The nuclear matrix

Описание нерастворимой белковой ядерной структуры до некоторой степени аналогичной цитоскелету, существует , по крайней мере, 40 лет. Однако трудности, связанные с изучением этой фракции ядра всё ещё оставляют много нерешенных вопросов о структуре и функции. Однако накоплено большое количество доказательств в пользу существования такой структуры ядра.

Субструктура ядра, обозначаемая как nuclear matrix (NM), ядерный каркас или ядерный скелет (или nucleoskeleton) зависит от техники её выявления. Имеются соотв., экстракция с помощью высоких концентраций солей (2.0 m NaCl) (Berezney & Coffey 1974), lithium 3,5-diiodosalicylate (LIS) (Mirkovitch et al. 1984) или энкапсуляция в агарозе при физиологических концентрациях солей и электрофорез (Jackson & Cook 1988). Белок обозначается как часть ядерной субструктуры, если он противостоит экстракции. Однако существует также множество вариаций этой техники (reviewed in Martelli et al. 2002), и поэтому интерпретация не всегда прямолинейна. Здесь мы используем термин NM. В зависимости от техники экстракции остаточная белковая фракция слегка варьирует в составе, но основные компоненты, выявляемые несколькими крупномасштабными скринингами, сходны (Albrethsen et al. 2009; Varma & Mishra 2011; and references therein). Сюда входят lamins, matrins, hnRNPs, др. 'структурные' белки и различные белки, участвующие в метаболизме ДНК, многие из которых представлены и охарактеризованы в базе данных NM Proteins, NMPdb (Mika & Rost 2005).

Очень ранние работы описывали пропорцию ядерных белков, как не экстрагируемую высокими концентрациями солей (reviewed in Martelli et al. 2002), однако в действительности идея NM стала реальной с electron micrographs (EM), показавших сеть волокон, остававшихся после экстракции ядер (Berezney & Coffey 1974). Противоречия, связанные с изучением NM могут быть приписаны двум ключевым причинам. Во-первых, затруднительно показать такую сеть, которая видна при EM, используя методы иммунофлюоресценции в не экстрагированных клетках. Вместо иммунофлюоресценции кандидатов NM белков обычно выявляется паттерн пятнистых точек (reviewed in Martelli et al. 2002). Одно исследование с использованием electron spectroscopic imaging (ESI) , чтобы рассмотреть не экстрагированные ядра с помощью ЕМ, с целью идентификации областей, богатых белками и нуклеиновыми кислотами. Используя срезы, фиксированные paraformaldehyde, были показаны области между хромосомами, содержащие много белков. но мало нуклеиновых кислот, что согласуется с описанием NM (Hendzel et al. 1999). Это также соответствует соображениям, что NM может существовать как множественные локальные NMs (Martelli et al. 2002), которые динамичны и способны к изменению характеристик и состава в зависимости от ядерных процессов. происходящих в данной временной и пространственной точке (Nelson et al. 1986). Поэтому мы не можем ожидать увидеть филаментозные структуры, состоящие из небольшого количества специфических белков, а вместо этого временные ассоциации между функциональными белками и 'core'. Использование нефизиологических условий, в частности экстракции высокими концентрациями солей, было раскритиковано, как потенциально вызывающее агрегацию таких ансамблей белков (Pederson 1998). С этой целью были разработаны LIS и физиологически пригодные buffer техники, которые давали очень сходные результаты.

Второй основной причиной, стало увеличение сложности и внесение противоречий в область NM, повсеместное использование систем, которые, как теперь кажется, лишены или выявляют разные качества NM, в яйцах Xenopus, линиях раковых клеток и клеток предшественников. Недавнее исследование подтвердило изменения NM когда клетки дифференцируются или трансформируются (reviewed in Zink et al. 2004; Munkley et al. 2011, and discussed in more detail below).

Мы не будем рассматривать доказательства NM, которые хорошо известны (Pederson 1998; Hancock 2000; Nickerson 2001; Martelli et al. 2002). Вместо этого мы рассмотрим его функциональное значение. NM, как полагают, является якорем для структур ДНК, местом транскрипции (Jackson & Cook 1985), репарации ДНК (Qiao et al. 2001), сплайсинга (Zeitlin et al. 1987), ремоделирования хроматина (Reyes et al. 1997) и репликации ДНК (Jackson & Cook 1986b).

Structural organization of ДНК

Чтобы уложить примерно 2 метровую ДНК в ядро млекопитающих, очевидно, что должны существовать множественные уровни организации. Крайняя упакованность ДНК от обматывания двойной спирали вокруг гистоновых октамеров, чтобы сформировать нуклеосомы, до компартментализации в хромосомные территории (reviewed in Cremer et al. 2006) сегодня воспринимается как сама спираль. Однако промежуточные уровни организации подвержены многочисленным спорам (reviewed in Bian & Belmont 2012).

Согласно одной модели нуклеосомы организованы в 30 nm волокна. Однако существование такой структуры in vivo всё ещё горячо оспаривается, поскольку доказательства исходят в основном из работ in vitro (Bian & Belmont 2012). Согласно альтернативной модели существуют фрактальные глобулы (reviewed in Fudenberg & Mirny 2012), в которых короткие регионы ДНК предположительно 'crumple' (сконденсированы) вместе, чтобы сформировать серию глобул (или доменов). Затем они далее складываются (crumpl) вместе, чтобы сформировать более крупные глобулы, это повторяется до тех пор, пока они не достигнут размера хромосомной территории. Некоторые ключевые моменты этой модели заключаются в том, что ДНК не образует узлов, как это предполагает модель equilibrium globule (случайной компакции ДНК), и что она включает все необходимые уровни компакции. В этой модели, пространственно разделенные домены должны предполагать гибкий доступ к каждому региону ДНК. Имеются данные, подтверждающие эту идею доменов внутри доменов, с помощью техники Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) и Chromosome Conformation Capture techniques (Lieberman-Aiden et al. 2009). Согласно обеим техникам, петли хроматина, как полагают, периодически прикрепляются к NM. Очень возможно, что действительное состояние хроматина представляет собой комбинацию этих предполагаемых структур высокого порядка и является высоко динамичным.

