Stem cells and Notch signaling - from simplicity to complexity

Тканевые стволовые клетки (SCs) существуют у большинства эмбрионов и взрослых организмов и в целом определяются как клетки, обладающие способностью к самообновлению и способностью генерировать все типы клеток данного органа. Во время развития они дают все клоны определенной ткани, тогда как у взрослых они ответственны за поддержание тканевого гомеостаза и могут быть активированы после повреждения, чтобы регенерировать поврежденную ткань. Баланс между самообновлением и дифференцировкой находится под строгим контролем, чтобы позволить соотв. развитие и избежать неконтролируемого роста, который может приводить к раку. Обширные исследования соматических SCs выявили, что эти процессы регулируются с помощью ограниченного количества эволюционно консервативных сигнальных каскадов - один из которых это сигнальный путь Notch (Box 1 and Table 1).

Box 1. An overview of the Notch pathway

The canonical Notch pathway uses paracrine cell-to-cell contact and converts this interaction directly into changes of gene expression. Notch signaling is initiated through the interaction of a receptor on the signal-receiving cell and a ligand on the neighboring signal-sending cell (see Table 1 for receptors, ligands and DNA-binding components of different specie). Upon binding to any of the Delta-Serrate LAG2 (DSL) ligands, the Notch receptor is activated by a cascade of proteolytic cleavages (Bray, 2006; Kopan and Ilagan, 2009). Crucially, ?-secretase-mediated release of the Notch intracellular domain (NICD) from the cell membrane results in its translocation into the nucleus to induce target gene transcription, via interactions with DNA-binding proteins of the CSL family (CBF1 or RBPJ in humans; Suppressor of hairless [Su(H)] in Drososphila; LAG in Caenorhabitis elegans; RBP-J in the mouse) (Table 1) (Bray, 2006). Although there are multiple Notch target genes, the best-characterized are the basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptional repressors of the Hairy enhancer of split (Hes) and Hairy-related (Hrt) protein families (Iso et al., 2003).

В последние годы растут доказательства сигнальных событий Notch, которые не нуждаются ни в классических DSL лигандах, ни в CSL комплексе транскрипционных медиаторов. Кроме того, др. неканонические сигналы, такие как сигнальная трансдукция без расщепления рецепторов или взаимосвязи с др. сигнальными путями, привлекают всё больше внимания (Heitzler, 2010).

Table 1. Across species: the basic components of the Notch signaling pathway

The Notch signaling pathway is highly context and tissue specific

Каскад Notch обнаруживает уникальный способ действия и распознается как один из немногих сигнальных путей, которые неоднократно используются во многих онтогенетических процессах в эмбриональных и взрослых тканях. Детали сигнального механизма многократно рассматривались в обзорах (see Bray, 2006; Kopan and Ilagan, 2009; Fortini, 2012). Упрощенное представление о Notch пути представлено в Box 1 и Fig. 1. Не смотря на кажущуюся простоту этого пути или благодаря этому Notch рецепторы и лиганды испытывают влияние со стороны широко спектра посттрансляционных модификаций и др. клеточных процессов, которые строго модулируют активность пути Notch в специфических онтогенетических контекстах. Эта контекст-зависимая активность Notch может поэтому управлять многочисленными аспектами развития многоклеточных эукариотических организмов и недавно была связана с судьбами стволовых клеток и поддержанием эмбриональных и взрослых тканей (Liu et al., 2010a; Bigas and Espinosa, 2012).

Fig. 1.

Notch in neural SC development and cell fate decisions

Исследования на Drosophila часто предоставляют важные образцы процессов самообновления и дифференцировки позвоночных. В самом деле, первые доказательства, что передача сигналов Notch может участвовать в регуляции нейральных SCs (NSCs) и принятии решений о судьбе нижестоящих клонов получены в ранних исследованиях на плодовых мушках. Во время развития ЦНС и ПНС Drosophila, передача сигналов Notch специфицирует индивидуальные клетки среди эквипотентного кластера в эктодерме, которые становятся нейральными предшественниками: нейробластами (NBs) в ЦНС (Artavanis-Tsakonas et al., 1991) или клетками предшественников сенсорных органов (SOP) в ПНС (Furukawa et al., 1992; Schweisguth and Posakony, 1992). Сегрегация клеточных клонов NB и SOP инициируется с помощью стохастических событий, которые приводят к тому, что индивидуальные клетки экспрессируют высокие уровни Notch лиганда Delta по сравнению со своими соседями. После этого активация каскада Notch в клетках, окружающих эти, ведет к репрессии пронейральных генов в презумптивных не нейральных клетках. Т.к. экспрессия Delta сама регулируется с помощью пронейральных транскрипционных факторов, то это создает петлю обратной связи, которая поддерживает экспрессию пронейральных генов в Delta-экспрессирующих клетках и не наблюдается экспрессии этих факторов в соседних не нейральных клетках (Artavanis-Tsakonas et al., 1991; Bray, 1998). В развивающихся эмбрионах, которые лишены функции Notch, все клетки внутри пронейрального кластера развиваются в NBs или SOP клетки, презентируя тем самым нейрогенный фенотип (Poulson, 1937; Knust and Campos-Ortega, 1989). Т.к. спецификация судьбы обеспечивается посредством передачи сигналов между соседними клетками, то этот процесс обозначается как 'латеральное ингибирование' или 'латеральная спецификация клеточных судеб' (Fig. 2A).

Fig. 2.

