Морфологический переход клеток между мезенхимным и эпителиальным состоянием играет важную роль в развитии сложных тканей во время эмбриогенеза и ассоцирован также с прогрессированием болезней, таких как рак и фиброз почек (rev. Thiery and Sleeman, 2006; Yang and Weinberg, 2008; Nieto, 2011). Известный пример mesenchymal-to-epithelial transition (MET) во время формирования сомитов у эмбрионов позвоночных. Сомитогенез устанавливает метамерный паттерн осевой скелетно-мышечной системы, помимо влияния на миграцию эндотелиальных клеток и клеток нервного гребня, которые дают сосудистую сеть и периферическую нервную систему, соотв. (Burgess et al., 1996; Wilson-Rawls et al., 1999). Т.к. пересечение сигнальных путей, которые управляют сегментацией сомитов из передней presomitic mesoderm (PSM) изучено всесторонне, генетические пути, которые регулируют сопутствующий MET не было охарактеризовано достаточно (reviewed in Maroto et al., 2012; Saga, 2012).

Инициация и поддержание сомитного MET в параксиальной мезодерме кур и мышей зависит от передачи сигналов от лежащей поверх эктодермы (Sosic et al., 1997; Correia and Conlon, 2000; Rifes et al., 2007). Удаление поверхностной эктодермы у эмбрионов мышей не влияет на сегментацию параксиальной мезодермы, но ведет к потере сомитами MET (Correia and Conlon, 2000). Потеря эпителизации сомитов обусловлена, по крайней мере, частично дефицитом активации канонического сигнального Wnt пути. Экспрессия Wnt6 поверхностной эктодермой индуцирует сомитный MET, а эктопическая экспрессия Wnt6 способна заместить отсутствие поверхностной эктодермы с помощью механизма, зависимого от β-catenin (Schmidt et al., 2004; Linker et al., 2005). Один из генов под контролем передачи сигналов WNT6 является базовым helix-loop-helix (bHLH) транскрипционным фактором , PARAXIS (Wagner et al., 2000; Schmidt et al., 2004; Linker et al., 2005). Когда поверхностная эктодерма удаляется из каудальной части PSM, то экспрессия Paraxis теряется и сомиты неспособны эпителизироваться (Sosic et al., 1997; Correia and Conlon, 2000). Более того, вынужденная экспрессия Paraxis способна восстановить эпителизацию сомитов в отсутствие передачи сигналов Wnt (Linker et al., 2005). Это указывает на то, что PARAXIS действует ниже сигнального пути Wnt и что гены мишени для PARAXIS необходимы, чтобы индуцировать MET в пресомитной мезодерме. PARAXIS является членом подсемейства TWIST bHLH транскрипционных факторов, которые регулируют транскрипцию путем соединения с каноническими E-box элементами в качестве гетеродимеров с E белками (Wilson-Rawls et al., 2004). PARAXIS первоначально транскрибируется во время ранней гаструляции (эмбриональный день 7.5 у мышей) в передней части PSM и во всем формирующемся сомите, прежде, чем ограничиться дермомиотомом компартментализованного сомита (Quertermous et al., 1994; Burgess et al., 1995; Barnes et al., 1997; Shanmugalingam and Wilson, 1998; Carpio et al., 2004). PSM мезенхима от Paraxis^-/- эмбрионов образует межсомитные границы, но неспособна к переходу в эпителий (Burgess et al., 1996), фенотип, сходный с таковым, наблюдаемым у мышиных эмбрионов, лишенных дорсальной поверхностной эктодермы (Correia and Conlon, 2000). Далее, PARAXIS необходим для становления передне-задней полярности в сомитах, которая необходима для собственно повторной сегментации позвоночного столба (Johnson et al.,2001). Идентификация нижестоящих мишеней для PARAXIS ограничена склеротомным маркером Pax1 у мышей (Wilson-Rawls et al., 2004), и meox2 у Xenopus (Della Gaspera et al., 2012). Однако его роль в регуляции транскрипции генов, ассоциированных с исходными клеточными процессами MET во время раннего сомитогенеза, остается невыясненной.