Attachment of ДНК to the nuclear matrix

Прикрепление к белковой структуре впервые наблюдалось в ЭМ в 1970s (Paulson & Laemmli 1977). Различные методы были использованы для изучения точек соединения ДНК:NM (Mirkovitch et al. 1984), включая получение изображений с помощью FISH и Maximum Fluorescence Halo Radius (MFHR) (Fig. 1) и биохимии (переваривание петель ДНК рестрикционными ферментами, DNase I или topoisomerase II). Ранние исследования продемонстрировали прикрепление ДНК к NM, что привело к идее периодических прикреплений и концепции находящихся между ними петель хроматина (Benyajati & Worcel 1976; Marsden & Laemmli 1979) (Fig. 2A). Последующие работы привели к модификации, включая петли разных размеров (Fig. 2B) и разные функции.

Figure 1. Newly synthesized ДНК (A) Left: example of Maximum Fluorescence Halo Radius image from NIH3T3 cell showing ДНК loops stained with DAPI emanating out from the nuclear matrix (NM) (MFHR method described in Buongiorno-Nardelli et al. 1982; Guillou et al. 2010). Right: newly synthesized ДНК is observed at the NM but not visible in loop ДНК. Cells were pulsed for 30 min with BrdU and visualized with ?-BrdU. Centre: merged image showing BrdU (newly synthesized ДНК) in white and ДНК in magenta.

Figure 2. Possible relationships between ДНК replication and the nuclear matrix (NM). (A) ДНК is thought to be periodically attached to the NM at S/MARs forming intervening chromatin loops. (B) Refined model illustrating variable loop sizes and complex S/MAR usage including utilized S/MARs and function-related alternative potential S/MARs. (C) Our preferred model showing attachment to the NM via nonorigin S/MARs, and recruitment of ДНК replication origins at G1/S-phase with possible impact on loop size. (D) Alternative representation of chromatin loops showing replication origin clustering within a ДНК replication factory, with no representation of NM attachments.

Прикрепления названы MARs (matrix attached region), которые устойчивы к экстракции высокими конц. солей, scaffold attached region (SARs), которые резистентны к экстракции с помощью LIS, или прикрепленные к скелету последовательности, которые резистентны к физиологическим буферам после энкапсуляции в агарозе, все они связаны с ферментативным перевариванием ДНК. Точки прикрепления, выявляемые разными методами экстракции, существенно перекрываются, но некоторые специфичны для метода. Напр., лишь приблизительно половина последовательностей , выявляемых как MARs на хромосомах 14-18 была также идентифицирована как SARs (Linnemann et al. 2009). Скорее всего, общее количество точек прикрепления в клетке представляет собой комбинацию тех, что выявляются с помощью этих технологий. Мы впервые обсудим общие свойства регионов прикрепления, для которых мы использовали сводный термин S/MAR, прежде чем прояснить некоторые различия между MARs, SARs и skeleton-attached последовательностями.

Длина ДНК, которая ассоциирует с NM в каждой точке прикрепления определяется разной между 100 и 1000 bp с индивидуальными петлями в пределах от 4 до 200 kbp (Vogelstein et al. 1980; Buongiorno-Nardelli et al. 1982; Singh et al. 1997; Bode et al. 2003). Мы подчитали средний размер петли в 70 kbp в нераковых дифференцированных клетках млекопитающих (Wilson, R.H.C., and Coverley, D., our unpublished observation), который тесно согласуется с некоторыми предыдущими расчетами в пределах 60-86 kbp (Vogelstein et al. 1980; Jackson et al. 1990). В гаплоидном геноме человека из ~3 billion bp, это д. указывать на то, что существует ~86 000 точек прикрепления в каждый момент времени на диплоидную G1 клетку. Т.к. разные S/MARs существуют в разных типах клеток и, скорее всего, в разных фазах клеточного цикла и транскрипционных программах, то общее количество потенциальных S/MARs, скорее всего, значительно больше этого (Fig. 2B). Boulikas (1995) предсказа приблизительно 100 000 потенциальных S/MARs, исходя из (i) a размеров петель в 60 kbp, (ii) подсчитанного размера генома в 3.6 billion bp и (iii) факта, что некоторые S/MARs факультативны (Boulikas 1995). ак мы увидим, инструменты предсказаний S/MARs имеют свои ограничения, но интересно отметить, что все инструменты, по-видимому, избыточно предсказывают S/MARs (Platts et al. 2006). Поскольку мы не можем сегодня различать между ложно положительными и факультативными S/MARs, излишек потенциальных S/MAR регионов позволит гибкость в использовании и просто некоторую форму выбора. В согласии с этой идеей, было показано, что последовательность, которая обладает потенциалом быть функциональным S/MAR, не всегда рекрутируется на NM (Heng et al. 2004).

Features of S/MARs

Многие из S/MARs, которые были идентифицированы, обнаруживались при исследовании определенных генов или локусов и не подвергались хромосомному или геномному исследованию. Сопоставление S/MARs, идентифицированных с помощью индивидуальных групп, приведено в базе данных S/MAR (Liebich et al. 2002a) позволило сравнить потенциальные мотивы S/MAR (Liebich et al. 2002b). Однако, помимо избыточной презентации As и Ts, авт. обнаружили мало сходных последовательностей. Вместо этого, структурные мотивы, как полагают, играют более значительную роль в детерминации потенциальных прикреплений в NM. Один из предсказательных инструментов, 'MAR finder' использует комбинации следующих структурных мотивов, чтобы предсказать S/MARs; источники репликации, TG-богатые последовательности (обычно в 3' UTRs), искривленные ДНК, с изломом ДНК, места topoisomerase II и AT-богатые последовательности (Singh et al. 1997). Др. предполагаемые характеристики включают сайты связывания транскрипционных факторов и др. регуляторные последовательности, связанные с функцией промоторов (Singh et al. 1997). Однако некоторые сообщения противоречивы и мотив обогащения может зависеть от метода, применяемого для удаления петель ДНК. Более того, предсказательные мощные инструменты, которые используют комбинацию структурных мотивов и AT-богатые ДНК, ненамного лучше, чем предсказания на базе только AT-содержания (Evans et al. 2007). Одной из причин отсутствия хорошей предсказательной модели является то, что только немногие S/MARs были идентифицированы с помощью разных методов, которые, по-видимому, идентифицируют разные популяции. Поскольку определенный мотив может оказаться общим одному набору идентифицированных S/MARs, он не может быть очень предсказательным для S/MARs в целом. Также возможно, что многие мотивы могут увеличивать вероятность региона формировать соединение с NM, причем каждый из них увеличивает вероятность лишь слегка. Следовательно, идентификация большого числа S/MARs и лучшее понимание их функции необходимо для разработки более предсказательного инструмента.

