуканалом важно для функциональности полуканала, по крайней мере, на уровне высвобождения АТФ.

Тот факт, что (-)-blebbistatin не восстанавливает высвобождение АТФ Cx43M239 полуканалами указывает на то, что это соединение не действует-в неизбирательной манере-непосредственно и функционально на полуканал. Неизбирательное взаимодействие (-)-blebbistatin с CT хвостом дикого типа Cx43 полуканалов не может быть исключено в этих экспериментах. Однако это кажется маловероятным, поскольку неактивный (+)-blebbistatin оптический изомер неспособен преодолевать ингибирование активности дикого типа Cx43 полуканала за счет повышенной контрактильности и, следовательно, гипотетически прямой эффект blebbistatin на полуканалы дикого типа, который восстанавливает функциональную активность в условиях ингибирования, является enantiomer специфичным и полностью зависит от ориентации одиночной гидроксигруппы (Allingham et al., 2005).

C-терминальное укорочение Cx каналов с помощью протеолитического расщепления, по-видимому, является процессом, который происходит естественным образом, как это было продемонстрировано для Cx43 (Joshi-Mukherjee et al., 2007) и Cx50 (DeRosa et al., 2006). Можно предположить, что это свойство является защитным механизмом для клеток, чтобы предупредить избыточное открытие Cx полуканалов в условиях стресса. Когда C-конец Cx43 каналов укорочен по остатку M257 (Cx43M257), не наблюдается fast-gating переходов в экспериментах на клетках, соединенных с помощью GJ. Это строго указывает на то, что CT хвост является важным для быстрой пропускной способности Vj (Revilla et al., 1999; Moreno et al., 2002) GJ каналов. Укорочение CT хвоста Cx43 также устраняет feblbabrfwbtq вызываемое разделение Cx43 GJ каналов (Morley et al., 1996).

Regulation of Cx43 channels by loop-tail interactions

Модель particle-receptor для объяснения pH пропускной способности в Cx43 GJ каналов предложена Delmar et al. (2004), поскольку добавление CT хвоста восстанавливало pH чувствительность в клетках, экспрессирующих CT-укороченный Cx43. CT хвост д. представлять собой 'ball-and-chain', а конец хвоста может формировать 'шаро'-образную структуру, которая может соединяться с 'рецептором' и тем самым вызывать закрытие GJ канала до остаточного состояния с низкой проводимостью (Delmar et al., 2004). Поскольку цитозольная петля (CL), как было установлено, взаимодействует с CT хвостом, CL или, по крайней мере, часть этой петли может функционировать как рецептор (Duffy et al., 2002; Hirst-Jensen et al., 2007). Вмешательство во внутриклеточные взаимодействия Cx43 петля-хвост, которые нарушают быструю пропускную способность Vj , оказалось возможным с помощью воздействия на цитозоль 26-mer пептида (последовательность внутриклеточной петли 2 в Cx43, L2) с помощью patch-clamp пипетки во время измерений двух клеток (Seki et al., 2004b). Этот L2 пептид, который состоит из последовательности, которая присутствует во внутриклеточной петле Cx43 (aa 119-144), удлиняет время открытого состояния GJ канала. Это указывает на то, что L2 регион функционирует как 'рецептор' и что L2 пептид может рассматриваться как конкурентоспособный ингибитор пропускной способности (Seki et al., 2004b). Два остатка внутри пептида L2 (соответствующие His126 и Ile130 в Cx43), как было установлено, важны для активности и взаимодействия (Seki et al., 2004b). Важность CL для активности GJ канала продемонстрирована тем фактом, что не выявляется электрического взаимодействия (coupling) после делеции региона 130-134 (IEIKK) или 139-143 (IEEHG), расположенных в L2 (Seki et al., 2004a). Поскольку имеет место CT-CL взаимодействие, то ясно, что могут происходить также CT-CT и CL-CL взаимодействия (Bouvier et al., 2009; Duffy et al., 2002; Hirst-Jensen et al., 2007; Shibayama et al., 2006). Весьма правдоподобно, что мультимеризация CT хвостов является важной для формирования функционального пропуска частиц, т.к. мультимеризация CLs может быть необходима для формирования функционального рецептора. Тем не менее, усиление или стабилизация этих взаимодействий после снижения pH, по-видимому, согласуется с индукцией закрытия GJ после внутриклеточной ацидификации.