Морфологически, MET инициируется за счет образования двумерного слоя клеток благодаря приобретению cadherin-обеспечиваемых слипчивых соединений на апико-латеральных границах соседних клеток (Baum and Georgiou,2011). Параллельно, происходит реорганизация микротубулярного цитоскелета, устанавливается определенная клеточная полярность и происходит сборка плотных соединений на апикальной поверхности эпителия (Radice et al., 1997; Rhee et al., 2003). Стабильность эпителия зависит от образования фокальных адгезий между кластерами клеточных рецепторов (integrins, urokinase plasminogen activator receptor и heparin sulfate proteoglycans) и компонентами внеклеточного матрикса (ECM) на базальной поверхности (George et al., 1993; Yang et al., 1993, 1999; Woods and Couchman, 2001; Mostafavi-Pour et al., 2003; J?lich et al., 2005; Rifes et al.,2007; Rifes and Thorsteinsd?ttir, 2012; Wehrle-Haller, 2012). (Fig. 1A). Figure 1.

Члены семейства Rho малых GTPases (RHOA, RAC1 и CDC42), как было установлено, являются критическими для интеграции сигналов от рецепторов клеточных адгезий, включая cadherins, integrins и Eph рецепторы, это ведет к реорганизации цитоскелета, необходимой для образования слипчивых и плотных соединений и фокальных адгезий во время MET (rev. Van Aelst and Symons,2002). Исследования, осуществленные на эмбрионах кур, демонстрируют, что RHOA, RAC1, и CDC42 играют роль в MET в сомитах (Nakaya et al., 2004; Takahashi et al.,2005). Nakaya et al. (2004) показали, что активированные CDC42 способствуют мезенхимному состоянию в параксиальной мезенхиме, тогда как активированные RAC1 способствуют эпителиальному состоянию и необходимы для PARAXIS-управляемой эпителизации сомитов. Эти исследования предсказывают, что PARAXIS участвует в регуляторном пути, который связывает каноническую передачу сигналов Wnt с активностью Rho GTPase и с регуляцией морфогенетических изменений, ассоциированных с MET в сомитах. Однако этот простой путь не описывает механизмов, с помощью которых PARAXIS регулирует свои нижестоящие гены мишени, чтобы повлиять на активность Rho GTPase и MET в параксиальной мезодерме. Здесь мы использовали комбинацию конфокальной микроскопии и анализ микромассивов, чтобы исследовать морфологию клеток сомитов и экспрессию генов на ст. E9.5 у Paraxis^-/- эмбрионов, в сравнении с эмбрионами дикого типа. В отсутствие PARAXIS, клетки формирующихся сомитов неспособны генерировать поляризованное распределение слипчивых соединений и микрофиламент, ассоциированные с MET. Потеря PARAXIS ведет к нарушению регуляции модификаторов активности Rho GTPase, но не изменяет уровней мРНК RAC1 или др. членов семейства Rho GTPase непосредственно. Наши данные также выявили новую роль PARAXIS в регуляции генов, которые не связаны с каноническим GTPase сигнальным путем, но участвуют в MET или EMT, включая те, что участвуют в продукции и стабильности ECM, перестройке цитоскелета посредством сборки фокальных адгезий и adherens/tight соединений, и не канонического Wnt пути.

RESULTS AND DISCUSSION

Фенотип Paraxis^-/- новорожденных, которые погибают вскоре после рождения, характеризуется преобладанием дефектов в формировании паттерна производных сомитов, подтверждая, что первичная роль PARAXIS заключается в поддержании пространственной упорядоченности компартментов сомитов за счет зарождающейся эпителизации сомитов и поддержания эпителизованного дермомиотома. Поскольку активность PARAXIS необходима для индукции MET, идентификация генетических факторов, стоящих ниже регуляции PARAXIS во вновь сформированном сомите и дермамиотоме является критической ступенью в характеристике морфогенетических процессов, которые происходят во время MET и EMT.

