Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) являются уникальными, поскольку они в основном происходят из внутренней клеточной массы преимплантационных эмбрионов и поэтому способны к самообновлению и дифференцировке во все три клона слоёв дермы. Поэтому hESCs рассматриваются как хороший резерв для онтогенетических событий и для генерации окончательно дифференцированных клеток для терапевтических подходов. Одним из основных препятствий в области регенеративной неврологии является доступность эмбриональных нейральных предшественников или специализированных нервных клеток человека. Генерация нейральных предшественников и окончательно дифференцированных клеток из hESCs обещает многое для создания клеточной модели нейронального развития человека и в качестве потенциального резерва для заместительной клеточной терапии при нейродегенеративных болезнях.

В последние годы появилось несколько сообщений о дифференцировке hESCs в нейральные предшественники и допаминергические типы клеток, с различным выходом таких клеток в разных группах исследований (reviewed by Correia et al., 2008). Такая разнородность между сообщениями в продукции tyrosine hydroxylase (TH)-позитивных клеток может быть приписана (i) различиями в протоколах экспериментов и используемых индукционных факторов, и (ii) прирожденные различия в используемых hESC линиях. Экспериментальные протоколы для дифференцировки hESCs в допаминергические клетки варьируют от использования животного происхождения питательных добавок и стратегий индукции до химических индукторов, неопределяемых компонентов среды, гормонов и онтогенетических сигналов в многоступенчатом процессе (Schulz et al., 2004; Zeng et al., 2004; Yan et al., 2005; Iacovitti et al., 2007; Sonntag et al., 2007; Shimada et al., 2009; Zhang and Zhang, 2010). Использование кондиционной среды или системы совместного культивирования с линией клеток печеночной гепатоцеллюлярной карциномы мышей HepG2 в протоколе дифференцировки ответственно за получение несогласующихся результатов из-за связанных с пассажами различий. Опять же использование fetal bovine serum (FBS) в среде для дифференцировки является предметом lot-to-lot изменчивости, которая в дальнейшем ведет к несогласующимся результатам.

Протоколы использования ростовых факторов и онтогенетических сигналов могут вызывать вариации в выходе дифференцированных клеток благодаря использованию разных линий клеток hESCs. Хотя hESC линии довольно унифицированы в отношении экспрессии ими маркеров плюрипотентности и теломеразной активности (Abeyta et al., 2004; Bhattacharya et al., 2004; Carpenter et al., 2004; Rao et al., 2004; Richards et al., 2004; Skottman et al., 2005), имеются некоторые внутренне присущие различия в склонности разных hESC линий для трех разных линий (Oh et al., 2005; Denning et al., 2006). Изучение эпигенетических сигнатур разных линий hESC показало, что индивидуальные клеточные линии имеют отличающиеся специфичные для линий эпигенетические профили (Hoffman et al., 2005; Bibikova et al., 2006; Lagarkova et al., 2006), которые могут влиять на их свойства дифференцировки. Ранее, Pal et al. (2009) показали, что HUES9 обладает более высокой предрасположенностью в направлении эктодермального клона, чем HUES7, исходя из спонтанной дифференцировки.

Итак, всё это чётко показывает, что протоколы направленной дифференцировки hESCs в dopaminergic нейроны нуждаются в установлении для каждой клеточной линии использования определенных продуктов, для эталонного тестирования исполнения и эффективности стандартов для будущих аппликаций. Нашей целью стала разработка простых протоколов с использованием определенных продуктов и подсчета урожая нейральных предшественников и допаминергических клеток.

Был использован двухступенчатый протокол, чтобы модифицировать культуральную нишу с использованием соотв. ECM и индуцировать среду для генерации допаминергических клеток из эмбриоидных тел, происходящих из HUES9. Индукционная среда лишена сыворотки и содержит коктель определенных микро питательных веществ и ростовых факторов (в форме человеческих рекомбинантных белков), базируясь в основном на эмбриональных онтогенетических сигналах. Используемый внеклеточный матрикс также был человеческого происхождения.

Pal et al. [Pal et al. 2009 Exp Biol Med (Maywood) 234:1230–3] продемонстрировали предрасположенность HUES9 направленная дифференцировка HUES9 в допаминергические нейроны ещё не была описана. Мы предложили простой двухступенчатый протокол с использованием соотв. ECM и свободной от сыворотки индукционной среды для генерации допаминергических клеток из HUES9-производных эмбриоидных тел. Анализ с помощью жидкостной цитометрии нейральных предшественников осуществляли после первой ступени, он показал увеличенный выход клеток иммуно-позитивных по nestin (99.6 ± 0.1%), musashi12 (98.1 ± 1.5%) и Sox2 (95.4 ± 2.6%). Большинство из этих клеток также экспрессировали маркер пролиферации Ki67 (83.8 ± 1.5%), тогда как присутствие маркера недифференцированных стволовых клеток Oct4 было незначительным. На второй ступени, когда эти нейральные предшественники подвергали действию сигналов из среднего мозга sonic hedgehog и fibroblast growth factor 8 вместе с bFGF, то дифференцированные клетки обнаруживали усиление активности dopaminergic-родственных транскрипционных факторов Nurr1 и Engrailed1. Иммуноцитохимический и проточной цитометрии анализ показали, что эти дифференцированные клетки позитивны по маркеру зрелых нейронов Map2ab (96.2 ± 1.5%) и допамиергическому нейрональному маркеру TH (71.9 ± 4.4%).