Мы показали, что передача сигналов Notch выполняет множественные критические роли в миграции, пролиферации, дифференцировке и детерминации судьбы NCC in vivo. Cre-обусловленное усиление или подавление передачи сигналов Notch в NCCs и их производных ведет к черепно-лицевым, сердечно-сосудистым и нейрогенным аномалиям, которые напоминают модели удаления NC и патологическая презентация с NC-связанных болезней включает синдром DiGeorge (High and Epstein, 2008; Kirby et al., 1983; Lindsay et al., 2001; Porras and Brown, 2008). Хотя избыток или недостаток передачи сигналов Notch в NCCs ведет к краниальным, кардиальным или туловищным аномалиям, механизмы нарушений отличаются. Избыточная передача сигналов Notch в NCCs приводит к аномалиям и недостаточности клеточной миграции, усилению клеточной пролиферации, уменьшению дифференцировки PAA гладкомышечных клеток и способствует приобретению судьбы глиальных клеток в краниальных ганглиях и DRG. Потеря передачи сигналов Notch в NCCs ведет к снижению клеточной пролиферации, дефициту миграции, снижению дифференцировки PAA гладкомышечных клеток и способствует приобретению нейрональных судеб, что сопровождается потерей глиальных клеток, в DRG. Итак, эти данные демонстрируют множественные функции для соотв. уровней передачи сигналов Notch в NCCs во время развития черепа, сердца и туловища.

Манипуляции с передачей сигналов Notch в NCCs ведут к черепно-лицевым аномалиям; однако имеется удивительно мало доказательств необходимости эндогенной передачи сигналов Notch в краниальных NCC для миграции или инициального вклада в развитие головных структур. Избыточная передача сигналов Notch в NCCs ведет к тяжелым черепно-лицевым аномалиям, включая расщепление лица и нёба, экзэнцефалию и микрогнатию, как результат дефицита миграции и отсутствия дифференцировки краниальных NCC. В резком контрасте находятся черепно-лицевые у Wnt1Cre;RBP-Jf/f мышей, которые значительно менее тяжелые, при этом развитие кажется нормальным до E14.5. Кроме того, не было отмечено черепно-лицевых аномалий у Wnt1Cre;Notch1fl/fl эмбрионов. Следовательно, каноническая передача сигналов Notch не нужна для миграции или инициального вклада краниальных NCC в череп и лицо, это согласуется с отсутствием дефектов черепно-лицевого развития у эмбрионов Xenopus или рыбок данио с измененной передачей сигналов Notch в NCCs (Cornell and Eisen, 2005). Усиления тяжести черепно-лицевых дефектов у Wnt1Cre;RosaNotch по сравнению с Wnt1Cre;RBP-Jf/f эмбрионами может быть обусловлено передачей сигналов через RBP-J-независимый неканонический путь, но этот сигнальный механизм пока не выявлен в развитии краниального нервного гребня (D'Souza et al., 2008). На более поздних стадиях развития потеря передачи сигналов Notch затрагивает образование краниального фронтального шва. Эти дефекты скорее всего обусловлены известной потребностью передачи сигналов Notch для пролиферации и дифференцировки остеохондральных предшественников (Dong et al., 2010; Mead and Yutzey, 2009; Zanotti and Canalis, 2010). Итак, эти исследования демонстрируют, что эндогенная каноническая передача сигналов Notch оказывает относительно незначительную роль в миграции и дифференцировке краниальных NCC in vivo, напротив, более тяжелые уродства наблюдаются в производных кардиального и туловищного NC.

Кардиальные NCCs вносят вклад в образование перегородки и собственно становления кардиального OFT. Усиление активации пути Notch в NCCs ведет к отсутствию образования перегородки OFT, характерное для PTA и эмбриональной летальности приблизительно на ст. E14.5. Эмбрионы с потерей RBP-J или специфической потерей Notch1 в NC имеют менее тяжелые кардиальные нарушения и жизнеспособны в течение всей беременности. Хотя эти мыши не выживают после рождения, это, скорее всего, связано с недостаточной сердечно-сосудистой функцией, связанной с конотрункальными нарушениями и дефектами межжелудочковой перегородки, превалирующими у таких животных. Плоды с потерей RBP-J в NCCs обладают DORV и OA, тогда как потеря Notch1 ведет только к OA. Снижение тяжести у Wnt1Cre;Notch1fl/fl по сравнению с Wnt1Cre;RBP-Jf/f нарушений OFT указывает на то, что др. Notch рецепторы, в частности Notch2, или неканонические лиганды могут участвовать в регуляции кардиальных NCC (Varadkar et al., 2008; D'Souza et al., 2008). Следовательно, точные уровни передачи сигналов Notch необходимы в NCC для образования конотрункальной перегородки и построения развивающегося OFT.