Epithelial Markers Are Mislocalized in Paraxis^-/- Somites

Инициация MET запускается с помощью образования активных центров (nucleation) F-actin сети микрофиламент, связанных со слипчивыми и плотными соединениями вдоль апико-латеральных мембран соседних клеток (Baum and Georgiou, 2011). Чтобы оценить степень эпителизации клеток во вновь сформированных сомитах у E9.5 Paraxis^-/- эмбрионов, мы исследовали распределение F-actin, используя actin-связывающий phalloidin конъюгированный с Alexa Fluor-488. Повышенная агрегация F-actin вдоль апикального аспекта дорсального эпителия наблюдается в нормальных сомитах (Fig.1B). Эквивалентный регион Paraxis^-/- сомитов окрашивается позитивно на актин в виде дезорганизованных участков, но не обнаруживает ни того же самого поляризованного распределения, ни четко организованного эпителиального слоя. Неправильная локализация актина может быть вызвана отсутствием или межклеточных соединений, с которыми он соединяется, или Rho GTPases, которые контролируют организацию актина. Поэтому мы исследовали также распределение маркера слипчивых соединений N-Cadherin (NCAD), и Rho GTPase (RHOA) вParaxis^-/- сомитах с помощью непосредственно иммунофлюоресценции. Подобно актину оба белка оказывались сконцентрированными вдоль апикальной поверхности дорсального эпителия в сомитах дикого типа, тогда как они оказывались распределенными диффузно в Paraxis^-/- сомитах (Fig. 1B). Эти наблюдения согласуются с потребностью в PARAXIS для становления собственно апикально-базальной полярности внутри эпителия сомитов во время инициальных стадий MET.

Microarray Analysis of Somite MET in Paraxis?/? Mice Reveals Deregulated Genes Involved in Multiple MET Processes

Чтобы идентифицировать гены, чья экспрессия прочно закреплена ниже Paraxis во время формирования сомитов, мы осуществили анализ микромассивов экспрессии генов на объединенных тотальных РНК, изолированных из передней части PSM и 4-х только что возникших сомитов на ст. E9.5 Paraxis^-/- и Paraxis^+/+ эмбрионов. Это отражает эмбриональный период времени, когда имеется мощная экспрессия Paraxis в передней части PSM и ранних сомитах.

Наш анализ микромассивов идентифицировал 795 генов, чья экспрессия была, по крайней мере, в 1.5-раза выше или ниже в Paraxis^-/- ткани по сравнению с диким типом. PARAXIS , как полагают, действует как активатор транскрипции (Wilson-Rawls et al., 2004), и в соответствии с этим, гены с наиболее значительными изменениями в уровнях мРНК, оказывались подавлены в отсутствие PARAXIS. Однако этот подход в отдельности не позволяет отличать между прямой и косвенной регуляцией транскрипции. Гены с нарушенной регуляцией тесно коррелируют (P < 0.01) с ограниченным количеством gene ontology (GO), термин классификаций, ассоциированных с процессами эмбрионального развития, внеклеточным матриксом и клеточной поверхностью (Table 1), это согласуется с тем, что присутствие PARAXIS необходимо для транскрипции генов, участвующих в межклеточной и клетка-ECM адгезии. Наиболее смягченный порог (P < 0.05) включает GO термины, ассоциированные с путями передачи клеточных сигналов и активностью транскрипционных факторов (Table 1), демонстрируя, что PARAXIS может контролировать транскрипцию ассоциированных с MET генов путем активации дополнительных регуляторов. Исходя из доказанной или предполагаемой функций, мы идентифицировали такие гены, которые ассоциируют с организацией ECM, организацией цитоскелета, с притяжением и отталкиванием клеток и с регуляцией передачи сигналов и транскрипции среди 795 генов с нарушенной регуляцией (Tables 2 and 3). Изменения в уровне экспрессии в отсутствие PARAXIS оценивали с помощью qRT-PCR (Fig. 2) для отобранного субнабора этих генов, каждый представляющий табельную категорию и для отобранных генов, как известно, экспрессирующихся в сомитах с помощью гибридизации in situ wyks[ препаратов (Figs. 3 and 4). Отличие генов с нарушенной регуляцией, идентифицированных в нашем исследовании указывает, что PARAXIS ответственен за поддержание нескольких самостоятельных морфологических событий, связанных с эпителизацией сомитов. Figure 2-4.

