Внеклеточный матрикс у взрослых и эмбрионов не только создает физическое окружение для клеток, но и также влияет на ряд клеточных функций посредством трех принципиальных механизмов. Во-первых, внеклеточный матрикс служит в качестве хранилища для временных компонентов, таких как ростовые факторы, цитокины, хемокины и морфогены. Присутствующие белки связывают некоторые из этих молекул и модулируют их активность и доступность для рецепторов клеточной поверхности (Aszodi et al., 2006). Во-вторых, различные компоненты внеклеточного матрикса могут быть скомбинированы по-разному, чтобы создавать внеклеточную среду со специфическим тканевыми характеристиками. Напр., специфический состав внеклеточного матрикса может облегчать пролиферацию и миграцию клеток или может создавать физический барьер, которые препятствует движению клеток и тканевой регенерации. В-третьих, большинство, если не все, компоненты матрикса, взаимодействуют с клеточными рецепторами, влияя на адгезию и миграцию клеток. По этой причине клетки вместе с внеклеточным матриксом могут рассматриваться как морфогенетические единицы во время эмбриогенеза.
Активное взаимодействие между клетками и их внеклеточным матриксом обычно достигает кульминации при внутриклеточных событиях, связанных с каскадами сигнальной трансдукции, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов, необходимых для клеточной дифференцировки, пролиферации и жизнеспособности (Toole, 2000; Aszodi et al., 2006). В частности, glycosaminoglycan hyaluronan, один из ключевых компонентов внеклеточного матрикса позвоночных, является важным в динамических клеточных системах, таких как развивающийся эмбрион (Camenish et al., 2000; Toole, 2001; Ori et al., 2006; Li et al., 2007; Matsumoto et al. 2009; Tammi et al., 2011), репарация ран тканей и регенерация (Jiang et al., 2007; Contreras et al., 2009), воспалительные процессы (Hascall et al., 2004; Jiang et al., 2011) и туморогенез (Toole and Slomiany, 2008; Misra et al., 2011).
В данном исследовании мы обратились к вопросу, необходимы ли hyaluronan и его рецептор CD44 для миграции краниальных клеток нервного гребня (NCC) и процессов дифференцировки, участвующих в черепно-лицевом морфогенезе. Краниальный нервный гребень это уникальная эмбриональная структура, создающая миграторную популяцию мультипотентных клеток, возникающая на краю нервной трубки. Во время нейруляции клетки краниального NCC отсоединяются и мигрируют в бранхиальные дуги. Когда они достигают своих мишеней, то NCC вносят вклад в разные типы клеток, включая краниальные ганглии, пигментные клетки, черепно-лицевую мезенхиму и элементы скелета головы. Хотя известны многие элементы регуляторной сети, участвующие в черепно-лицевом морфогенезе, многие аспекты межклеточных и клетка-внеклеточный матрикс взаимодействий всё ещё неясны. Поэтому необходимо определить роль компонентов сети внеклеточного матрикса, которые вносят вклад в сложную серию событий, управляющих черепно-лицевым морфогенезом. Фактически возникновение онтогенетических ошибок ведет к черепно-лицевым аномалиям, которые у человека составляют треть от всех врожденных дефектов (Taneyhill and Bronner-Fraser, 2005; Etchevers et al., 2006; Tobin et al., 2008).
DISCUSSION
Благодаря подходу антисмысловых morpholino oligos, мы способны модулировать количество hyaluronan во внеклеточных пространствах краниальныхl NCC, подчеркивая, что hyaluronan синтезируется с помощью Has1 и Has2, а также, что CD44 рецептор играет критическую роль в процессах миграции и дифференцировки черепно-лицевого скелета. Во многих in vitro и in vivo клеточных системах было продемонстрировано, что hyaluronan участвует в миграции и дифференцировке клеток (Bronner-Fraser, 1993; Toole, 1998), но несмотря на огромное количество исследований миграции краниальных NCC механизмы контроля, вклады компонентов внеклеточного матрикса в этот процесс всё ещё неполны.
Мы показали, что Has1, Has2 и CD44 мРНК обладают динамическим профилем экспрессии во время развития краниальных NCC. Анализ экспрессии генов, а также визуализация hyaluronan на тканевых срезах, показывают, что мигрирующие NCC внедрены во внеклеточный матрикс, богатый hyaluronan, и что они транскрибируют CD44 на всех ступенях миграции. Наше исследование показало, что краниальные NCC после миграции экспрессируют мРНК как Has1, так и Has2, тогда как пре-хондрогенные краниальные NCC продуцируют hyaluronan только посредством Has2. Фактически экспрессия Has1 быстро подавляется в дифференцированных хондробластах. Во время терминальных ступеней дифференцировки экспрессия Has2 быстро снижается, подтверждая, что пониженные концентрации hyaluronan в околоклеточном матриксе, окружающем хондроциты могут быть необходимы для осуществления конденсации и корректной сборки хондроцитов, которыеиз происходят во время формирования как мышц, так и хрящей эмбриональных конечностей (Toole, 1991).