Избыток или потеря передачи сигналов Notch ведет к нарушению миграции и вклада NCC в кардиальный OFT и ENS. Предыдущие исследования показали, что потеря передачи сигналов Notch в NCCs, при использовании ко-активатора доминантно-негативного пути Notch (Wnt1Cre;DNMAML), ведет к сердечно-сосудистым дефектам, преимущественно к стенозу легочного ствола (High et al., 2007). Однако не обнаруживаются дефекты миграции NCC у этих мышей и они остаются жизнеспособными после рождения. В данном исследовании, пониженная миграция NCC у Wnt1Cre;RBP-Jf/f эмбрионов ассоциировала с рядом нарушений становления OFT, включая DORV, и эти мыши не выживали после рождения. Следовательно, потеря RBP-J ведет к более тяжелому дефициту NC, чем экспрессия DNMAML в данном анализе. Кроме того, траектория миграции NCC затрагивается индукцией передачи сигналов Notch. Обычно NCCs мигрируют в PAs двумя предпочтительными потоками. Однако в PAs у Wnt1Cre;RosaNotch животных, мигрирующие NCCs не организованы в различимые потоки и представлены большим числом. Сходным образом, миграция NCC в кардиальный OFT и ENS дефекта у эмбрионов с усиленной передачей сигналов Notch в NCCs. Эти данные подтверждают, что передача сигналов Notch необходима для собственно миграции энтерических NCCs (Okamura and Saga, 2008). Поэтому было бы интересно исследовать роль передачи сигналов Notch при болезни Гиршпрунга, характеризующейся отсутствием происходящих из NCC ганглиев в кишечнике (Southard-Smith et al., 1998). Итак, эти данные показывают, что соотв. уровни передачи сигналов Notch необходимы для нормальной миграции и клеточного вклада NCC в сердце и ENS.

В DRG активация Notch в NCCs приводит к повышенной пролиферации, тогда как потеря передачи сигналов Notch приводит к снижению пролиферации NCC. Эти результаты подчеркивают клеточно автономную роль передачи сигналов Notch, способствующей клеточной пролиферации всех типов клеток, происходящих из NC . Сходным образом, активация пути Notch за счет форсированной экспрессии NICD способствует клеточной пролиферации, а ингибирование Notch снижает клеточную пролиферацию в культивируемых NCCs перепела (Wakamatsu et al., 2000). Во многих случаях повышенная передача сигналов Notch поддерживает мультипотентные клетки предшественники в пролиферативном, недифференцированном состоянии, это очевидно в Wnt1Cre;RosaNotch NCCs (Hansson et al., 2004; Hurlbut et al., 2007). В некоторых типах клеток повышенная передача сигналов Notch ведет к клеточной гибели, но мы не наблюдали изменений в апоптозе в результате манипуляций с передачей сигналов Notch в NCCs. У Wnt1Cre;RBP-Jf/f мышей, очевидно, что пониженная пролиферация NCC приводит к общему уменьшению количества NCCs, приводя к характерным кардиальным и фарингеальным нарушениям. ассоциированным с дефицитом NCC. Напротив, усиление передачи сигналов Notch приводит к усилению пролиферации и к большему количеству клеток, соседствующих с нервной трубкой и PAAs. Однако эти клетки обнаруживают дефицит миграции и вклада в кардиальный OFT и ENS, это, скорее всего, вызывает аномалии. характерные для дефицита NC у Wnt1Cre;RosaNotch животных.