Эти ранние исследования показали, что Notch действует, чтобы специфицировать судьбы специфических клеток среди эквипотентных клеток, которые д. выбрать, по крайней мере, одну из двух судеб. Однако также утвердилось мнение, что Notch может обладать потенциалом ингибировать дифференцировку и тем самым сохранять стволовые клетки и клетки предшественники. В соотв. с этим избыточная экспрессия Delta 1 у ранних эмбрионов Xenopus (Coffman et al., 1993) или в развивающейся сетчатке эмбрионов кур (Henrique et al., 1997) ингибирует продукцию нейронов, тогда как экспрессия доминантно-негативной формы Delta 1 вызывает избыток продукции нейронов (Austin et al., 1995; Chitnis et al., 1995; Henrique et al., 1995; Henrique et al., 1997). Активация передачи сигналов Notch в предшественниках сетчатки крыс также ингибирует дифференцировку, но индуцирует экспрессию маркеров Muller глии и вызывает аномальный рост (Bao and Cepko, 1997), подтверждая, что Notch может блокировать дифференцировку нейронов, но способствует пролиферации, а также некоторым аспектам дифференцировки глии (see below). Это были первые исследования на позвоночных, чтобы показать, что передача сигналов Delta-Notch контролирует 'выбор' клеток оставаться предшественниками или дифференцироваться в нейроны. Недавний анализ сетчатки позвоночных расширил эти ранние наблюдения, внеся пространственный компонент в наше понимание того, как передача сигналов Notch регулируется (see Box 2).

Box 2. Notch signaling moving in waves

More recent work from the zebrafish retina has provided a deeper geometric understanding of how Notch signaling is triggered between ligand-expressing neurons and receptor-expressing progenitors (Del Bene et al., 2008). The nuclei of retinal progenitors move between the apical and basal surfaces of the neuroepithelium in phase with their cell cycle, a process known as interkinetic nuclear migration (INM). Interestingly, Notch receptors and ligands are expressed in a graded fashion along the apicobasal axis, such that Notch receptor expression is higher apically, whereas ligand expression predominates in the basal region of cells. Consistent with this expression pattern, Notch activity is highest on the apical side of the neuroepithelium. Zebrafish mutants with altered INM, where nuclei migrate faster and deeper into the basal part of the neuroepithelium, will receive fewer Notch signals, resulting in premature cell cycle exit and increased neuronal differentiation (Del Bene et al., 2008). Additional work on the zebrafish retina suggested that Notch signaling is not only influenced by the apical-basal polarity of the neuroepithelium, but that Notch itself is involved in setting up this polarity (Ohata et al., 2011). In view of these data, it is tempting to speculate that such polarity of the neuroepithelium is used to coordinate Notch signaling with cell division and differentiation within the spatial context of the developing tissue.

Дополнительные доказательства, подтверждающие предположение, что передача сигналов Notch ингибирует дифференцировку нейронов, получены в исследованиях по потере и избыточной функции в развивающемся головном мозге мышей. Кондиционное инактивирование Notch1 в регионе между средним и задним мозгом нервной трубки приводит к преждевременной нейральной дифференцировке, сопровождаемой апоптозом, уменьшением количества нейронов в мозжечке. Формирование глиальных клеток также затрагивается (Lutolf et al., 2002). Сходным образом, потеря предшественников и преждевременная дифференцировка отмечены у мышей с кондиционным удалением или Notch1 или RBP-J в нейральных предшественниках (Yang et al., 2004; Imayoshi et al., 2010). Сходный фенотип наблюдался после специфичной для неокортекса инактивации mindbomb, E3 ubiquitin лигазы, необходимой для интернализации лиганда в клетках, посылающих сигналы, и для активации Notch после взаимодействия лиганд-рецептор (Itoh et al., 2003; Koo et al., 2005; Yoon et al., 2008a). Комбинированные результаты всех этих мутантных Notch путей подтверждают классическое мнение, что Notch действует, ингибируя нейральную дифференцировку, тем самым сохраняя пул стволовых клеток и клеток предшественников во время развития головного мозга.

Реципрокные эксперименты с избыточной функцией доминантно-активной формы Notch1 или генов мишеней семейства Hes (Hes1, Hes5, Hey1 или Hey2) в развивающемся переднем мозге мыши не только подтвердили, что передача сигналов Notch ингибирует дифференцировку нейронов, но и также выявили его способность способствовать выбору судьбу глиальных клеток (Ishibashi et al., 1994; Gaiano et al., 2000; Ohtsuka et al., 2001; Sakamoto et al., 2003). Анализ постнатальных мышей, у которых Notch был эктопически активирован во время развития эмбрионального головного мозга, выявил присутствие рассеянных и перивентрикулярных астроцитов, подтверждая, что после ингибирования дифференцировки Notch может функционировать в качестве инструмента, способствующего формированию клона астроцитов (Gaiano et al., 2000; Chambers et al., 2001). Нарушенный глиогенез у Rbpj мутантных мышей (Taylor et al., 2007) и дополнительные работы на рыбах и мышах показали, что Notch в самом деле способствует клону астроглии, тогда как дифференцировка олигодендроцитов подавляется (Wang et al., 1998; Grandbarbe et al., 2003; Park and Appel, 2003) - роль, которая, по-видимому, не зависит от функции Notch по поддержанию недифференцированными предшественников нейронов. Пока остается неясным, может ли Notch специфицировать бипотентные глиальные предшественники, чтобы принимать судьбу астроглии в противовес судьбу олигодендроцитов (Grandbarbe et al., 2003). Напротив работа на рыбках данио показала, что кондиционная экспрессия доминантно-активного Notch способствует образованию избытка предшественников олигодендроцитов в вентральной части спинного мозга. Это подтверждает, что Notch способствует выбору судьбы олигодендроцитов, но ингибирует их дальнейшую терминальную дифференцировку (Park and Appel, 2003) (Fig. 2B).