Functions of S/MARs

Несмотря на трудности идентификации и предсказания S/MARs, некоторые отличительные функции были предположены для этих NM прикреплений. Устойчивые прикрепления, которые не варьируют в зависимости от типа клеток, как полагают, выполняют структурную роль в закреплении ДНК и в поддержании ядерной архитектуры. В соответствии с этой организационной функцией, остаются территории после экстракции, чтобы выявить NM, но теряются, когда NM разрушаются с помощью RNase (Ma et al. 1999). Напротив, др. S/MARs, по-видимому, временные и факультативные в отношении своего прикрепления к NM. Некоторые варьируют в зависимости от типа клеток и, как полагают, участвуют в поддержании транскрипционной программы, а др. варьируют в зависимости от внешних сигналов и последующего изменения транскрипционной программы. Сюда входят S/MARs, ассоциированные с транскрипционными единицами, энхансерами и сайтами связывания транскрипционных факторов. Более того, S/MARs варьируют в зависимости от клеточной стадии и включают регионы потенциальных источников репликации. Мы опишем ниже доказательства, что транскрипция и репликация осуществляются на NM. Факультативные S/MARs, которые участвуют в этих процессах, скорее всего, участвуют в рекрутировании специфических регионов на NM. В согласии с этой идеей конституитивные и факультативные S/MARs, некоторые белки, которые связывают S/MARs (MARBPs), являются стержневыми компонентами NM, такими как matrins и lamins, topoisomerase II и high-mobility group белки, тогда как др. являются специфичными для типов клеток и сигналов, таких как Scaffold Attachment Factors A (SAF-A) и B (SAF-B) и SATB1 (rev. Wang et al. 2010).

Регионы прикрепления д. быть сгруппированы по характерным особенностям, а именно композиции мотива, методу экстракции и функции. Напр., некоторые исследователи предпочитают классификацию S/MARs на сл. 4 группы в зависимости: регуляторных элементов, включая источники и энхансеры (class I), элементы границ соматических клеток (class II), элементы границ гаплоидного генома, наблюдаемые в спермиях (class III), и те, чо с промежуточным сродством с NM (class IV) (Kramer & Krawetz 1996). Хотя эта схема, по-видимому, не используется широко, она эффективно классифицирует S/MARs по мотиву или структуре и по контексту в зависимости от фактора связывания.

Возможно, что классификация по мотиву или методу экстракции выявляет одни и те же группы. Напр., matrix attachment regions (MARs) могут содержать специфические мотивы и могут быть связаны со специфической функцией. Альтернативно, одно свойство может быть более важным и, используя этот пример, MARs могут соответствовать регионам с разной функцией. Опишем сообщения от двух групп, которые изучали, могут ли прикрепления, выявляемые с помощью разных методов, специфициовать функцию.

Одно исследование использовало окраску хромосом, чтобы сравнить MARs, SARs и skeleton-attached последовательности генома в лимфобластах человека (Craig et al. 1997). Клетки были экстрагированы или 25 mm LIS, 2.0 m NaCl или физиологического буфера после энкапсуляции агарозой, а фрагменты петель высвобождали, используя переваривание рестрикционными энзимами. Фрагменты петель и прикрепленных ДНК разделяли и флюоресцентно метили и затем использовали в комбинации с FISH окраской хромосом. Важно отметить, что разрешением в этом исследовании были megabase ранги и что использовали метафазные хромосомы. Несмотря на это исследование установило, что MARs слегка обогащены в регионах бедных генами и почти отсутствовали в транскрипционных промоторах и SARs также были обогащены в регионах бедных генами, тогда как прикрепляемые к скелету последовательности ассоциировали с регионами, богатыми генами и CpG островками. Авт. нашли мало изменений в SARs между митотическим и интерфазным хроматином, но существенные различия наблюдали для MARs или skeleton-attached последовательностей. В целом данные показывают, что SARs являются конституитивными и структурными. Напротив, MARs, по-видимому, варьируют, по-видимому, от фазы клеточного цикла, но не транскрипционного статуса, тогда как skeleton-attached последовательности варьируют в зависимости от фазы клеточного цикла и дополнительно, по-видимому, связаны с транскрипцией.

В др. исследованиях, MARs и SARs хромосом 14-18 клеток HeLa и первичных aortic adventitial fibroblasts (AoAF) были сравнены с использованием подхода микромассивов (microarray) с более высоким разрешением, чем подходы с получением изображений (Linnemann & Krawetz 2009b; Linnemann et al. 2009). Регионы, обогащенные во фракциях прикрепленных ДНК относительно фракций петель, были обозначены как MARs или SARs в зависимости от метода экстракции. В обоих типах клеток MARs обычно обнаруживались в межгенных и бедных генами регионах и были строго ассоциированы с молчащими генами, что хорошо согласуется с данными Craig et al. При сравнении, плотность SARs не зависела от плотности генов, но обнаруживала тенденцию к перекрывающимся генам и ассоциировала с экспрессируемыми генами. Linnemann et al. предположили, что MARs являются структурными с субнабором внутригенных MARs, осуществляющими прикрепление молчащих генов, а SARs являются факультативными и связаны с функционированием, в частности с транскрипцией. Это подтверждает, что контроль генной экспрессии достигается с помощью множественных механизмов, которые включают и MAR прикрепление и гистоновые модификации и др. эпигенетические метки (Linnemann & Krawetz 2009b).

Отсутствие геномных исследований делает определенные утверждения о подгруппах S/MARs и их функции затруднительными. Однако общим заключением из этих исследований является указание, что MARs включают структурные и молчащие точки прикрепления, SARs вообще-то важны для детерминации и поддержания клеточного типа, а SARs и/или skeleton-attached последовательности важны для экспрессии генов.

ДНК replication and the nuclear matrix

Различные линии доказательств подтверждают, что репликация ДНК осуществляется в ассоциации в NM. Источники репликации поставляются на NM, но до сих пор мало указаний к какой подгруппе они, скорее всего, принадлежат. Существует как начало синтезирования ДНК, так и структуры завершения внутри фракций NM, источники репликации ДНК, по-видимому, по-видимому, являются факультативными S/MARs, и участвует ряд ключевых белков в репликации, само собой ассоциированных с NM.