Роль CT хвоста в открывании Cx43 полуканалов была предположена Kang et al. (2008) после того как они установили, что Cx43M257 полуканалы, экспрессируемые в C6-клетках, в основном закрыты и характеризуются очень низким числом быстро- и медленно-пропускающих переходов (при +80 mV). Хотя причина явной нечувствительности с укороченными CT хвостами Cx43 полуканалов остается нерешенной, эксперименты с TAT-Cx43CT10 в HeLa-Cx43M239-клетках показывают, что CT10 мишени во внутриклеточном регионе полуканалов, приводят к восстановлению их активности в полуканалах (Ponsaerts et al., 2010).

Figure 2. Proposed model for sensing contractility of the actin cytoskeleton by Cx43 hemichannels

Поскольку внутриклеточно происходящий L2 пептид разрушает эндогенные петля-хвост взаимодействия и тем самым ухудшают закрытие быстрой Vj пропускной способности базирующихся на Cx43 GJ каналов, мы полагаем, что L2 может противостоять ингибирующим эффектам на Cx43 полуканалы, оказываемым thrombin или A23187 (Ca²⁺ ionophore)-индуцированным высоким содержанием [Ca²⁺]i. Напротив, мы установили, что TAT-Cx43L2 сильно ингибирует активность Cx43 полуканалов (Ponsaerts et al., 2010). Ингибирование, обеспечиваемое с помощью TAT-Cx43L2 может быть предупреждено за счет совместного действия с TAT-Cx43CT10 зависимым от концентрации способом. Т.к. значение EC50 из TAT-Cx43CT10 (~10 µM) приближается близко к значению IC50 из TAT-Cx43L2 (~11 µM) в экспериментах по высвобождению АТФ, осуществленных на HeLa-Cx43 клетках, то непосредственное взаимодействие TAT-Cx43 CT и TAT-Cx43L2 кажется правдоподобным. SPR эксперименты показывают, что TAT-Cx43 CT может соединяться с последовательностью L2 и такое взаимодействие, как было установлено, чувствительно к pH, поскольку снижение pH с 6.8 до 5.8 увеличивает количество связываний (Ponsaerts et al., 2010). Однако эти эксперименты не исключают, что могут существовать др. места взаимодействия в этих пептидах и могут быть ответственны за их эффекты на активность Cx43 полуканалов. Итак, наши находки в экспериментах с TAT-Cx43CT10 и TAT-Cx43L2 на дикого типа и CT-укороченных Cx43 показывают. что CL-CT взаимодействия являются важными для активности Cx43 полуканалов. Результат CL-CT взаимодействий, по-видимому, совершенно отличен между базирующимися на Cx43 GJ каналами и полуканалами. Противоположные реакции запускаются одними и теми же молекулярными взаимодействиями, поэтому логично рассматривать, что при базовых условиях Cx43 GJ каналы в основном пребывают в открытом состоянии, тогда как Cx43 полуканалы в основном закрыты.

Remaining Questions

How do Cx43 hemichannels sense the contractility?

Важно знать, как Cx43 полуканал механистически затрагивается измененной контрактильностью актомиозина. Поскольку мы ещё не выяснили молекулярные промежуточные образования, которые связывают актиновый цитоскелет с полуканалами, мы можем только предполагать о механизме и ключевых игроках, ответственных за изменения в активности Cx43 полуканалов после усиления контрактильности. Прежде всего, возникает вопрос, позволяют ли имеющиеся промежуточные образования полуканалам ощущать повышенную контрактильность (Fig. 2). С теоретической точки зрения возможно, что повышенное натяжение плазматической мембраны и изменения в изгибе мембраны достаточны, чтобы вызывать изменение активности Cx43 полуканалов. Натяжение мембраны важный регулятор механочувствительных каналов, а не мышечный миозин II способен генерировать силы, которые передаются в направлении плазматической мембраны, чтобы изменить её натяжение. Чтобы исключить, что наши заключения сбиваются с толку альтерациями механочувствительности в BCEC, необходимы эксперименты, которые не используют механическую стимуляцию, такие как высвобождение АТФ, поглощение краски и электрофизиологические методы.