Table 1. Microarray Analysis Reveals Potential Direct Paraxis Targets and Associated Gene Ontology Terms

Table 2. Selected Genes Involved in MET/EMT, Cell Migration and/or Cell Adhesion That Are Upregulated at Least 1.5-Fold in Paraxis?/? Versus Paraxis+/+ Embryo PSM and Somitic Tissues

PARAXIS Regulates Genes Associated With Extracellular Matrix Stabilization and Remodeling

Наиболее сильные изменения в экспрессии генов в Paraxis^-/- сомитах и PSM были найдены среди белков клеточной поверхности, которые модифицируют организацию ECM (Tables 2and 3). Многие из этих генов и не подозревались ранее в участии в MET сомитов. Особенно заметен среди них fibroblast activation protein alpha (Fap) (подавляется в 16.2 раз; Table 3), ген кодирует трансмембранный белок, который обладает dipeptidyl peptidase и gelatinase/collagenase активностями, и который увеличивает уровень fibronectin и организацию коллагеновых волокон в ECM (Levy et al., 1999; Aertgeerts et al., 2005; Lee et al., 2011). FAP, путем ассоциации с интегринами и urokinase plasminogen activator receptor (UPAR) внутри фокальных адгезий, регулирует зависимую от интегрина миграцию опухолевых клеток (Mueller et al., 1999; Artym et al., 2002; Lee et al., 2011). Мы подтвердили, что Fap транскрипты снижены в Paraxis^-/- сомитах при qRT-PCR (Fig. 2B) и при гибридизации in situ (Fig. 3A and B). На ст. E9.5 в дикого типа мышиных эмбрионах FAP располагается как на апикальной, так и базальной клеточной поверхности эпителиальных клеток в сомитах (Fig. 3C), подтверждая, что FAP для взаимодействия эпителия с ECM, вообще-то контролируя становление и поддержание отделения эпителия от окружающих тканей. В соответствии с этим, fibronectin оказывается менее организованным вдоль дорсальной поверхности сомитов Paraxis^-/- и не образует полного слоя в межсомитном регионе (Fig. 3D and E).

Среди генов, которые усиливали свою активность в отсутствие Paraxis были те, что способствуют клеточной миграции благодаря разрывам в ECM. Сюда вошли S100a4, кодирующий EF-hand кальций-связывающий белок, ассоциирующий с метастатическими опухолями (reviewed in Helfman et al., 2005; Schneider et al., 2008), и matrix metalloproteinase, MMP9 (Table 2, Fig. 2A). Интересно, что S100A4-зависимая инвазия опухолевых клеток зависит от содействия транскрипции и активности MMP, включая и MMP9 (Schmidt-Hansen, 2004; Saleem et al.,2006). Активность MMP9 способствует EMT в клетках почечных канальцев (Tan et al., 2010). Возможно, что PARAXIS репрессирует тот же самый путь в параксиально мезодерме, чтобы устранять деструкцию ECM , необходимую для поддержания становления эпителия.

PARAXIS Regulates Genes Encoding Cell-ECM and Cell-Cell Adhesion Proteins

Базируясь на важности взаимодействий между клетками и ECM и межклеточных взаимодействий при MET, гены, ассоциированные с этими процессами были исследованы у эмбрионов Paraxis^-/-. Гены, связанные с обоими взаимодействиями, обнаруживали нарушения регуляции в отсутствии PARAXIS (Tables 2 and 3). Важными среди них были Itgav, кодирующий интегрин, который вместе с ITGA5, соединяется с fibronectin и является важным для формирования фокальных адгезий в сомитах (Yang et al., 1999). Ранее было показано, что блокирование формирования фокальных адгезий не ингибирует транскрипцию Paraxis, подтверждает, что активность PARAXIS происходит выше сборки фокальных адгезий (Rifes et al., 2007). Интересно, что syndecan 4 (Sdc4), кодирующий корецептор integrin усиливает свою активность в 4.1 раз (Table 2; Fig. 2A). Воздействие увеличения Sdc4 на морфологию сомитов у эмбрионов Paraxis^-/- неясно. Однако, возможно, что это изменение может вызывать нарушения фокальных адгезий за счет стоихометрического дисбаланса.