Elongation of ДНК replication

Биохимическое фракционирование ядер, чтобы локализовать синтезируемую ДНК или визуализовать после мечения короткими пульсовыми воздействиями аналогами нуклеотидов, было показано, что вновь синтезированная ДНК и промежуточные продукты репликации располагаются на NM и что важно не в петлях (Fig. 1). Более того, эксперименты по пульсовому воздействию показали, что когда наблюдается вновь синтезированная ДНК в более поздние временные точки, то оказывается, что она мигрирует с NM фракции в регионы петель (Pardoll et al. 1980; Vogelstein et al. 1980; Jackson & Cook 1986b; Nakayasu & Berezney 1989; Gerdes et al. 1994). Эта коллекция исследований показала, что ступень синтеза ДНК и предположительно поэтому также репликационные вилки располагаются на NM. В соответствии с этим клетки в S-фазе обладают как proliferating cell nuclear antigen (PCNA), так и ДНК polymerase ? во фракции ядерного скелета (Hozak et al. 1993, 1994). Более того, эта популяция polymerase ? обнаруживает активность in vitro, которая сравнима с таковой in vivo, а синтезируемая ДНК остается ассоциированной со скелетом (Jackson & Cook 1986a,b). К сходным заключениям приводит анализ препаратов NM (Nakayasu & Berezney 1989).

Termination of ДНК replication

Относительно мало известно об окончании репликации ДНК; однако имеются данные, которые подтверждают ассоциацию с NM. Во-первых, topoisomerase II располагается на NM (Berrios et al. 1985) и, по-видимому, необходима для избавления от промежуточных продуктов репликации. Более прямые доказательства получены при анализе NM связанного с ДНК, с помощью 2D электрофореза в агарозном геле, который выявляет структуры терминации в дополнение к промежуточным продуктам репликации. Эти паттерны согласуются как с терминацией в специфических точках, так и с последствиями конвергенции вилок (Little et al. 1993).

Initiation of ДНК replication

Более прямые доказательства, что инициация репликации ДНК происходит на NM, дает использование синхронизированных в поздней G1-фазе клеток, обработанных с помощью DNase I для удаления петель хроматина (Radichev et al. 2005). При инкубировании в растворимом экстракте из клеток в S-фазе (который содержит регуляторные протеин киназы, которые индуцируют инициацию) большая часть синтеза ДНК происходит на остаточном хроматине, ассоциированном с NM, тогда как контрольные инкубации только поддерживают элонгацию. Это указывает, что хроматин, прикрепленный к NM из клеток в поздней G1 фазе, может подвергаться инициации. Поскольку это обнаруживалось локально внутри характерных фокусов, так и зависело от активности протеин киназ, то эти данные подтверждают идею, что инициальная ступень репликации ДНК происходит в хроматине, который защищен ассоциацией со структурой, резистентной к нуклеазам.

Интересно, что при тех же самых условиях, истощенные по хроматину G1 ядра не подвергаются зависимой от киназ инициации. Это может быть обусловлено неполной сборкой всех необходимых факторов комплекса пре-инициации (pre-IC) или из-за того, что источники не расположены на NM во время ранней G1-фазы. Данные, приведенные ниже и в самом деле подтверждают, что источники рекрутируются на NM только во время поздней G1. Однако мы не можем предположить, что все источники поставляются на NM вместе, т.к. это может происходить сочетанно с их активацией.

Origins of replication as S/MARs

В клетках человека имеется между 30 000 и 50 000 источников репликации, активируемых на клеточный цикл упорядоченным в пространстве и времени образом. Источники репликации у Saccharomyces cerevisiae определены с помощью ДНК последовательности, autonomous replication sequence (ARS). Однако сходные короткие последовательности не специфицируют источники репликации у высших эукариот. Вместо этого, структурная информация и эпигенетические метки, которые могут стабильно наследоваться дочерними клетками, играют роль в спецификации. Они включают статус промотора, метилирование CpG, позиционирование нуклеосом, сайтов, чувствительных к DNase I, ДНК топологию и архитектуру петель хроматина (reviewed in Mechali 2010). Напр., существует высокая вероятность возникновения инициации непосредственно перед или после становления сайтов старта транскрипции, с или без регионов, богатых CpG (Cayrou et al. 2011). Даже у S. cerevisiae ARS, как полагают, необходимы, но недостаточны, чтобы специфицировать источник, т.к. контекстуальные свойства , как известно, играют роль (Nieduszynski et al. 2006). Очевидно, что слабая зависимость от первичной последовательности затрудняет предсказание источников репликации у высших эукариот, хотя S/MARs были идентифицированы вблизи источников репликации для горстки генов образцов (reviewed in Cayrou et al. 2010).

Ранние эксперименты подтвердили, что источники в клетках млекопитающих преимущественно ассоциировали с NM (Lagarkova et al. 1998; and references therein). Более того, сходство в размере между единицами репликации и петлями хроматина, описанное в 1980s (Buongiorno-Nardelli et al. 1982), подтверждает, что они могут быть одними и теми же, так что все точки прикрепления являются источниками репликации. Очевидным подтверждением этого заключения является то, что регионы ДНК, меченные на ранней S-фазе с помощью инкорпорации аналогов нуклеотидов, обнаруживаются в фракциях NM.

Более недавние доказательства, однако, указывают на то, что поставка источников репликации на NM происходит лишь временно в поздней G1 и S-фазе. Закрепление на NM и скелете ядра было изучено для хорошо исследованного источника репликации, oriB, в локусе dihydrofolate reductase (DFHR) в клетках Chinese Hamster Ovary (CHO) (Ortega & DePamphilis 1998; Djeliova et al. 2001a,b). В одном исследовании ДНК из клеток CHO была подразделена на петли и к NM прикрепленные фракции (Djeliova et al. 2001a) и затем выделяли образцы с oriB последовательностью или с синтезируемой ДНК из ранней S-фазы (общая фракция источников). Не обнаружено обогащения источниками, или oriB или коллективной фракции источников в NM с прикрепленной ДНК из асинхронных клеток (Djeliova et al. 2001a). Однако, oriB был обогащен в ДНК, прикрепленной к NM (Djeliova et al. 2001b) или в ДНК, прикрепленной к скелету ядра (Ortega & DePamphilis 1998), из клеток в поздней G1 фазе (но не ранее G1), а потеря из этой фракции наблюдается, когда клетки проходят S-фазу (Djeliova et al. 2001b). В противоположность этим ранним источникам репликации, поздние источники репликации из гена ?-globin были исследованы в клетках HeLa, в которых NM ассоциация сохраняется в ходе S-фазы (Djeliova et al. 2001b). Источники из др. генов образцов также были описаны, как временно ассоциированные с NM (reviewed in Ottaviani et al. 2008). Итак, эти исследования показали, что источники репликации обладают потенциалом располагаться вблизи NM, но их ассоциация не является постоянной, они рекрутируются во время поздней G1 (Fig. 2C) и теряются во время S-фазы.