Альтернативно, канал в плазматической мембране может ощущать сокращения или 'непосредственным' или 'косвенным' М. Прямая связь д. использовать один или более линкерных белков, которые соединяют с актиновым цитоскелетом каналы. Кстати, некоторые Cx43-связывающие белки были идентифицированы, из них немногие (напр. ZO-1, Drebrin), как было установлено, способны взаимодействовать с цитоскелетом (Giepmans, 2006). Т.к. предстоит ещё исследовать многочисленные Cx43-связывающие белки с Cx43 с полуканалами, поэтому мы предполагаем, что Cx43 полуканалы могут косвенно ощущать усиление контрактильности. Cx43 полуканалы могут регулироваться с помощью белков, ассоциированных с плазматической мембраной или липопротеинами, которые ощущают повышенную контрактильность актомиозина, способом, сходным с моделью, представленной группой Moolenaar. Согласно этой механистической модели, Cx43 GJ каналы ингибируются с помощью комплекса, содержащего PIP2, PLCβ3 и ZO-1 (van Zeijl et al., 2007). Наконец, различные линкерные белки, которые могут отличаться зависимым от типа клеток специфическим образом, могут участвовать в трансдукции сигналов от цитоскелета к полуканалам. Следовательно, более обширные исследования определенно необходимы для выяснения, как Cx43 полуканалы испытывают влияние на молекулярном уровне со стороны контрактильности.

What could be the relevance of contractility-induced inhibition of Cx43-hemichannel activity?

В стрессовых ситуациях, таких как воспаление или повреждения клеток, контрактильная система актомиозина может быть сильно активрована с помощью G protein-coupled receptor (GPCR) агонистов (thrombin, histamine, endothelin и lysophosphatidic acid). Отложение кортикального актина в результате контрактильной реакции безусловно может влиять на активность Cx полуканалов в плазматической мембране. Поскольку инициальное высвобождение медиаторов посредством полуканалов может функционировать как сигнал 'опасности' для соседних клеток, то избыточное и продолжительное открытие этих каналов, скорее всего, будет быстро приводить к ослаблению клеточной жизнеспособности из-за потери энергетических молекул и коллапса градиентов ионов (Decrock et al., 2009). Следовательно, механизм, который предоставляет возможность самосохранения за счет крепкого закрытия или инактивации Cx-полуканалов в условиях стрессов, скорее всего, будет благоприятным для жизнеспособности клеток. Подходящий пример может быть найден в сосудистом эндотелии, где высвобождение АТФ посредством Cx43 полуканалов в эндотелиальных клетках существенно ослаблено в условиях гипоксии (Faigle et al., 2008). Поскольку др. механизмы, такие как фосфорилирование CT в Cx43 также могут участвовать, то было продемонстрировано, что эндотелиальные клетки обнаруживают значительно увеличенные фосфорилирование MLC и сокращения актомиозина, запускаемые временным рецепторным потенциалом, обеспечиваемым каноническим каналом притока Ca²⁺ во время гипоксического стресса (Hicks et al., 2010).

Блокирование активности полуканалов д. быть также важным событием в ограничении распространения воспалительных медиаторов (Decrock et al., 2009). Остается исследовать контролируются ли др. изоформы Cx-полуканалов помимо Cx43 также с помощью контрактильности. Cx32 полуканалы, аналогично Cx43 полуканалам, также ингибируются с помощью сильного увеличения [Ca²⁺]i после воздействия ионофорами (De Vuyst et al., 2006) и, следовательно, также могут ингибироваться контрактильностью. Если в целом полуканалы могут ощущать сокращения посредством своих CT хвостов, то Cx26 полуканалы, скорее всего, не являются кандидатами на эту роль из-за отсутствия существенной части цитозольного CT хвоста в Cx26. Демонстрация in vivo важности регуляции Cx43-полуканалов с помощью контрактильности остается насущной задачей.