Двунаправленный сигнальный путь Eph-ephrin регулирует реорганизацию цитоскелета, который может управлять или межклеточной адгезией или отталкиванием (reviewed in Noren and Pasquale, 2004; Poliakov et al., 2004). EphA3 и EphA7 рецепторы были снижены в 1.6- и 2.0-раза, соотв. (Table 3). Подавление EphA7 было подтверждено qRT-PCR (Fig. 2) и гибридизацией in situ для обоих генов у эмбрионов Paraxis^-/- (Fig. 4). Ранее, активность EPHA3,как было установлено, необходима для формирования границ сомитов у рыбок данио, тогда как EPHA7 был ассоциирован с миграцией клеток нервного гребня (Araujo and Nieto, 1997; Araujo et al.,1998; Lackmann et al., 1998). Это открывает возможность, что EPHA3 и EPHA7 необходимы для адгезивных процессов во время эпителизации сомитов. EphA7 в дальнейшем экспрессируется в дермомиотоме (Araujo and Nieto,1997), который сохраняет эпителизацию, установленную во время сомитогенеза, подтверждая идею, что этот рецептор может быть необходим для становления и поддержания высоко адгезивных тканей. t

Члены A Disintegrin and Metalloprotease (ADAM) семейства, Adam18 и Adam^tsl3 были существенно подавлены у Paraxis^-/- эмбрионов в PSM и сомитах (Table 3). Связанные с мембраной белки, кодируемые этими генами, могут участвовать непосредственно в клеточной адгезии или ингибировать адгезию посредством потери эктодомена type I или type II трансмембранных белков (Weber and Saftig, 2012). ADAM18 является белком клеточной поверхности, присутствующим в мембранах спермиев, где он, как полагают, повышает клеточную адгезию посредством взаимодействия с интегринами яйцеклетки (Frayne et al., 2002; Weber and Saftig, 2012). C помощью гибридизации in situ мы подтвердили, что Adam18 транскрибируется в сомитах и подавляет свою активность в отсутствие PARAXIS (Fig. 4), открывая возможность, что он способствует MET посредством PARAXIS-зависимого механизма.

PARAXIS Regulates Cytoskeleton Reorganization During MET

MET связан с реорганизацией цитоскелета, которая затрагивает морфологию клеток, способствует апикально-базальной полярности и создает структурную поддержку для клеточной адгезии. Члены семейства Rho GTPase (RHOA, RAC1, CDC42) интегрируют сигналы от адгезивных молекул до непосредственных определенных морфологических исходов, которые помогают стабилизировать эпителий (rev. Hall, 2005). Все эти три GTPases, как известно, участвуют в регуляции динамики цитоскелета во время сомитогенеза (Nakaya et al., 2004; Takahashi et al., 2005; Watanabe et al., 2007). Поскольку актиновые филаменты и RHOA белок не располагаются собственно в Paraxis^-/- сомитах (Fig. 1), уровни мРНК RhoA, Rac1 и Cdc42 сами по себе не были изменены, по крайней мере, более чем в 1.5 раза. В самом деле модификаторы активности Rac1 и Cdc42 GTPase были изменены (Tables 2 and 3). Guanine nucleotide exchange factor (GEF), Dock2 (Fukui et al., 2001), обнаруживал снижение активности в 1.6 раза, это подтверждается гибридизацией in situ у E9.5 Paraxis^-/- эмбрионов (Fig. 4). Rac1-специфический GEF, Arhgef6 усиливал свою активность в Paraxis^-/- ткани в 1.6- раза (Table 2, Fig. 2). Далее, Capn6 (снижался в 1.5 раза, Table3), кодирующий белок стабилизирующий микротрубочки, экспрессируется в сомитах эмбрионов мыши (Dear and Boehm, 1999) и может способствовать активности RAC1 путем связывания ARHGEF2 (Tonami et al., 2011). Снижение активности генов, кодирующих модификаторы RAC1, предсказывает, что регуляция активности Rho GTPase c помощью PARAXIS происходит косвенно во время сомитогенеза.