Prereplication complex components

Потенциальные источники репликации ДНК, маркированные с помощью origin recognition complex (ORC1-6), затем лицензированные с помощью рекрутирования покоящихся prereplication complex components (pre-RC), включая cell division cycle 6 (CDC6), chromatin licensing and DNA replication factor 1 (CDT1) и mini-chromosome maintenance complex (MCM2-7), детально рассмотрены в др.работах (Takisawa et al. 2000; Bell & Dutta 2002). Дополнительные белки ассоциируют с pre-RC, чтобы сформировать pre-IC, который рекрутирует сам аппарат репликации ДНК (RC) (summarized in Boos et al. 2012). Нам не известны какие-либо опубликованные исследования компонентов pre-IC в связи с NM, но некоторые находки описаны для компонентов pre-RC и RC.

В соотв. с их ролью в регуляции ограниченных во времени событий, pre-RC белки тонко контролируют временную экспрессию и деградацию, а также ограниченную субъядерную локализацию. К сожалению, многие исследователи ограничивают свой анализ, не включая ступень переваривания нуклеазами в протоколах клеточной экстракции, это делает возможным только общее заключение об ассоциациях с хроматином и/или с NM. Более того, в контексте клеточного цикла рекрутирование потенциального NM означает, что выявляемая фракция, может быть небольшой, а её рекрутирование на NM может быть фактически специфичным для типа клеток, делая общую картину трудной для интерпретации. Важным заключением является то, что pre-RCs устанавливаются в потенциальных источниках (источниках лицензирования) во время поздней телофазы в митотическом цикле клетки (Dimitrova et al. 2002), но теряются, когда клетки становятся пассивными (Madine et al. 2000; Tatsumi et al. 2003; Cook et al. 2004), требуя возобновления их синтеза и рекрутирования после повторного вступления в клеточный цикл. Следовательно, время образования pre-RC и их рекрутирование на NM, скорее всего, различны для G1 после выхода из состояния покоя по сравнению с G1-фазой в митотической клеточном цикле. Однако накапливаются сообщения о закреплении на NM компонентов pre-RC , подтверждая идею, что некоторые основные компоненты оказываются прикрепленными к NM, возможно в определенных комбинациях и только приблизительно во время инициации репликации ДНК.

Наиболее широко применяется метод определения рекрутирования на NM белков pre-RC с использованием цитоскелетного буфера (10 mm Pipes pH 6.8, 100 mm NaCl, 300 mm sucrose, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT) и фракционирования с помощью центрифугирования (Ainscough et al. 2007). Растворимые и нерастворимые белки обнаруживаются после обработки 0.1% Triton X-100, а связанные с хроматином белки высвобождаются с помощью обработки 0.5 m или 2.0 m NaCl или последующей обработки с помощью DNase I. NM связываемые белки определяются как белки, которые не высвобождаются при любой из этих обработок. Этот метод применим к клеточным популяциям, к western blot анализу и также сочетаем с получением изображений на базе иммунофлюоресценции. Дальнейшее различие между этими белками может быть сделано на белки, которые высвобождаются из нативных клеток, но остаются в клетках, обработанных белковыми cross-linker, такими как DTSP. С хроматином связанные белки, такие как гистоны, не сохраняются во фракции, резистентной к DNase I в присутствии cross-linker, но ассоциированные с NM белки делают это, демонстрируя непосредственное взаимодействие с компонентом NM (Fujita et al. 2002).

Origin recognition complex

Данные обнаруживают стабильные уровни субъединиц ORC 2-5 в ходе митотического клеточного цикла (Madine et al. 2000; Fujita et al. 2002; Ohta et al. 2003; Tatsumi et al. 2003; McNairn et al. 2005), а в одном сообщении предполагается, что это также верно и для ORC1 (McNairn et al. 2005). Однако большинство сообщений обнаруживает, что ORC1 достигает пика в G1 фазе с последующим протеолизом во время S-фазы и митоза (Tatsumi et al. 2003). Этот 'ORC cycle' тщательно рассмотрен в др. работе (DePamphilis 2003).

Некоторые исследования выявили взаимоотношение между субъединицами ORC и NM. ORC1 был выявлен во фракции NM из асинхронных популяций HeLa, BJAB, и BC3 клеток (Kreitz et al. 2001; Fujita et al. 2002; Ohta et al. 2003; Tatsumi et al. 2003; Ohsaki et al. 2009) и в клетках Drosophila melanogaster (Varma & Mishra 2011). Некоторые исследователи описали временное устранение этой ассоциации с NM в фазах клеточного цикла, которые выявили, что ORC1 обогащен во фракции NM в G1, BJAB и BC3 клеток, и G1 или из поздней фазы G1 в клетках HeLa (Kreitz et al. 2001; Fujita et al. 2002; Ohta et al. 2003; Tatsumi et al. 2003; Ohsaki et al. 2009). Это подтверждает, что когда ORC1 экспрессируется, то он оказывается связанным с NM. Однако следует иметь в виду, что закрепление на NM ORC1 может зависеть от типа клеток, т.к. в одном из сообщений было показано, что ORC1 чувствителен к экстракции с помощью DNase I в пролиферирующих NIH3T3 клетках (Madine et al. 2000).

Др. субъединицы ORC, как было установлено, находятся в фракциях NM, особенно ORC2-5 в асинхронных HeLa клетках (Kreitz et al. 2001; Fujita et al. 2002; Ohta et al. 2003) и ORCs 2, 4, 5 и 6 в клетках Drosophila melanogaster (Varma & Mishra 2011), хотя опять же это может быть специфичным для типа клеток, т.к. мало ORC2 оказалось связано с NM в клетках Raji (Mendez & Stillman 2000).

