Мы исследовали сегрегацию нейрального и меланоцитного клонов, происходящих из NC. Используя стабильную линию для отслеживания предшественников, экспрессирующих Foxd3 энхансер, мы установили, что в ранние NT презумптивные дорсальные меланобласты включены в Foxd3-позитивный нейроэпителий, но отделяются от этого клона прежде выхода из гребня, тогда как нейральные производные сохраняют экспрессию Foxd3. Это согласуется с поздним подавлением Foxd3 в дорсальной части NT и отсутствием его в меланобластах, при этом он сохраняется в нейральных предшественниках вплоть до дифференцировки (Dottori et al., 2001; Kos et al., 2001; Krispin et al., 2010b; Labosky and Kaestner, 1998). Следовательно, прогрессивное сужение домена транскрипции Foxd3, наблюдаемое в дорсальной части NT во время развития NC результат двух разных процессов. Во-первых, действительно отсоединяются нейральные предшественники, которые экспрессируют этот ген (Krispin et al., 2010b) и. во-вторых, он подавляется в презумптивных меланобластах (this study).

Кроме того, наши находки подчеркивают наблюдение, что Foxd3 также является ранним маркером клеток RP, происходящих от вентральных презумптивных меланобластов в дорсальной части NT (Krispin et al., 2010b). Следовательно, перед началом началом выделения из нейрального зачатка NC, Foxd3 в дорсальной части NT не является NC-специфическим маркером. Хотя клон предшественников. экспрессирующих Snail2 и Sox9 не был отслежен непосредственно, выше приведенные находки, скорее всего, имеют отношение к этим генам, которые обладают сходной динамикой и действуют выше Foxd3. Отметим, использование специфического Foxd3 репортера также позволяет нам определить, что сегрегация между RP, меланоцитами и нейральным клоном происходит раньше, чем это предполагалось, поскольку и меланобласты и RP подавляют Foxd3 ещё до отделения от первого. Более того, клональный анализ дорсальной части NT показал. что в это время генерируется потомство, содержащее или клетки типа RP или меланоцитов, это также подтверждает раннее ограничение судеб (Krispin et al., 2010b).

В этой связи недавнее исследование частично оспаривает это мнение раннего ограничения судеб при анализе исходов премиграторных предшественников, расположенных в разных дорсовентральных позициях NT птиц (McKinney et al., 2013). Они сообщили, что за исключением симпатических предшественников, выбор путей миграции и и мест назначения не коррелирует с позицией источника клеток NC в NT, это ведёт к заключению об отсутствии ограничения судеб для сенсорных предшественников и меланоцитов. Возможными различиями между этим сообщением и сообщением Krispin может заключаться в широком круге стадий, сведенных вместе (19-35 сомитов) в исследовании McKinney's. Т.к. дорсальные предшественники в NT прогрессивно смещаются вентродорсально перед эмиграцией, как сообщается Krispin et al. (Krispin et al., 2010b) и подтверждается McKinney et al. (McKinney et al., 2013), то дорсальная часть NT облдает очень динамичным поведением, при этом разные предшественники временно находятся в этой области в разное время. Это влияет на то, что судьба относительно вентральных предшественников, маркированная на ранней стадии, будет эквивалентной таковой для дорсальных предшественников, меченных на более поздних стадиях. Др. словами, мечение дорсальной зоны в пределах нескольких возрастов вместо мечения строго по стадиям будет приводить ко многим судьбам. Кроме того, принимая во внимание их интерпретацию, клональный подход д. гарантировать настоящие изменения существующий ограничений судеб в клетках NC перед миграцией.