PARAXIS Controls Developmental Regulatory Genes Associated With Somitogenesis

Активация канонического Wnt сигнального пути участвует как в сегментации, так и в MET во время сомитогенеза. WNT6, действующий посредством β -catenin-зависимого пути, необходим для поддержания транскрипции Paraxis и MET сомитов у эмбрионов кур (Linker et al., 2005). В нашем анализе микромассивов Paraxis^-/- сомитов, компоненты транскрипции канонического сигнального пути, включая Wnt2, Wisp2 и Daam2, обнаруживали снижение активности (Table 3). Снижение уровня транскриптов Daam2, продукт которых стабилизирует комплекс DVL3/AXIN2 и модулирует активность Rho GTPases (Lee and Deneen, 2012), подтверждено c помощью qRT-PCR и гибридизации in situ (Figs. 2 and 4). Dvl3 также экспрессируется в сомитах эмбрионов мышей (Tsang et al., 1996) и необходим для формирования нормальных сомитов у эмбрионов рыбок данио (Gray et al., 2009). Эти находки выявляют потенциальную позитивную петлю обратной связи между PARAXIS и передачей сигналов Wnt, а также возможный механизм, c помощью которого PARAXIS может регулировать Rho GTPases.

Некоторые транскрипционные факторы, ассоциированные со спецификацией и дифференцировкой параксиальной мезодермы обнаруживают снижение активности в отсутствие PARAXIS. Особенно интересен Dmrt2, поскольку мутантные сомиты Dmrt2^-/- неспособны эпителизоваться, фенотип, сходный с таковым у Paraxis^-/- эмбрионов (Burgess et al., 1996; Seo et al., 2006). Dmrt2 снижает свою активность в 3.0 раза при анализе микромассивов и почти на 60% при qRT-PCR (Table 3, Fig. 2). Базируясь на гибридизации in situ, это снижение является специфичным для сомитов (Fig. 4). Было предположено, что DMRT2 контролирует MET сомитов посредством индукции экспрессии laminin (Seo et al., 2006). Поэтому мы сравнивали экспрессию laminin в сомитах E9.5 Paraxis^-/- и у эмбрионов дикого типа c помощью непрямой иммунофлюоресценции с антителами, специфичными к laminin. Экспрессия laminin была снижена и выглядела диффузной в регионах между сомитами и между миотомом и склеротомом компартментализованных Paraxis^-/- сомитов, по сравнению с контролем (Fig.5). Эти наблюдения указывают на то, что PARAXIS модулирует локализацию laminin и др. белков ECM, необходимых для эпителизации путем активации Dmrt2 как в компартментализованных, так и только что возникших сомитах. Альтернативно, разрушение laminin может быть связано с наблюдаемым разрушением fibronectin вParaxis^-/- сомитах (Fig. 3). Figure 5.

Дополнительные транскрипционные факторы, которые нуждаются в PARAXIS для собственно экспрессии в сомитах, включают MEOX2, TWIST1, TWIST2 и HEYL (Table 3). MEOX2, который регулирует эпителизацию сомитов и управляет транскрипцией Paraxis в комбинации с MEOX1 (Mankoo, 2003), уменьшает свою активность в 3.1 раза (Figs. 2and 4). Эта находка подтверждается недавним сообщением, продемонстрировавшим, что Paraxis кооперирует с Mef2d, чтобы управлять транскрипцией meox2 в Xenopus PSM (Della Gaspera et al., 2012). Итак, эти наблюдения показывают, что имеется петля позитивной обратной связи между MEOX2 и PARAXIS во время сомитогенеза. Далее, PARAXIS необходим для собственно транскрипции Twist1 и Twist2 (Table 3), которые обладают общей сильной гомологией с PARAXIS в своих bHLH доменах. TWIST1 важен для спецификации параксиальной мезодермы и возможно регулирует транскрипцию Fap (Mikheeva et al., 2010), Dynamin3(Dnm3) и Dnm3os (Loebel et al., 2005), генов, которые также снижали свою активность в нашем исследовании (Table 3, Fig. 4). Heyl, нижестоящая мишень передачи сигналов Notch, также снижал свою активность ( в 2.3 раза) в Paraxis^-/- сомитах (Table 3). Heyl динамически экспрессируется в пресомитной мезодерме как компонент часов сегментации (Nakagawa et al., 1999; Leimeister et al., 2000), кроме того, он статически экспрессируется в задних аспектах сомитов (Fig. 4). HeyL экспрессия необнаружима в сомитах Paraxis^-/-эмбрионов и строго подавляется в передней части PSM (Figure 4). Помимо Meox2, Twist1, Twist2 и HeyL, гены, кодирующие дополнительные транскрипционные факторы, такие как Pax1 (подавление в 36.0 раз, данные не показаны), обнаруживали нарушение регуляции в отстутствии PARAXIS, указывая, что PARAXIS участвует не только в регуляции различных MET процессов, но и также в выборе судеб клетками внутри параксиальной мезодермы.