Итак, эти данные демонстрируют, что Notch действует на разных уровнях и в разное время во время развития ЦНС. Первоначально Notch способствует пролиферации предшественников и ингибирует нейрональную дифференцировку, способствуя выбору глиальной судьбы. Затем Notch способствует дифференцировке астроцитов и ингибирует термнальную дифференцировку олигодендроцитов (Fig. 2B). Хотя эти базовые функции приложимы ко всем позвоночных, существуютγ видо-специфческие различия в точной роли пути в регуляции клеточной пролиферации и выбора судьбы (see Table 2A,B). Table 2. Notch signaling in different somatic stem cells - mechanisms and strategies

Notch, asymmetric division and binary decisions

Далее, чтобы подтвердить важность Notch в самообновлении и спецификации клонов, ранние работы на Drosophila установили его роль в асимметричных делениях клеток и то, как это связано с выбором судьбы. В этом контексте асимметричные клеточные деления предопределяют процесс, с помощью которого происходит неравное распределение детерминантов клеточных судеб путем продукции дочерних клеток с двумя разными судьбами или свойствами (Neumuller and Knoblich, 2009). Одним из классических примеров является тот, что в ПНС Drosophila. Как только SOP клетки оказываются сгенерированы внутри пронейрального кластера в эктодерме, они подвергаются трём раундам асимметричных клеточных делений, чтобы сформировать разные типы клеток сенсорных щетинок (Bardin et al., 2004). Асимметричная передача сигналов Notch существенна для индукции бинарных решений о судьбе клеток в ПНС; этот выбор судеб сопровождается регулируемые асимметричным распределением Notch ингибитора Numb (Jan and Jan, 1994) (Fig. 3A,B).

Fig. 3.

Эти и др. результаты привели к генеральной парадигме, что Notch влияет на бинарные решения по выбору клетками судеб из бипотентных клеток предшественников (Dong et al., 2012), показав, что эта концепция асимметричных делений может быть приложима к регуляции самообновления в противовес дифференцировке внутри одного и того же клона - как в случае клеток радиальной глии. Огромное большинство клеток радиальной глии подвергается асимметричным клеточным делениям в развивающейся ЦНС, генерируя базовую самообновляющуюся дочернюю клетку и апикальную клетку, которая склонна дифференцироваться (reviewed by Egger et al., 2011). In vivo time-lapse изображения с разрешением в одиночную клетку в комбинации с клональным анализом индивидуальных глиальных клеток выявили, что Notch регулирует эту дифференциальную судьбу (Dong et al., 2012). Асимметричные клеточные деления в этой системе устанавливаются с помощью прирожденного регулятора полярности partitioning defective protein 3 (Par3). Par3 обеспечивает перемещение mindbomb в апикальную дочернюю клетку и тем самым ограничивает передачу сигналов Notch базальной дочерней клетки. Возникающая в результате дифференциальная активность Notch способствует самообновлению базальной клетки (высокий уровень Notch) и дифференцировке апикальной дочерней клетки (низкий уровень Notch) (Fig. 3C). Это элегантное исследование проиллюстрировало, как подразделяются самообновление и дифференцировка при асимметричных делениях стволовых клеток и клеток предшественников одного и того же клона.

Notch: a key regulator of adult NSCs

В постнатальном или взрослом головном мозге NSCs обнаруживаются в subventricular zone (SVZ) и subgranular zone (SGZ) и они продолжают продуцировать нервные клетки в течение всей жизни. Notch компоненты, хотя и широко экспрессируются во всей ткани головного мозга, обнаруживаются также в клетках SVZ и SGZ, подтверждая. что Notch может регулировать постнатальные NSCs (Stump et al., 2002; Irvin et al., 2004; Givogri et al., 2006). В соотв. с этой возможностью активность Notch была обнаружена в постнатальных и взрослых NSCs, используя разных репортерных мышей (Ehm et al., 2010; Imayoshi et al., 2010; Lugert et al., 2010; Smith et al., 2012). Исследования кондиционной потери и избыточности функции продемонстрировал, что Notch регулирует молчание и выход из клеточного цикла NSCs. В телэнцефалической герминальной зоне взрослых рыбок данио, NSCs осуществляют переходы между молчанием и пролиферацией. Высокая активность Notch, как было установлено, поддерживает NSCs в покоящемся состоянии, тогда как блокирование Notch ведет к огромным делениям NSC, сопровождаемым дифференцировкой и увеличением количества нейронов, зарождающихся у взрослых, что приводит к истощению пула NSC (Chapouton et al., 2010). Это исследование также подтвердило, что передача сигналов Notch в NSCs может контролироваться за счет механизма, сходного с латеральным ингибированием, обеспечивая равновесие между молчанием и генерацией NSC предшественников. Сходные результаты получены у мышей с кондиционным удалением RBP-J во взрослом головном мозге, приводящем к дифференцировке всех NSCs во временно амплифицирующиеся клетки и нейроны. Как результат временно увеличивается нейрогенез, но позднее все NSCs истощаются и нейрогенез полностью исчезает (Ehm et al., 2010; Imayoshi et al., 2010). Эти результаты показывают абсолютную потребность передачи сигналов Notch для поддержания NSCs и для собственно контроля нейрогенеза в эмбриональном и взрослом головном мозге.