Приведенные выше находки ставят несколько вопросов. Во-первых, какова роль Foxd3 в раннем нейроэпителии и в производных, которые имеют продолжительную его экспрессию? Во-вторых, существуют ли механизмы, ответственные за его подавление в пигментных и RP предшественниках? У рыбок данио и мышей потеря функции Foxd3 ведет к отсутствию специфических производных NC, но не к нарушению спецификации NC (Arduini et al., 2009; Cooper et al., 2009; Lister et al., 2006; Montero-Balaguer et al., 2006; Mundell and Labosky, 2011; Stewart et al., 2006; Teng et al., 2008). Это указывает, что Foxd3 регулирует поддержание, скорее всего, чем спецификацию NC (но см. Pohl and Knochel, 2002; Sasai et al., 2001). Kos et al. (Kos et al., 2001) сообщили, что у птиц, morpholinos против Foxd3 вызывает в ранних клетках вступление на дорсолатеральный путь, правда фенотип клеток не был отслежен; in vitro увеличенная пропорция меланоцитов описана, но отвечающий за это механизм не исследован. Имеющиеся результаты показывают появление признаков меланоцитов в дорсальной части NT и в периферических ганглиях эмбрионов мыши, лишенных активности Foxd3. Наши результаты согласуются с результатами потери функции Foxd3, это подтверждает сдвиг с нейральной в мезенхимную судьбу (Mundell and Labosky, 2011). Следовательно, помимо поддержания состояния предшественников и необходимости для жизнеспособности клеток Foxd3 играет жизненно важную роль в репрессии обычного меланогенеза, т.к. преждевременная экспрессия признаков пигмента появляется в проспективных меланоцитах внутри NT у мутантов Foxd3. Следовательно, активность Foxd3 необходима для поддержания нейральных предшественников NC, и она своевременно подавляется в NT, что обязательно для развития меланоцитов (Fig. 8). В соответствии с этим гибель нейральных предшественников у Foxd3 мутантов (Teng et al., 2008) может быть результатом эктопической спецификации в пигментные клетки в эктопических местах, включая премиграторный домен, отражая независимую роль Foxd3 для жизнеспособности клеток. Дополнительной функцией Foxd3 является стимуляция клеточных судеб глиальных и Шванновских клеток, это согласуется с поддержанием его экспрессии в этих клонах (Kelsh et al., 2000; Kos et al., 2001). Это мнение исходит из экспериментов с избыточностью функции у птиц, где проспективные меланоциты оказались способны менять свой качественные особенности в P0 и Fabp7-экспрессирующие клетки (this study and Kos et al., 2001) и подавлять Ednrb2 (this study), и из данных по потере функции у мышей, когда предшественники DRG глии и SC вместе с нервами подвергались массивному меланогенезу и были неспособны мигрировать (this study) (E.N. and C.K., unpublished). Следовательно, активность Foxd3 влияет на выбор между глией и меланоцитами как в премиграторном NC, так и в предшественниках DRG и SC в соответствии с существованием предполагаемых бипотентных глия-меланоцит предшественников (see Introduction). Напротив, развитие нейронов подавляет эндогенный Foxd3 (Dottori et al., 2001). Мы полагаем, что их наблюдение неспособности реагировать на избыток Foxd3 функция поздней стадии, исходя из того факта, что они сегрегировали от клона Foxd3+ раньше, чем их глиальные аналоги. Отмечается отсутствие эктопического меланогенеза в симпатических ганглиях, указывающее на дифференциальную потребность в активности Foxd3 для разных производных NC. Альтернативно, sympathoblasts могут подвергаться преждевременному меланогенезу во время миграции; т.к. их путешествие к месту назначения самое длинное, это может помешать им достигать области около аорты. Итак, эти результаты подтверждают, что Foxd3 играет специфическую и дифференциальную роль на последовательных стадиях развития NC. Fig. 8.

A minimal dynamic regulatory network underlying early neural versus late melanocyte development from the NC. Snail2, Sox9 and Foxd3 are transcribed in the dorsal NT at an early stage where they promote neural development while inhibiting melanogenesis. At a later stage, expression of these genes is lost upon emigration of the neural progenitors. Of these three genes, Foxd3 is both carried by the migrating neural precursors and downregulated in prospective melanoblasts while still resident in the NT (this study). The factors responsible for downregulation of the network (red X) remain to be elucidated. Consequently, inhibition of Mitf and Ednrb2 transcription is removed and melanocyte development (both specification and dorsolateral migration, respectively) begins.