В сердце, Cx GJs проводят электрические импульсы между кардиальными клетками, чтобы поддерживать нормальный ритм сердца. Аномальная экспрессия, ненормальная работа системы и ремоделирование (lateralisation) GJ каналов могут приводить к аритмиям (Fontes et al., 2011; Severs et al., 2008). GJ каналы располагаются в бляшках в интеркалированных дисках кардиальных миоцитов (Gourdie et al., 1990, 1991; Palatinus et al., 2011b). Эти GJ каналы формируются в результате накопления свободных полуканалов в области плазматической мембраны, которая окружает бляшку GJ, наз. 'perinexus' (Rhett and Gourdie, 2011). Автономные полуканалы, которые агрегируют в perinexus, чтобы интегрироваться в бляшку, д. тонко регулироваться при нормальных физиологических условиях (Rhett and Gourdie, 2011). Следовательно, можно предположить, что специализированный механизм может контролировать активность автономных коннексонов при физиологических условиях за счет регуляции внутримолекулярных взаимодействий. Gourdie с сотр. продемонстрировали, что ZO-1 регулирует организацию GJs (Palatinus et al., 2011a) в интеркалированных дисках и что он детерминирует скорость агрегации автономных коннексонов в GJs (Rhett et al., 2011). С помощью ингибирования взаимодействия Cx43-ZO-1 с использованием aCT-1 пептида, который содержит, по крайней мере, 9 аминокислот из Cx43, образовывались более крупные GJ бляшки и присутствовало меньше полуканалов, в результате чего снижалась активность полуканалов. Более того, этот пептид также снижал ремоделирование GJs и ингибировал склонность к возникновению аритмии у модельных[ мышей с криоповреждением левого желудочка сердца upon overdrive pacing (O'Quinn et al., 2011). Т.к. функциональный регион CT10 пептида отличается от aCT-1 пептида только одиночным, добавочным сериновым остатком, то важно подробнее охарактеризовать функциональные и механические свойства CT пептидов в разных in vitro и in vivo моделях.

Defective Cx43 hemichannels in Xenopus oocytes: Disrupted loop-tail interactions?

Cx43 полуканалы, как известно, не функциональны или, по крайней мере, трудно обнаружить их функцию с помощью электрофизиологических подходов, когда они экспрессируются в ооцитах Xenopus (Bao et al., 2004; Hicks et al., 2010; Hoang et al., 2010; White et al., 1999). Недавно это наблюдение было использовано в качестве аргумента, что Cx43 полуканалы не имеют физиологического значения (Scemes, 2011). Однако мы постулируем, что активность Cx43-полуканалов ослаблена в системе ооцита из-за нарушения взаимодействий петля-хвост. Измерения токов на целых клетках, токов полуканалов на ооцитах, экспрессирующих Cx43, выявило восстановление положительных потенциалов при использовании TAT-Cx43CT10 пептида, но не обратной последовательности (TAT-Cx43CT10rev) (Ponsaerts et al., 2010). Др. Cx изоформы, такие как Cx38, Cx46 и Cx50, как было установлено, образуют активные полуканалы в ооцитах Xenopus (Retamal et al., 2011; Ripps et al., 2004; Srinivas et al., 2005). Становится ясным, что базирующиеся на Cx43 GJ каналы являются функциональными, когда экспрессируются в парных ооцитах Xenopus (Calero et al., 1998; Hoang et al., 2010; Revilla et al., 2000), и присутствие CT хвоста не обязательно для функционального соединения (coupling) (Revilla et al., 1999). Итак, эти наблюдения указывают на то, что Cx43 полуканалы избирательно ингибируются в ооцитах лягушек. Мы полагаем, что Cx43 полуканалы в основном находятся в состоянии, неспособном к активации, которое предписано актомиозиновым цитоскелетом. Ооциты Xenopus laevis содержат двухкомпонентную цитоскелетную систему (Ryabova and Vassetzky, 1997). Кортекс ооцита состоит из наружного (Cytochalasin B чувствительного) слоя и внутреннего, пигментированного (Cytochalasin B нечувствительного) слоя. Оба слоя содержат миозин II и способны к одновременной контракции под влиянием Ca²⁺ (Ryabova and Vassetzky, 1997). Тот факт, что наружный слой, который представлен плазматической мембраной и подлежащими микрофиламентами, способен быстро формировать контрактильные актомиозиновые кольца вокруг лазером индуцированных ран (Mandato and Bement, 2001), это иллюстрирует присутствие хорошо развитого актомиозинового цитоскелета вблизи плазматической мембраны. Это коррелирует с недавним исследованием, показавшим, что более крупные клетки обладают повышенным количеством миозиновых моторов, ассоциированных с кольцами, приводя к повышенной скорости стягиваний в более крупных клетках (Calvert et al., 2011). Т.к. это не является строго доказанным для ооцитов Xenopus, то эта модель может быть пригодна и для такого типа крупных клеток. Следовательно, вполне правдоподобно, что плазматическая мембрана с включенными в неё Cx43 полуканалами постоянно ингибируется с помощью актомиозинового цитоскелета в ооцитах Xenopus.