Мало известно о том, как передача сигналов Notch регулируется в нише NSC. Jagged 1 (Jag1) экспрессируется эпендимными клетками и астроцитами и необходим для поддержания NSC в раннем постнатальном головном мозге, указывая на эпендимные клетки и астроциты как компоненты ниш (Nyfeler et al., 2005). Поэтому очень возможно, что Jag1 активирует Notch1 в NSCs, предупреждая тем самым дифференцировку и истощение SC. Delta-like 4 лиганд также, по-видимому, способствует генерации клеток нейральных предшественников во взрослом головном мозге крыс (Androutsellis-Theotokis et al., 2006). Др. исследование подтвердило, что NSCs могут регулироваться с помощью взаимного общения между сигнальными путями epidermal growth factor receptor (EGFR) и Notch (Aguirre et al., 2010). Трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие EGFR в нейральных предшественниках, обнаруживают повышенные количества временно амплифицирующихся клеток, преимущественно как следствие EGFR-индуцированной экспансии клеток. Интересно, что это коррелирует со снижением количества NSC и самообновления. Более того, исследование показало, что EGFR-экспрессирующие клетки предшественники д. супрессировать передачу сигналов Notch в NSCs за счет клеточно неавтономного процесса, который ведет к усилению активности Numb, негативного регулятора Notch. Реципрокный фенотип с редуцированными уровнями Numb и усиленным самообновлением NSC наблюдается в клетках от waved 2 мутантных мышей, которые несут точковую мутацию в EGFR тирозин киназном домене, приводя к снижению активности EGFR. Эта работа четко демонстрирует, что взаимодействие между стволовыми клетками и клетками предшественниками участвует в регуляции клеточного гомеостаза в постнатальном головном мозге и использует два специфических сигнальных пути (Aguirre et al., 2010).

Передача сигналов Notch участвует также в опосредованной стволовыми клетками реакции на повреждения. Используя модель повреждения с помощью фокальной ишемии головного мозга, воздействие Delta-like 4, вместе с fibroblast growth factor 2 (FGF2), приводило к улучшению моторных навыков у поврежденных крыс. Контрольные группы, обработанные только или FGF2 или Delta-like 4 не обнаруживали какого-либо улучшения моторных показателей, указывая, что, по крайней мере, в этой модели - передача сигналов Notch кооперирует с таковой FGF2, чтобы индуцировать экспансию нейральных стволовых клеток или клеток предшественников после повреждения (Androutsellis-Theotokis et al., 2006).

Итак, очевидно, что Notch является привратником для взрослых NSCs. Однако, Notch функция во взрослом головном мозге выходит за пределы ключевого регулятора NSCs, т.к. он также участвует в регуляции миграции, выросте нейритов, жизнеспособности и синаптической пластичности нейронов (for reviews, see Ables et al., 2011; Pierfelice et al., 2011).

Notch and muscle SCs

Нейрогенные Notch мутации у Drosophila, как известно, вызывают мышечные дефекты, указывая, что передача сигналов Notch участвует в регуляции миогенеза (Poulson, 1937; Bate et al., 1993). Это мнение был подтверждено два 10-летия тому назад в исследованиях мышиных миобластов клеточной линии C2C12. Избыточная экспрессия Notch intracellular domain (NICD) в C2C12 миобластах или их совместное культивирование с экспрессирующими Jag1 фибробластами, ведет к блокированию дифференцировки мышц, предупреждению образования многоядерных миофибрилл (Kopan et al., 1994; Lindsell et al., 1995).

Muscle development in vertebrates

У позвоночных развитие мышц происходит в трех разных фазах: эмбриональной, плодной и постнатальной. Во время эмбрионального развития мышечные предшественники происходят из сомитов, которые компартментализованы на дермомиотом (дающий скелетные мышцы и частично дермис) и склеротом (из которого происходят кости и ребра). Экспрессия paired-box/homeodomain транскрипционных факторов Pax3 и Pax7 маркирует миогенные стволовые клетки и клетки предшественники в развивающемся дермамиотоме (Kassar-Duchossoy et al., 2005; Relaix et al., 2005). Эти Pax3/7-позитивные клетки инициируют экспрессию muscle regulatory factors (MRFs), включая Myf5 (myogenic factor 5) Mrf4 (Myf6), MyoD (Myod1, myogenic differentiation 1) и Mef2c (myogenic enhancer factor 2C), которые направляют предшественники по пути мышечных клонов (Rudnicki et al., 1993; Edmondson et al., 1994; Kassar-Duchossoy et al., 2004). В дальнейшем мышечные предшественники выходят из клеточного цикла, экспрессируют транскрипционный фактор myogenin и сливаются. чтобы сформировать многоядерные мышечные трубки (Buckingham and Vincent, 2009). На поздних плодных стадиях, Pax3/7-позитивные клетки перемещаются в специфические микроусловия, соседствующие с мышечными волокнами под базальную ламину (Kassar-Duchossoy et al., 2005). Эти клетки, которые произошли от Pax3/7-позитивных клеток дермомиотома, персистируют в покоящемся состоянии у взрослых, где они известны как сателлитные клетки и маркированы постоянной экспрессией Pax7 (Seale et al., 2000) (Schienda et al., 2006) (Fig. 4). Недавнее исследование показало, что Pax7-позитивные сателлитные клетки обладают свойствами SC, т.к. они обладают свойствами давать жизнеспособные мышцы, будучи трансплантированными в переднюю мышцу тибии у Pax7DTR/- мышей (Sambasivan et al., 2011). Более того, эти клетки являются критическими для регенерации мышц: повреждения заставляют покоящиеся сателлитные клетки возвращаться к клеточному циклу, индуцируя пролиферацию миобластов и дифференцировку, а значит и регенерацию потерянных мышечных волокон. Во время этого процесса, формируются новые сателлитные клетки, чтобы восполнить пул SC м гарантировать гомеостаз мышечных клеток (Sambasivan and Tajbakhsh, 2007; Brack and Rando, 2012). Поврежденная мышечная ткань не способна регенерировать после устранения Pax7-позитивных сателлитных клеток, подчеркивая роль этих клеток в регенерации мышц (Sambasivan et al., 2011).