Когда предпринимается временное разрешение, то ORC2-5 оказываются обогащенными в NM фракции G1 (Kreitz et al. 2001) или в поздней G1 в клетках HeLa (Ohta et al. 2003). В обоих случаях это были в одно и тоже время как и в случае ORC1 как экспрессия, так и связь с NM. Более того, исследования на клетках HeLa показали, что когда ORC1 истощается с помощью RNAi, ORC2 не обогащен более во фракции NM (Ohta et al. 2003). Следовательно, NM связывание ORC может зависеть от ORC1.

Cell division cycle 6

Большинство исследований по субъядерной локализации белка CDC6 выявило пропорцию, в которой он присоединяется к NM. Это было отмечено в асинхронных HeLa клетках , BJAB, BC3 и HEK293 клетка и до некоторой степени оказывалось истощенным в отсутствие ORC1 в FT210 клетках (Fujita 1999; Fujita et al. 2002; Ohta et al. 2003; Ohsaki et al. 2009). Однако мало CDC6 было обнаружено связанным с NM в NIH3T3 клетках (Madine et al. 2000) или Raji клетках (Mendez & Stillman 2000). Где были исследованы фазы клеточного цикла, CDC6 присутствовал во фракции NM во время G1 и ранней S-фазы, но не в G2/M клетках (Fujita et al. 1999; Ohsaki et al. 2009). Следовательно, ясно, что независимые группы, используя разные методы и клеточные линии, показали, что ORC и CDC6 , по крайней мере, временно прикреплены к NM.

Chromatin licensing and ДНК replication factor 1

Как и CDC6, CDT1 важен для функциональной сборки комплекса MCM helicase и лицензирования источника репликации (Cook et al. 2004). Немногие исследователи выявили прикрепление к NM, но в одном сообщении описано восстановление CDT1 в NM фракции для BJAB, BC3 и HEK293 клеток; это происходит специфически в G1 фазе, но не в S или G2/M фазах (Ohsaki et al. 2009). Это подтверждает, что CDT1 может поставляться на NM, но имеется недостаточно доступной информации для обобщенного заключения.

Mini chromosome maintenance complex

Гетерогексамерный комплекс MCM, как полагают, чувствителен к helicase для расплетания ДНК во время репликации (Takisawa et al. 2000), но его взаимоотношение с NM неясно, как и для др. компонентов pre-RC. Большинство MCM3 и MCM2 не связано с NM в асинхронных клетках HeLa (Todorov et al. 1995; Fujita et al. 1997) , сходные результаты для MCM2, MCM3 и MCM5/7 в REF52 клетках (Cook et al. 2002), MCM3 в Raji клетках (Mendez & Stillman 2000) и MCM5 в NIH3T3 клетках (Stoeber et al. 1998). Однако, Burkhart et al. (1995) сообщили о небольшой, но достоверной фракции MCM3 в клетках HeLa, которая не высвобождается с помощью nuclease или экстракции высокими уровнями солей. Имеется несколько сообщений, идентифицировавших MCM4, MCM2, MCM3 и MCM7 в NM при протеомном скрининге клеточных линий человека и Drosophila melanogaster (Gerner et al. 2002; Mitulovic et al. 2004; Varma & Mishra 2011). Хотя большинство из MCM комплексов не связано, по-видимому, с NM , но возможно, что небольшое количество MCM белка в препаратах NM отражает слабую и временную ассоциацию, которую легко не заметить в массе препаратов от асинхронных клеток. Некоторые детали подтверждают идею, что присоединение к NM может быть важным для функции MCM, напр., в исследовании истощения ORC1 или CDC6, в которых иммобилизация MCM (на хроматине или NM) предотвращена (Ohta et al. 2003). Сходным образом, иммобилизация ORC2-5 комплексов на хроматине недостаточна для загрузки MCM2 в отсутствие ORC1 (Ohta et al. 2003). Т.к. ORC1, по-видимому, рекрутирует остальную часть комплекса ORC на NM, то это начинает подтверждать, что загрузка MCM2 осуществляется в эту фракцию.

Coordinators and regulators

Немногие белки, участвующие в регуляции инициации репликации ДНК и прогрессии клеточного цикла, были изучены в контексте NM, включая cyclin E (Munkley et al. 2011), Rb (Mancini et al. 1994) и CIZ1 (Ainscough et al. 2007).

Наше исследование при попытке сравнить рекрутирование на NM на разных стадиях развития выявило cyclin E (Munkley et al. 2011). Фактически прикрепление к NM cyclin E, является ключевым регулятором инициации репликации ДНК, может служить примером исследования, которое определенным способом объясняет различия в сообщениях об прикреплении к NM др. белков репликации. Мы показали, что определенная пропорция cyclin E связана с NM в дифференцированных, нераковых первичных и упрочившихся клеточных линиях. Однако во всех, кроме одной линии раковых клеток не обнаруживается cyclin E во фракции NM (Munkley et al. 2011). Сходные различия наблюдались между дифференцированными клетками и недифференцированными клетками у мышей, человека и Xenopus, так что во всех случаях cyclin E легко экстрагируется из клеток предшественников, но устойчив к экстракции в производных дифференцированных клетках. Это подтверждает, что cyclin E рекрутируется на NM когда клетки дифференцируются и что раковые клетки или происходят из клеток, которые не рекрутируют cyclin E или клеток. в которых cyclin E высвобождается из NM вследствие одного из событий, которые ведут к трансформации. Фактически, неспособность рекрутировать cyclin E (и тем самым воздействовать на инициацию) на NM в недифференцированных и раковых клетках может быть одним из факторов, которые способствуют пластичности в ответ на внешние или внутренние сигналы.

В целом работы, приведенные здесь, подтверждают, что все три фазы репликации ДНК могут осуществляться в ассоциации с NM. Однако это может быть неверным для всех типов клеток, это делает выбор экспериментальной системы критическим при планировании будущих работ. По разным практическим причинам большинство анализов репликации ДНК предпринимается на яйцах Xenopus или линиях раковых клеток, таких как HeLa, иногда приводя к заключению, что иммобилизация на NM может быть не важной для репликации ДНК. Мы полагаем, что описываемые различия в ядерной организации в терминах прикрепления белков и петель между эмбриональными системами и линиями раковых клеток, с одной стороны, и нераковыми, дифференцированными клетками, с др. стороны, открывают четкий путь для продвижения вперед.