Терминальная дифференцировка NCC происходит, когда клетки достигают мест своего предназначения. Дифференцировка гладких мышц из NCCs необходима для стабилизации PAAs , а в отсутствие гладких мышц, PAAs быстро дестабилизируются и становятся гипопластичными и апластичными (Waldo et al., 1996). Здесь мы показали, что избыток или потеря передачи сигналов Notch в кардиальных NCCs ведет к уменьшению дифференцировки гладкомышечных клеток, производных клеток NC во множественных PAAs. Впервые продемонстрировано, что высокие уровни активированной передачи сигналов Notch в производных NC ингибируют дифференцировку гладкомышечных клеток в PAAs засчёт клеточно автономного механизма in vivo. Это ингибирование может осуществляться посредством индукции с помощью Notch Hairy/Enhancer-of-split, родственного с транскрипционными факторами с YRPW мотивом (Hey), который, как было установлено, ингибирует myocardin в культурах гладкомышечных клеток (Gridley, 2007; Proweller et al., 2005; Tang et al., 2008). Потеря RBP-J также ведет к снижению дифференцировки происходящих из NC гладких мышц в PAAs, что согласуется с исследованиями культур, продемонстрировавших, что Notch индукция транскрипционной активности RBP-J способствует экспрессии генов дифференцировки гладких мышц (Tang et al., 2010). Наблюдаемое снижение дифференцировки гладких мышц с потерей в NCC RBP-J согласуется с предыдущим исследованием, в котором ингибирование передачи сигналов Notch посредством DNMAML у Pax3Cre мышей приводило к снижению экспрессии генов гладких мышц в субнаборе PAAs (High et al., 2007). Итак, эти исследования демонстрируют, что высокие уровни передачи сигналов Notch ингибируют дифференцировку гладких мышц, тогда как потеря передачи сигналов Notch также ведет к уменьшению дифференцировки гладких мышц in vivo. Следовательно, точные уровни передачи сигналов Notch в кардиальных NCCs необходимы для дифференцировки гладких мышц PAA из пост-миграторных NCCs.

Производные NCC вносят вклад в глиальные и нервные клетки периферической нервной системы, включая и те, что в краниальных ганглиях и DRG, посредством бинарного клеточного выбора судьбы (Taylor et al., 2007). Здесь мы установили, что передача сигналов Notch необходима и достаточна для генерации глиальных клеток краниальных ганглиев и DRG. Кроме того, мы наблюдали, что передача сигналов Notch ингибирует нейрогенез, как показывает потеря нейрональной дифференцировки у мышей с повышенной активностью Notch в производных NCC. Сходным образом, существует очевидная конверсия глиальных предшественников в судьбы нейрональных клеток при потере функции Notch. Уменьшение глиальных клеток у Wnt1Cre;RBP-Jf/f мышей подтверждает, что эндогенная каноническая передача сигналов Notch необходима для обеспечения глиогенеза в DRG, что согласуется с предыдущими сообщениями (Taylor et al., 2007; Hu et al., 2011). В культивируемых NCCs птиц активация Notch супрессирует нейрогенную дифференцировку NCCs и ускоряет глиальную дифференцировку, способствуя экспрессии Sox10, но это не было продемонстрировано ранее in vivo (Lassiter et al., 2010; Morrison et al., 2000; Wakamatsu et al., 2000). Наши данные демонстрируют, что усиление передачи сигналов Notch в NCCs способствует глиогенезу посредством Sox10, также как ингибированию нейрогенеза в краниальных ганглиях и DRG у мышей in vivo. Это впервые продемонстрировано in vivo в системе млекопитающих очевидное переключение судеб клеток предшественников DRG, регулируемое с помощью усиления активности пути Notch. Итак, эти исследования подтверждают механизм, с помощью которого передача сигналов Notch контролирует клеточные судьбы происходящих из NCC клеток DRG мышей посредством обеспечения глиогенеза и ингибирования нейрогенеза in vivo.

Сравнение избыточной экспрессии Notch пути с потерей эндогенной передачи сигналов Notch выявляет множественные роли передачи сигналов Notch в развитии NCC. Мы описали, что передача сигналов Notch регулирует миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выбор клеточных судеб NCC в NC млекопитающих и что пертурбации этих процессов ведут к аномалиям, характерным для neurocristopathies. Врожденные дефекты, ассоциированные с синдромом DiGeorge, включая черепно-лицевые, кардиального OFT и тимуса аномалии (data not shown), все они наблюдаются и у мышей с избытком или потерей передачи сигналов Notch в NC (Lindsay et al., 2001). Родственный дефицит гладкомышечных клеток также наблюдается у людей с CADASIL и Alagille синдромами, которые возникают в результате мутаций генов пути Notch (Gridley, 2003). Следовательно, передача сигналов Notch может выполнять не получившую достаточного признания роль в синдромах с нарушениями нервного гребня у человека и будущие исследования специфических потребностей в передаче сигналов Notch в NC получат потенциал терапевтического использования.