Fig. 4.

Notch regulates SC maintenance in the developing muscle

Ранние эксперименты in vitro по избыточной функции Notch, показали участие передачи сигналов Notch в регуляции мышечных предшественников. Однако убедительные доказательства получены только в исследованиях с потерей функции. Кондиционная инактивация RBP-J в дермомиотоме во время эмбриогенеза ведет к истощению Pax3/7 пула клеток мышечных предшественников, сопровождаемому увеличением MyoD-позитивной популяции в миотоме (Vasyutina et al., 2007). Это вызывает дефицит постнатальных скелетных мышц (Sambasivan et al., 2011). Очень сходный фенотип наблюдается у мышей, обладающих гипоморфным аллелем Notch лиганда Delta-like 1 (Schuster-Gossler et al., 2007). Истощение клеток мышечных предшественников, вызываемое потерей передачи сигналов Notch, может быть устранено с помощью удаления MyoD, хотя сателлитные клетки у этих мышей неспособны занимать соотв. положение между базальной ламиной и плазматической мембраной мышечных волокон (Brohl et al., 2012). Эти данные подтверждают, что передача сигналов Notch не только играет роль в поддержании мышечных предшественников, но и также гарантирует собственно попадание сателлитных клеток в их ниши.

Передача сигналов Notch также участвует в гомеостазе и регенерации у взрослых. Используя Notch репортёрных мышей в комбинации с анализом экспрессии генов мишеней для Notch, был показан путь, чтобы активировать покоящиеся сателлитные клетки (Bjornson et al., 2012). После повреждения, активность Notch подавляется, это выводит клетки из покоя. Потеря RBP-J во взрослых сателлитных клетках негативно влияет на мышечную регенерацию, благодаря преждевременной дифференцировке , а, следовательно, истощению сателлитных клеток. Интересно, что большинство этих клеток дифференцируется без вступления в клеточный цикл (Bjornson et al., 2012; Mourikis et al., 2012) (Fig. 4). Важность передачи сигналов Notch для поддержания сателлитных клеток была также продемонстрирована на старых животных, которые обнаруживали потерю передачи сигналов Notch в мышечных клетках, т.о., из-за истощения пула сателлитных клеток , необходимых для мышечной регенерации. Эктопическая экспрессия Notch во взрослых мышцах восстанавливает регенеративный потенциал сателлитных клеток (Conboy et al., 2003). Т.о., в мышцах, как и в нервной системе, передача сигналов Notch является критической для поддержания самообновляющихся клеток предшественников во время развития и у взрослых.

Mechanistic insights into Notch function in the adult muscle

Как передача сигналов Notch восстанавливает регенеративный потенциал взрослых мышечных клеток или как она ингибирует дифференцировку мышечных стволовых клеток и клеток предшественников, неясно. Однако данные указывают на то, что Notch может регулировать самообновление сателлитных клеток посредством прямой регуляции транскрипции Pax7 (Wen et al., 2012): NICD и RBP-J, как было установлено, связывают RBP-J консенсусные сайты внутри промоторного региона Pax7 (Wen et al., 2012). Конституитивная активация передачи сигналов Notch в сателлитных клетках способствует их самообновлению посредством усиления активности Pax7 и поддерживает их в недифференцированном состоянии за счет супрессии транскрипции MyoD и myogenin посредством Hes и Hey семейств транскрипционных репрессоров (Wen et al., 2012). Ранние исследования показали, что NICD может непосредственно взаимодействовать с Mef2c, блокируя его транскрипционный потенциал, чтобы активировать миогенные гены (Wilson-Rawls et al., 1999). Сходным образом, Notch мишень Hey1 транскрипционно репрессирует ключевые миогенные гены, включая myogenin и Mef2c, предупреждая дифференцировку мышечных предшественников в многоядерные мышечные трубки (Buas et al., 2010).

Передача сигналов Notch также влияет на миогенез благодаря кооперации с др. сигнальными путями. Передача сигналов bone morphogenetic protein (BMP) вызывает пролиферацию сателлитных клеток и играет роль в блокировке их преждевременной дифференцировки (Ono et al., 2011). В этом контексте, передача сигналов BMP4/SMAD1 способствует Notch-зависимой активации Hes1 и Hey1, чтобы ингибировать дифференцировку сателлитных клеток и C2C12 миобластов (Dahlqvist et al., 2003). Кроме того, условия гипоксии блокируют мышечную дифференцировку и способствуют недифференцированному состоянию клеток благодаря непосредственному взаимодействию hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) с NICD, вызывая экспрессию Hes1 и Hey2 (Gustafsson et al., 2005).

Наконец, взаимодействие передачи сигналов Notch и Wnt в сателлитных клетках, по-видимому, регулирует переход от недифференцированного к дифференцированному состоянию во время постнатального миогенеза. В сателлитных клетках с высоким уровнем передачи сигналов Notch и низким Wnt, glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) облегчает переключение на низкую активность Notch и высокую активность Wnt, это затем ведет к мышечной дифференцировке. Ингибирование передачи сигналов Notch в регенерирующих мышцах ведет к усилении активности пути Wnt и к преждевременной дифференцировке мышц. Следовательно, временное взаимодействие между Notch и Wnt является частью механизма, который гарантирует собственно пролиферативное расширение, сопровождаемое дифференцировкой, что делает возможным корректный миогенез (Brack et al., 2008). Точный молекулярный механизм, регулирующий ингибирование и активацию Notch и Wnt, соотв., посредством GSK3β, нуждается в дальнейшем исследовании (Brack et al., 2008) (Fig. 4).