Models

Мы рассматриваем модели, которые пытаются объяснить, как репликация ДНК может быть организована относительно NM. Матричная ДНК и энзимы репликации ДНК д. перемещаться относительно др. др. во время синтеза. Всё ещё принято рассматривать описания, которые показывают аппарат репликации ДНК как единицу перемещающуюся вдоль нити ДНК. Однако принимая во внимание доказательства (ниже) приходим к предположению, что аппарат репликации ДНК статичен и вместо этого ДНК перемещается через это фиксированное место (Pardoll et al. 1980).

Replication factories

Фокусы репликации или 'фактории' могут быть визуализованы с помощью иммуно-детекции энзимов репликации или вследствие инкорпорации аналогов нуклеотидов с синтезируемую ДНК. Они, как полагают, являются макромолекулярными ансамблями, заполненными энзимами, которые реплицируют ДНК, образуя несколько сотен эффективных факторий, представляющих кластеры источников (origins) и которые активируются в одно и то же время. Количество источников, как полагают, очень гетерогенно, но в среднем 5-6 на факторию (Berezney et al. 2000; Frouin et al. 2003; and references therein). Имеются некоторые причины думать, что образование кластеров источников может экономить энергию, поскольку активация в соседнем пространстве может обеспечить более эффективный процессинг, благодаря локальным высоким концентрациям факторов (Frouin et al. 2003) (Fig. 2D). Однако не все источники репликации активируются в одно и то же время в S-фазе. Некоторые области генома реплицируются рано в S-фазе, тогда как др. реплицируются позже. Фокусы репликации на всех временных стадиях S-фазы, как было установлено, ассоциированы с NM (Nakayasu & Berezney 1989) укомплектованы синтезируемой ДНК, которая постепенно движется из каждого фокуса (Hozak et al. 1993, 1994), это согласуется с концепцией эманации петель. Cohesin, как полагают, помогает удерживать петли вместе, поскольку он присутствует в источнике, взаимодействует с pre-RC, а его отсутствие замедляет S-phase (Guillou et al. 2010). Эти данные показывают, что аппарат репликации располагается в точках прикрепления на NM у основания хроматиновых петель.

Organization of chromatin loops

Хроматиновые петли были первоначально обнаружены чисто структурно, указывая на способ более сложной модели с функциональностью у основания петель. Модели обнаруживали тенденцию к выбору одной из двух форм, или к факториям с петлями в виде цветка практически без учета NM (Frouin et al. 2003), или к прикреплению к NM оснований петель без представления, как это может сводиться вместе в факторию (Cook 1999; Ottaviani et al. 2008) (Fig. 2B,D).

Мы и др. (Cook 1999; Ottaviani et al. 2008; Rivera-Mulia et al. 2011), высказали гипотезу, что рекрутирование источников на NM является частью процесса инициации (Fig. 2C). Рекрутирование, по-видимому, происходит после образования pre-RC, т.к. большинство из этого закладывается в телофазе митотического клеточного цикла, правда источники, по-видимому, рекрутируются позднее в G1-фазе (Djeliova et al. 2001b). Если ввести рекрутирование источников а модели, некоторые показывают расположение источников дистально на петлях, рекрутируемых на NM в поздней G1/S-фазе. Т.к. ДНК выстраивается в очередь в фактории репликации, то вновь синтезированная ДНК выталкивается как две новые петли, при этом их источники возвращаются в свое оригинальное местоположение (Cook 1999; Ottaviani et al. 2008). Это подразумевает временное укорочение петель, по мере того как источники прикрепления формируются и далее временно укорачиваются, когда ДНК наматывается (reeled) на аппарат репликации вследствие активации источника. Чтобы понять влияние этого на средний размер петли, мы д. рассмотреть, рекрутируются ли все источники в одно и то же время, поскольку если это не синхронный эффект на размер петель, он д. быть минимальным. Djeliova et al. (2001a,b) сообщают, что как ранние, так и поздние источники рекрутируются на NM во время поздней G1 фазы (described in more detail above), подтверждая, что рекрутирование на NM скорее синхронное, чем распределено во времени по мере активации факторий репликации. Однако анализ размера петель хроматина с помощью MFHR не выявил глобального ремоделирования петель между разными фазами клеточного цикла (Jackson et al. 1990).

Чтобы примерить модель с этими наблюдениями, мы рассмотрели последствия рекрутирования источников, которые наиболее проксимальны к существующим точкам прикрепления (Rivera-Mulia et al. 2011). Рекрутирование источников на 'верхушки' петель д. вызывать уменьшение размера петли до 50%, но это д. быть максимумом наблюдаемого. Рекрутирование источников ближайших к существующим S/MAR д. оказывать меньший из эффектов на размер петли. Напр., рекрутирование источников в четверти пути 'up' петля будет первоначально вызывать лишь максимум 12.5% уменьшения размера петли (Fig. 2C), а ещё более ближайший источник к существующим S/MAR будет оказывать ещё меньший эффект. Рекрутирование источников близко к существующим S/MARs может возникать преимущественно в случаях, в которых небольшое снижение глобального размера петли может быть трудно определяемым и может объяснить, почему не описывается снижение для поздней G1-фазы.

Сходным образом, отсутствует уменьшение размера петли в S-фазе, несмотря на теоретическое уменьшение, поскольку ДНК разматывается (reeled) в направлении аппарата репликации на NM. Это вообще-то неудивительно, учитывая, что источники не все активируются в одно и то же время, но как часть организованной временной программы. Итак, эти аргументы предлагают некий путь для объяснения менее глобального влияния на средний размер хроматиновых петель или в поздней G1 или S-фазе.

Similarities to transcription

Короче, мы подчеркиваем данные, подтверждающие роль NM в транскрипции, могут быть информативными. Имеется огромное количество опубликованных работ о NM как месте транскрипции (summarised in Razin et al. 2011). Препараты скелета ядра показывают синтезируемую РНК, активную РНК полимеразу и активные гены в устойчивой фракции, сходным образом как и на препаратах NM (Jackson & Cook 1985; and references therein). В соответствии с этим, некоторые сообщения подтверждают, что точки прикрепления обогащены транскрибируемыми генами (Jackson et al. 1996; Craig et al. 1997), с петлями ~4 kb, в противоположность в ~200 kb петлям в неактивном хроматине (Bode et al. 2003), подтверждая, что прикрепления имеют функциональное значение. Скрининг протеома из NM белков выявляет множество транскрипционных факторов (Albrethsen et al. 2009), предположительно это MARBPs с сайтами связывания, потенциально увеличивающими вероятность S/MAR. FISH по разным генам выявляет транскрипционно активные гены, обнаруживающими пятнышки на NM (усиленное прикрепление), тогда как транскрипционно неактивные гены оказывались смещены в петли (Gerdes et al. 1994). Однако такое подразделение менее чётко во время S-фазы, когда, как полагают, паттерн прикрепления представляет собой комбинацию эффектов статуса транскрипции и временного закрепления на NM во время репликации, как с добавлением, так и потерей прикреплений во время этого периода (Gerdes et al. 1994). Модели, предложенные для транскрипции, подобно репликации, используют фактории, формирующие петли (Cook 1999; Sutherland & Bickmore 2009), подразумевая определенную степень общности механизмов, но также и потенциальный конфликт организации.