Подавление Has1 ведет к задержке миграции краниальных NCC. Интересно, что даже если Has2 транскрибируется тканью, окружающей мигрирующие NCC, то эмбрионы с подавленной функцией Has2 обнаруживают ту же самую задержку миграции NCC, что и у эмбрионов с подавлением Has1. Эти находки показывают, что внеклеточные пространства, заполненные hyaluronan, важная потребность для миграции краниальных NCC. Наши данные также подчеркивают, что две hyluronan synthases не перекрываются функционально, поскольку истощение активности одной синтазы не компенсируется активностью др. Это согласуется с описанием драматического фенотипа Has2 нулевых мутантных мышей, у которых активность Has1 и Has3 недостаточна, чтобы позволить эмбрионам выживать и развиваться нормально (McDonald and Camenish, 2002).
Hyaluronan может влиять на клеточную миграцию, внося вклад в поддержание гомеостаза внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс, фактически, поддерживается высоко гидратированным, это создает расширенные внеклеточные пространства, пригодные для миграции краниальных NCC (Toole and Trelstad, 1971; Brecht et al., 1986). Более того, изменения в корректной супрамолекулярной сети, создаваемые взаимодействиями hyaluronan с др. молекулами внеклеточного матрикса, должны изменять баланс между пригодными и не пригодными условиями. которые необходимы для гарантии успешной миграции нервного гребня (Perris et al., 1991; Schmalfeldt et al., 2000; Bradbury et al., 2002). Интересно, что во время развития мышей hyaluronan и протеогликан внеклеточного матрикса versican действуют синергично и оба необходимы для развития сердца (Mjaavedt et al., 1998; Camenish et al., 2000). Мы также показали, что профиль пространственно-временной экспрессии гена versican в развитии Xenopus перекрывается с таковым Has2 во время развития краниальных NCC (Casini et al., 2008). Эти находки указывают на то, что образование комплексов hyaluronan-versican может помогать миграции краниальных NCC. Hyaluronan может способствовать локомоции клеток , взаимодействуя также с рецепторами клеточных мембран, которые модулируют клеточную слипчивость и запускают передачу внутриклеточных сигналов (Bourguignon et al., 1997; Banerji et al., 1999; Tzircotis et al., 2005). Обнаружение, что эмбрионы с подавлением CD44 имеют фенотип задержки миграции NCC, сходный с тем, что наблюдается у эмбрионов, истощенных по Has1 и Has2, указывает на то, что CD44 может обеспечивать инструктивное влияние на hyaluronan, которое инициирует сигнальные пути и тем самым способствует миграции NCC.
Синтез гиалуронана также необходим во время пост-миграторных стадий краниальным NCC. Потеря функции или Has1 или Has2 ведет к снижению количества hyaluronan в околоклеточном матриксе пост-миграторных краниальных NCC. Это сопровождается повышением величины апоптоза скелетогенных предшественников на стороне инъекции или Has1 или Has2 морфантов. Следовательно, hyaluronan необходим для жизнеспособности пост-миграторных краниальных NCC. Эти эффекты могут быть обусловлены отсутствием структурного поддерживающего эффекта со стороны внеклеточного матрикса, истощенного по hyaluronan, или нарушением активации внутриклеточных сигналов, которые необходимы для клеточного выживания. Фенотип Has1- и Has2-истощенных эмбрионов был далее проанализирован с помощью анализа скелетных элементов, происходящих из нервного гребня, на поздних стадиях развития (stage 49). Морфология скелета оказывалась существенно измененной или за счет уменьшения (легкое фенотипическое отклонение) или отсутствия (тяжелый фенотип), некоторых скелетных элементов.
Морфология, происходящих не из нервного гребня, basihyal и отического капсулярного хрящей не изменялась даже в наиболее тяжелых случаях, указывая, что подавление Has1 и Has2 воздействует только на хрящи, происходящие из нервного гребня.
Хотя фенотипы эмбрионов с подавленным Has1 или Has2 сходны, они имеют разную пенетрантность. Т.к. мРНК Has2 экспрессируется в дифференцирующихся хондробластах, то можно предположить, что hyaluronan, продуцируемый с помощью Has2, может быть необходим не только для миграции и жизнеспособности краниальных NCC, но и также для скелетогенной дифференцировки.
Сравнение данных, полученных при удалении Has1 и Has2 в отдельности или вместе строго подтверждают гипотезу, что во время развития две синтетазы функционально не перекрываются, но что они работают совместно, обеспечивая корректную миграцию и дифференцировку NCC.
Мы также подтвердили, что в то время как подавление CD44 не обнаруживает достоверного эффекта на поздние события жизнеспособности краниальных NCC он играет роль в ранних событиях миграции краниальных NCC. Этот результат согласуется с анализом CD44 нулевых мутантных мышей, которые неожиданно не обнаруживали крупных онтогенетических дефектов (Protin et al., 1999). Хотя предыдущие исследования продемонстрировали, что в клеточных системах in vitro hyaluronan предоставляет клеткам защиту от апоптоза благодаря взаимодействию с hyaluronan рецептором CD44 (Kaneko et al., 2000; Ozeki et al., 2001; Ohwada et al., 2008), наши находки, скорее всего, указывают, что в более сложных in vivo системах, др. hyaluronan рецепторы могут компенсировать деплецию CD44 (Nedvetzki et al., 2004). В этом отношении важно отметить, что RHAMM, др. hyaluronan рецептор, экспрессируется в краниальных NCC во время развития Xenopus (Casini et al., 2010).
Благодаря полезности hyaluronan геля и каркасов эта экстраординарная молекула может теперь быть использована во многих разных клинических подходах (Prestwich and Kuo, 2008). Наши находки могут помочь разработке новых стратегий по коррекции или минимизации дефектов черепно-лицевого развития.