Т.к. Sox9 и Snail2: (1) сходным образом ингибируют меланогенез и собственно дорсолатеральную миграцию клеток; (2) обнаруживают то же самое динамическое поведение, что и Foxd3 в дорсальной части NT; и (3) действуют в этом контексте выше Foxd3, чтобы обеспечивать его экспрессию, то вопрос о механизмах, отвечающих за подавление Foxd3 должен фактически ставиться ко всем трем факторам этой иерархии (Fig. 8). BMP4 является кандидатом на роль регуляции уровней экспрессии выше приведенных генов, поскольку BMP4 поддерживает их транскрипцию (Sela-Donenfeld and Kalcheim, 1999; Tribulo et al., 2003), и при этом прогрессивный выход нейральных предшественников, а домен экспрессии мРНК Bmp4 в дорсальной части NT становится ограниченным узкой полосой, подтверждая, что его эффективная концентрация снижается. Несмотря на более низкую концентрацию или ранги активности BMP4, они могут быть всё ещё достаточны для поддержания транскрипции Wnt1 в дорсальной части NT (Burstyn-Cohen et al., 2004; Chesnutt et al., 2004), это может влиять на развитие меланоцитов (Jin et al., 2001), и может быть недостаточным для сохранения транскрипции Sox9, Snail2 и Foxd3. Др. механизм может быть связан с изменениями в межклеточных взаимодействиях и/или прогрессивной потерей мультипотентных свойств самой NT во время отслоения NC. Это может затрагивать транскрипцию специфических генов, чья активность необходима для поддержания неспецифицированного состояния. У рыбок данио histone deacetylase1, как было установлено, необходима непосредственно и косвенно, чтобы репрессировать Foxd3. Действует ли это благодаря регуляции хроматиновой структуры, которая в свою очередь влияет на экспрессию генов, пока неизвестно (Ignatius et al., 2008). Было бы интересно проверить, действует ли histone deacetylase1 в ответ на факторы, происходящие из дорсальной части NT, такие как BMP4 и Wnt1. Сходным образом, метилирование промотора Foxd3 может объяснить наблюдаемое его подавление (Cheng et al., 2013).

Становится ясным, что Foxd3-зависимая неспособность развития меланоцитов результат прямого или косвенного ингибирования Mitf (Curran et al., 2010; Curran et al., 2009; Ignatius et al., 2008; Thomas and Erickson, 2009). Наши данные подтверждают и расширяют эти результаты путем помещения Foxd3 иерархически ниже Snail2 и Sox9 в этом контексте, тем самым идентифицируется минимальная функциональная сеть (Fig. 8). Реципрокно мы также наблюдали, что Mitf ингибирует транскрипцию трех генов, подтверждая, что как только начинается экспрессия Mitf, инициируется дифференцировка меланоцитов за счет неспецифицированных или нейральных предшественников. Поскольку отсутствие Foxd3 ведет к меланогенной дифференцировке, то возникает вопрос, является ли состояние меланоцитов самопроизвольным (default) в развитии NC на определенных уровнях оси.

Более того, мы сообщили, что у эмбрионов птиц миграторный фенотип вызывается непрерывной экспрессией Foxd3, вызываемый в результате репрессии с помощью Foxd3 транскрипции Ednrb2. Не смотря на то, что Foxd3 контролирует Mitf и Ednrb2, мы показали, что пути, контролируемые с помощью последних белков могут быть не связаны. Напр., эктопическая экспрессия Mitf в нейральных предшественниках, индуцирует маркеры меланоцитов без нарушения их оригинальной вентральной миграции. В самом деле, Mitf лишь минимально усиливает активность Ednrb2 в NT в противовес к культуре нейросетчатки, где Mitf индуцирует Ednrb2 (Planque et al., 2004). Соотв., Ednrb2 склоняет нейральные предшественники к следованию по латеральному 'melanocytic' пути, хотя они всё ещё проявляют нейральные признаки и усиливают активности Mitf, это подтверждает мнение, что приобретение инициальной судьбы не зависит от миграторного окружения (Krispin et al., 2010b). В соответствии с этим, преждевременное вступление клеток NC, выделенных из 'старых' NT эксплантов, на дорсолатеральный путь молодых хозяев было интерпретировано как отражение детерминации в клон меланоцитов (Erickson and Goins, 1995). В свете новых данных, мы интерпретировали эти результаты, что, скорее всего, трансплантированные клетки экспрессируют, по крайней мере, Ednrb2, который достаточен для прямой дорсолатеральной миграции (Harris et al., 2008; Krispin et al., 2010b). Следовательно, не смотря на одновременную экспрессию после подавления Foxd3 и отсоединения меланобластов, Mitf и Ednrb2 выполняют разные роли (Fig. 8). У мышей потеря Foxd3 изменяет спецификацию без соотв. изменений в миграции, пока механизмы, связанные с обоими процессами, скорее всего, отличаются от тех, что у птиц, поскольку Ednrb2 является специфичным для птиц, а у мышей Ednrb экспрессируется как в вентральном, так и дорсолатеральном пути (Dupin and Le Douarin, 2003); это указывает на то, что дополнительные рецепторы могут иметь отношение к ведению миграции мышиных меланоцитов.