Наш транскрипционный анализ сомитов и PSM Paraxis^-/- эмбрионов предоставил уникальную информацию о функциональной роли PARAXIS в MET сомитах. Вместо этого участие в линейном регуляторном пути, который способствует транскрипции структурных генов, необходимых для инициации эпителиальной морфологии клеток, PARAXIS, по-видимому, участвует в более сложной регуляторной сети, которая действует на базальной поверхности эпителия, посредством стабилизации ECM и регуляции транскрипции генов, необходимых для адгезии между клетками и ECM, и посредством организации цитоскелетных элементов за счет дифференциальной модуляции активности Rho GTPase. Предыдущие исследования продемонстрировали, важность состава ECM и адгезивных белков в фокальных адгезиях для собственно сомитогенеза (George et al., 1993; Yang et al., 1993,1999; Woods and Couchman, 2001; Mostafavi-Pour et al., 2003; J?lich et al., 2005; Rifes et al., 2007; Rifes and Thorsteinsd?ttir, 2012; Wehrle-Haller, 2012). эти исследования в комбинации с нашим анализом экспрессии подтверждают, что PARAXIS служит в качестве регуляторного узла для интеграции внутриклеточных и межклеточных клеточных событий, которые временно связаны с MET в сомитах. Далее, данное исследование идентифицировало дополнительные гены, которые экспрессируются в сомитах мышей и могут служить как критические регуляторы во время сомитогенеза. Важными среди них являются Fap, Adam18 и EphA7, кодирующие белки, которые предположительно участвуют в реорганизации ECM, фокальных адгезиях и миграции клеток в др. тканях эмбриона (Mueller et al., 1999; Niedermeyer et al., 2001; Frayne et al., 2002; Lee et al., 2011; Weber and Saftig, 2012).

Наконец, одной из наиболее впечатляющих находок нашего анализа стала роль PARAXIS в обеспечении экспрессии ключевых онтогенетических регуляторных генов. Wnt и Notch пути оба являются критическими для формирования паттерна, MET и тканевой дифференцировки во время сомитогенеза. Путем индукции транскрипции Daam2 и Heyl, PARAXIS может модифицировать сигнальную активность этих путей. Более того, MEOX2 и DMRT2 являются транскрипционными факторами, которые участвуют в MET в сомитах, исходя из исследований делеций у эмбрионов мышей (Mankoo, 2003; Seo et al., 2006). Это делает оба гена, скорее всего, ближайшими мишенями для PARAXIS-управляемого регуляторного каскада. В подтверждение этого, Xenopus PARAXIS и MEF2C способны непосредственно активировать промотор Meox2 (Della Gaspera et al., 2012). Необходимы дальнейшие исследования для определения, управляют ли Meox2 и др. PARAXIS-зависимые гены мишенями PARAXIS при MET в сомитах мышей.

Regulation of mesenchymal-to-epithelial transition by PARAXIS during somitogenesis Megan Rowton,Pilar Ramos,Douglas M. Anderson,Jerry M. Rhee,Heather E. Cunliffe,Alan Rawls Developmental Dynamics 242:1332-1344, 2013.

Regulation of mesenchymal-to-epithelial transition by PARAXIS during somitogenesis
Megan Rowton,Pilar Ramos,Douglas M. Anderson,Jerry M. Rhee,Heather E. Cunliffe,Alan Rawls
Developmental Dynamics 242:1332-1344, 2013.