Итак, передача сигналов Notch играет критическую роль в поддержании и самообновлении мышечных SCs у эмбрионов и взрослых.

Notch regulates differentiation in the Drosophila intestine

Задняя часть средней кишки у Drosophila является хорошо изученной модельной системой для изучения биологии кишечных SC. Кишечные SCs (ISCs) в средней кишке делятся симметрично, чтобы давать промежуточный тип клеток, наз. enteroblast (EB). EBs далее дифференцируются или в enterocyte (EC) или enteroendocrine (EE) клетки. EE маркируются экспрессией транскрипционного фактора Prospero, тогда как ECs могут быть идентифицированы по экспрессии Pdm1 (Nub) и их способности подвергаться эндорепликации. ISCs, как было установлено, подвергаются симметричным клеточным делениям, давая или две ISCs или две детерминированные клетки (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; de Navascues et al., 2012).

Micchelli and Perrimon идентифицировали ISCs как escargot-позитивные клетки, которые экспрессируют Notch лиганд Delta (Micchelli and Perrimon, 2006). Напротив, EBs экспрессируют Notch рецептор, воспринимающий сигналы от Delta-позитивных ISCs (Micchelli and Perrimon, 2006) (Fig. 5A). Передача сигналов Notch в средней кишке Drosophila, как полагают, регулирует поддержание, дифференцировку и пролиферацию SC в соответствии с разными сигнальными путями. Взаимодействие Hairless и Su(H) комплексов прежде всего диктует самообновление в противовес дифференцировке ISCs: Hairless-обусловленная репрессия Su(H) в ISCs ведет к подавлению активности гена мишени для Notch, Enhancer of split, таким образом поддерживается свойство самообновления ISCs (Bardin et al., 2010). Notch активация также регулирует пролиферативный индекс ISCs. В функциональном отношении потеря передачи сигналов Notch в температурно-чувствительной линии Drosophila (несущей мутации в Notch локусе) вызывает экспансию escargot⁺ ISCs, тогда как избыточная активация Notch ведет к снижению пролиферации ISCs (Micchelli and Perrimon, 2006).

Fig. 5.

Генетические исследования потери или избыточности функции на Drosophila также подтвердили, что передача сигналов Notch в EBs играет активную роль в детерминации клонов и терминальной дифференцировке в EC популяцию (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007; Takashima et al., 2011). В средней кишке Drosophila сила передачи сигналов Notch, облегчается с помощью пост-трансляционной модификации рецептора с помощью GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) и O-fucosyltransferase 1, при этом дифференциально регулируется детерминация клонов в противовес терминальной дифференцировке ISCs (Perdigoto et al., 2011). GMD и O-fucosyltransferase 1 способствуют более высокому уровню активации Notch, который необходим для детерминации клонов из ISCs, тогда как низкие уровни передачи сигналов Notch достаточны, чобы индуцировать терминальную дифференцировку в EBs (Perdigoto et al., 2011).

Помимо Notch пути и некоторые др. участвуют в регуляции пролиферации ISC, включая EGFR, Wnt и JAK-STAT (Biteau and Jasper, 2011; Xu et al., 2011). Один из потенциальных механизмов, с помощью которого Notch негативно регулирует пролиферацию ISC, является противодействующая передача сигналов JAK-STAT (Bertrand et al., 2010). JAK-STAT активность в ISCs необходима для вступления в клеточный цикл из покоящегося состояния. Передача сигналов Notch, как полагают, ингибирует транскрипцию JAK-STAT ligand gene unpaired, тем самым блокируется путь активации. Это ведет к блокированию пролиферации ISCs (Liu et al., 2010b). Более того, передача сигналов Notch, как было установлено, контролирует индуцируемую стрессами пролиферацию ISCs, путем ингибирования передачи сигналов Jun N-terminal kinase (JNK) у старых мух (Biteau et al., 2008).

Итак , Delta-обеспечиваемая передача сигналов Notch между ISCs и EBs играет критическую роль в гомеостазе средней кишки у мух. У Drosophila, активация пути Notch диктует симметричные деления ISCs и контролирует их пролиферацию посредством JAK-STAT и JNK пути. Кроме того, уровни передачи сигналов Notch также детерминируют выбор клеточных судеб в ISCs, тем самым поддерживает соотв. количества EC и EE клеток в кишечнике Drosophila.

Notch - a stem and progenitor gatekeeper in the murine intestine

В противоположность ISCs средней кишки Drosophila ISCs, мышиные ISCs дают ECs и три секреторных клона клеток [goblet клетки, Paneth клетки (PCs) и EE клетки] (Fre et al., 2009), а гомеостаз в тонком кишечнике, по-видимому, поддерживается за счёт самостоятельных популяций SCs. В то время как точная природа этих отличающихся популяций и взаимоотношения между ними, выяснены недостаточно, современные данные подтверждают существование долгоживущего пула SCs, маркированного Polycomb групп белком Bmi1, и митотически активного пула, маркированного с помощью Lgr5 (Barker et al., 2007; Sangiorgi and Capecchi, 2008). Данные по клоногенным сфероидным культурам подтверждают, что Lgr5⁺ пул SCs возникает из Bmi1⁺ клеток кишечника (Barker et al., 2007; Sangiorgi and Capecchi, 2008; Yan et al., 2012). Фактически Bmi1⁺ клетки могут компенсировать устранение популяции клеток Lgr5⁺ , тем самым поддерживая гомеостаз в кишечнике (Tian et al., 2011). Недавние исследования также идентифицировали третий субнабор ISCs. Эта популяция не делится и маркирована экспрессией LRIG (Powell et al., 2012; Wong et al., 2012). Однако, дают ли LRIG1⁺ ISCs разные типы клеток в кишечнике посредством или независимо от Lgr5⁺ популяции клеток ещё предстоит выяснить.