Помимо разрушенного взаимодействия петля-хвост благодаря повышенной контрактильности роль protein kinase C (PKC), негативного регулятора Cx43 полуканалов, не может быть исключена (Bao et al., 2004). В этом отношении обработка клеток ингибиторами PKC усиливает Cx43-обусловленное поглощение краски. Этот эффект может быть воспроизведен с помощью мутантного Ser368, остатка Cx43, фосфорилируемого с помощью PKC, который обнаруживает повышенные свойства поглощения краски по сравнению с дикого типа Cx43 (Bao et al., 2004). Поскольку последовательность TAT-Cx43CT10 находится в тесной близи с сайтом фосфорилирования Cx43 с помощью РКС, мы не можем исключить, что TAT-Cx43CT10 может содержать сайт распознавания PKC, и тем самым блокировать PKC-зависимое фосфорилирование Cx43 полуканалов и усиливать проницаемость Cx43 для растворенных веществ. Однако эта гипотеза не является очень вероятной, поскольку aCT-1 пептид, который очень напоминает TAT-Cx43CT10, увеличивает PKC-зависимое фосфорилирование Cx43 по Ser368 в биохимических испытаниях и в in vivo модели криоповреждений левого желудочка (O’Quinn et al., 2011).

CONCLUSIONS

The CT tail of Cx43 fulfils a critical and dynamic role in controlling Cx43-hemichannel activity. Activation of the actomyosin contractile system by high-intracellular [Ca²⁺] negatively influences Cx43-hemichannel opening, possibly by preventing the interaction of the CT tail with the CL. It remains to be determined how the CT tail senses the contractile state of the actomyosin cytoskeleton. Nevertheless, contractility might tightly control Cx43-hemichannel opening during (patho)physiological signalling. Although we cannot exclude that strong stimuli [e.g. extracellular alkalinisation to pH 8.5 (Schalper et al., 2010) or strong depolarisation] overcome the contractility-induced inhibition of Cx43-hemichannel activity, we hypothesize that dynamic Cx43 loop–tail interactions are disrupted by enhanced contractility and that these events prevent aberrant Cx43-hemichannel opening.

The contractile system as a negative regulator of the connexin 43 hemichannel Raf Ponsaerts, Nan Wang, Bernard Himpens, Luc Leybaert, Geert Bultynck Biology of the Cell Volume 104, Issue 7, pages 367–377, July 2012

The contractile system as a negative regulator of the connexin 43 hemichannel
Raf Ponsaerts, Nan Wang, Bernard Himpens, Luc Leybaert, Geert Bultynck
Biology of the Cell Volume 104, Issue 7, pages 367–377, July 2012