Nuclear changes in cancer and disease

В качестве общего свойства раковых клеток, выступают изменения в ядерной архитектуре и морфологии, что служит основой для диагностики раковых опухолей (reviewed in Zink et al. 2004). Однако без полного понимания архитектуры ядра в нормальных клетках трудно рассуждать, какие из изменений являются причиной или следствием нарушений регуляции раковых клеток. Помимо генетических и эпигенетические изменения, вызывают многие др. из описанных изменений в организации генов, субъядерных доменов, нелинейных ассоциаций ДНК и регуляторных и макромолекулярных комплексов в раковых клетках (reviewed extensively elsewhere, for example, in Zaidi et al. 2007). Это верно и для некоторых др. болезней (reviewed in Bode et al. 2000; Linnemann & Krawetz 2009a), включая талассемию, при которой делеции часто соответствуют сайтам S/MAR, подтверждая, что изменения в прикреплении хроматиновых петель являются важным патогенетическим фактором (Bode et al. 2000). Изменения в композиции NM описаны для раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками, при этом некоторые из них могут быть использованы в качестве диагностических тестов (Zink et al. 2004; He et al. 2008; Albrethsen et al. 2009; Lever & Sheer 2010; Munkley et al. 2011; and references therein). Напр., сплайс-вариант NM белка CIZ1 ассоциирован и может быть обнаружен в крови индивидов на ранней стадии болезни (Higgins et al. 2012). Сплайс-варианты, меняющие экспрессию CIZ1, были описаны связанными с др. раковыми опухолями, включая medulloblastoma, рак груди и саркому Ewing's (Warder & Keherly 2003; den Hollander & Kumar 2006; Rahman et al. 2007) и с др. нарушениями, включая болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит и cervical dystonia (Judex et al. 2003; Dahmcke et al. 2008; Xiao et al. 2012), многие из которых характеризуются альтерациями субъядерной локализации. MARBP SATB1 сцеплен с агрессивным раком груди (reviewed in Lever & Sheer 2010), тогда как SAF-B, напротив, коррелирует со скоростью пролиферации опухолей (reviewed in Lever & Sheer 2010). Ряд NM белков (напр., RUNX, CIZ1 и cyclin E) , как было установлено, имеют измененную локализацию в раковых клетках, что иногда связано с неспособностью доставки их на NM (Zaidi et al. 2007; Munkley et al. 2011; Higgins et al. 2012).

Мы подтвердили, что нарушение регуляции раковых клеток может быть непосредственным результатом событий, таких как репликация и транскрипция ДНК не ограниченная больше пространственно прикреплениями к NM. Состав NM и прикрепления петель, как было установлено, изменяются во время дифференцировки и развития (Getzenberg 1994; Munkley et al. 2011; Varma & Mishra 2011), что привело к идее, что это может служить 'фиксации' онтогенетической программы (Vassetzky et al. 2000; Munkley et al. 2011). Мы подтверждаем, что эта фиксация, специфичных для типов клеток характеристик, таких как программа транскрипции и времени репликации, дефектны в раковых клетках, приводя в результате к частичному возврату в менее специфическую, подобную эмбриональной организации хроматина.

Conclusions

The replication of ДНК is fundamental to all cells, but is often deregulated in cancer cells with dramatic consequences. Data are amassing that suggest all stages of ДНК replication are located at the NM at least in some cell types, and it is becoming clear that immobilization of ДНК machinery and the resultant mechanisms of replication are likely to be an important method of regulating ДНК synthesis. ДНК replication should therefore not be considered alone, but in the context of nuclear architecture, with many other processes occurring at the same time and in the same space, in connection with a nuclear substructure. The NM can appear mysterious and elusive in detail, which we suggest may reflect the model system of choice.

The available published work suggests that in differentiated, noncancer cells, attachment of ДНК and proteins involved in ДНК replication to a NM occurs at specific times in the preparation for and during ДНК replication. This is likely to constrain the process in time and space and possibly help to establish a heritable pattern of ДНК replication. Attachment to a spatially constrained structure would also promote efficient use of required factors, with locally high concentrations at specific sites rather than diffusely spread throughout the nucleus. However, using the behavior of cyclin E as an indicator, we suggest that in undifferentiated or cancer cells initiation of ДНК replication is less fixed in space. We suggest that failure to constrain initiation may allow greater flexibility and plasticity in these cell types, and that such flexibility may be lost with the imposition of spatial constraint as cells differentiate. This idea echoes the change in origin usage recorded as cells differentiate, with random and more frequent origin usage in early embryonic cell cycles, giving way to fewer and more specified origin usage in later cell cycles. Many other fundamental processes also appear to occur at the NM, such as transcription, ДНК repair and epigenetic remodeling. Therefore, it is likely that these may also be subject to a similar level of regulation as ДНК replication and their disregulation in cancer may similarly be in part due to compromised attachment to the NM.

As well as these potential differences between cell types we should also bear in mind that there may well be different mechanisms occurring within one cell. While there appears a universal process of ДНК synthesis, it is likely that there will be differences in the initiation process. For example, there may be slightly different mechanisms used to select and initiate origins that govern replication through euchromatin compared to heterochromatin.

In conclusion we suggest that the relationship between the NM and ДНК replication is important and complex, providing organization in many forms as well as anchoring key processes. However, this relationship cannot at the moment be generalized with differences occurring between cell types, and we hypothesize different types of chromatin within the same cell.

Relationship between DNA replication and the nuclear matrix Rosemary H. C. Wilson, Dawn Coverley Genes to Cells Volume 18, Issue 1, pages 17–31, January 2013

Relationship between DNA replication and the nuclear matrix
Rosemary H. C. Wilson, Dawn Coverley
Genes to Cells Volume 18, Issue 1, pages 17–31, January 2013