Lgr5⁺ стволовые клетки и клетки предшественники сохраняют способность давать все клоны кишечного эпителия (Sato et al., 2009). В основании крипт каждая из Lgr5+ стволовых клеток и клеток предшественников находится между PCs. Они служат в качестве ниши для Lgr5⁺ стволовых клеток и клеток предшественников, предоставляя им важные сигналы для поддержания кишечного гомеостаза. PCs экспрессируют Notch лиганд Delta-like 4 и некоторые митогенные факторы, включая Wnt3, Wnt11, transforming growth factorβ и EGF (Sato et al., 2011), которые помогают поддерживать пролиферацию в соседних Lgr5+ стволовых клетках и клетках предшественниках (Fig. 5B).

Передача сигналов Notch и Wnt играет критическую роль в координации пролиферации и дифференцировки ISCs в кишечнике. Каноническая передача сигналов Wnt посредством транскрипционного фактора 4, как было установлено, регулирует ISCs в компартментах кишечника криптах (Korinek et al., 1998). В дополнение к их роли в поддержании ISCs, путь Wnt также способствует дифференцировке секреторного клеточного клона в кишечнике (Pinto et al., 2003). Неясно, существует ли прямая взаимосвязь между передачей сигналов Notch и Wnt в кишечнике при физиологических условиях, но передача сигналов Notch также играет важную роль в поддержании ISCs, в также в детерминации в направлении абсорбтивного клона. Фармакологическое ингибирование Notch пути с использованием ?-secretase ингибиторов смещает дифференцировку в направлении судьбы секреторных клеток (goblet клеток) (Milano et al., 2004). Сходным образом, специфичная для кишечника инактивация RBP-J приводит к превращению пролиферативных клеток предшественников крипт в постмитотические goblet клетки. Эти результаты демонстрируют, что RBP-J-обусловленная передача сигналов Notch существенна для поддержания предшественников крипт (van Es et al., 2005) и для регуляции клеточных судеб. Однако, активация передачи сигналов Notch ведет к амплификации пула кишечных стволовых клеток и клеток предшественников, что сопровождается блокированием дифференцировки секреторных клеток (Fre et al., 2005). Определенные доказательства активности Notch в ISCs получены в экспериментах по отслеживанию клонов с использованием специфических репортерных мышей, чтобы проследить потомство ISCs, которое воспринимает Notch1 сигнал. 8 мес. спустя после активации Notch, целиком крипты ворсинок всё ещё оставались меченными, демонстрируя, что путь Notch является активным в SCs, которые дают всех потомков в кишечнике (Pellegrinet et al., 2011). Экспрессия и активация Notch1 и Notch2 в ISCs были далее подтверждены с помощью независимых исследований с использованием Notch1/2-CreERT2:R26 lacZ репортерных линий (Fre et al., 2011). Активация передачи сигналов Notch в мышиных ISCs находится в резком контрасте с Drosophila, у которых Notch активна в EBs, но не в ISCs (Fig. 5A). Как и в случае SCs в мышцах, передача сигналов Notch в кишечнике мышей важна для поддержания SC.

Генетические исследования выявили природу лигандов и рецепторов, ответственных за поддержание компартмента SC в кишечнике мышей. Одновременное удаление как Notch1, так и Notch2 в кишечнике фенокопирует потерю функции RBP-J, а именно метаплазию goblet клеток и потерю пролиферативных стволовых клеток и клеток предшественников (Riccio et al., 2008). Механистически передача сигналов Notch поддерживает пролиферативный компартмент крипт посредством Hes1-обеспечиваемой репрессии cyclin-dependent kinase (CDK) ингибиторов p27Kip1 и p57Kip2 (Cdkn1b и Cdkn1c) (Riccio et al., 2008). Одновременная инактивация Hes1, Hes3 и Hes5 в тонком и толстом кишечнике ведет к накоплению секреторных клеток и к снижению пролиферации внутри компартментов крипт (Ueo et al., 2012). Сходным образом, in vivo исследования идентифицировали Delta-like 1 и Delta-like 4 в качестве физиологических лигандов для Notch рецепторов в этом контексте. Специфичная для кишечника делеция Delta-like 1 и Delta-like 4 запускает потерю компартмента SC, на что указывает потеря SC маркеров Lgr5, olfactomedin 4 (Olfm4) и Ascl2 (Pellegrinet et al., 2011). Более того, ингибирование Notch с помощью γ-secretase ингибиторов или антител против Notch1/Notch2 вызывает подавление активности Olfm4 в кишечнике, идентифицируя Olfm4 в качестве прямой мишени этого пути (VanDussen et al., 2012).

В дополнение к его роли в регуляции пролиферации и самообновления - осуществляемой посредством Hes-обеспечиваемой репрессии CDK ингибиторов - имеется, по-видимому, вторая независимая функция Notch по контролю клеточных судеб. Как упоминалось выше, потеря Notch способствует дифференцировке goblet клеток. Ингибирующий эффект Notch на дифференцировку секреторных клеток, по-видимому, обеспечивается с помощью негативной регуляции mouse atonal homolog 1 (Math1; Atoh1). Math1 способствует детерминации судьбы секреторных клеток из клеток предшественников (Fig. 5B): потеря Math1 в кишечнике ведет к потере популяции секреторных клеток, тогда как избыточность функции вызывает накопление секреторных клеток за счет абсорбтивного клона EC (Yang et al., 2001; VanDussen and Samuelson, 2010). Активная передача сигналов Notch в стволовых клетках и клетках предшественниках кишечника способствует выбору судьбы абсорбтивных клеток в противовес судьбы секреторных клеток (Ueo et al., 2012), а накопление секреторных клеток, наблюдаемое в отсутствие передачи сигналов Notch может быть устранено за счет истощения Math1. Более того, Math1, как было установлено, регулирует пролиферацию в компартментах криптах, т.к. потеря Math1 на Notch-дефицитном фоне восстанавливает экспрессию Hes1, восстанавливая тем самым пролиферацию в компертментах криптах (Kim and Shivdasani, 2011).

В свете недавних успехов в области биологии кишечных SC, становится ясно , что путь Notch играет важную роль в разных, но довольно сходных путях в кишечных тканях мышей и Drosophila. В средней кишке Drosophila ISCs содержат Delta лиганд, чтобы активировать передачу сигналов Notch в рецептор экспрессирующих EB клетках, тогда как в кишечнике мышей SCs экспрессируют Notch1 и Notch2 рецепторы, действующие как сигнал воспринимающие клетки, при этом соседние PCs являются источником лиганда. Т.о., хотя Notch активируется в разных типах клеток в средней кишке Drosophila и кишечнике мышей, он регулирует поддержание, пролиферацию и детерминацию клонов у обоих видов.

Notch signaling in hematopoietic SC ontogeny - parallels in fish and mice

S ites of embryonic hematopoietic SC development

Эмбриональное гематопоэтическое развитие у позвоночных может быть подразделено на две разные фазы: примитивный и дефинитивный гематопоэз. У мышей, примитивный гематопоэз происходит во внеэмбриональном сайте, желточном мешке, тогда как у рыбок данио, примитивная волна инициируется в двух внутриэмбриональных сайтах - в передней и задней латеральной мезодерме. Во время примитивного гематопоэза у обоих видов временные популяции предшественников дают энтероциты и макрофаги (de Jong and Zon, 2005; Cumano and Godin, 2007). Во время второй фазы дефинитивного гематопоэза, который происходит в основном из региона aorta-gonad-mesonephros (AGM), а также плаценты у млекопитающих и вентральной стенки дорсальной части аорты (DA) у рыбок данио, генерируются дефинитивные гематопоэтические SCs (HSCs). Эти клетки дают весь спектр кровяных клеток у эмбрионов и у взрослых.

Элегантные исследования у эмбрионов рыбок данио и мышей показали, что субнабор эндотелиальных клеток перемещается из вентральной стенки DA в пространство под аортой и трансформируется в презумптивные HSCs с помощью процесса, наз. эндотелиальный гематопоэтический переход (Bertrand et al., 2010; Boisset et al., 2010; Kissa and Herbomel, 2010; Lam et al., 2010). Используя флюоресцентные репортерные трансгены у эмбрионов рыбок данио, Bertrand et al. визуализовали и идентифицировали промежуточные ступени, когда гемогенный эндотелий аорты дает зарождающиеся HSCs (Bertrand et al., 2010) в пространстве под аортой. Отсюда, вновь сгенерированные HSCs проникают в кровообращение и заселяют или тимус или почечные пронефросы, чтобы сделать возможным их экспансию и развитие. Boisset et al. показали у эмбрионов мышей, что de novo дефинитивные HSCs возникают непосредственно из эндотелиальных клеток вентральной части аорты, которые слущиваются в просвет DA (Boisset et al., 2010). HSCs затем вступают в кровобращение и оседают в печени плода для экспансии и дифференцировки.

Вр время этих последовательных гематопоэтических процессов, участвуют многие сигнальные пути, такие как Notch, Wnt, Hedgehog, VEGF, Bmp и FGF на разных стадиях развития HSC.

Notch - a driving force in definitive hematopoiesis

Несколько исследований показали важность передачи сигналов Notch для морфогенеза сосудов и спецификации артерий (Box 3). Поскольку гемогенные эндотелий в DA является ключевым местом дефинитивного гематопоэза, где HSCs впервые возникают у позвоночных, in vertebrates, то важно исследовать, действительно ли неспособность к спецификации артерий препятствует появлению HSC.

Box 3. Notch signaling during vascular development - artery specification

Studies in zebrafish already indicate a crucial role for Notch activity not only in embryonic hematopoietic stem cell (HSC) development, but also in vascular/angiogenic development. Given that arterial specification can be viewed as an important prerequisite for HSC emergence (Bertrand et al., 2010; Boisset et al., 2010; Kissa and Herbomel, 2010), Notch activity in the vascular system may also have an impact on hematopoiesis. A novel Notch signaling activity in zebrafish was shown to modulate fate specification of endothelial progenitors in the mesoderm, such that inhibition of Notch activity at an early stage promoted endothelial cell production at the expense of hematopoietic lineages (Lee et al., 2009). Moreover, genetic analysis has revealed a crucial role for Notch activity in mammalian vascular morphogenesis and artery specification (Krebs et al., 2000): both Notch1-deficient mouse embryos and compound-deficient embryos lacking Notch1 and Notch4 have severe vascular defects and die in utero prior to embryonic day 10.5. These findings have been recapitulated with specific conditional inactivation of Notch1 in endothelium (Limbourg et al., 2005). Both studies highlight the essential role of Notch signaling in the endothelium during vascular development and indicate a cell-autonomous function. Targeted deletion of several other players in the Notch signaling pathway, such as RPB-J (Krebs et al., 2004), mindbomb 1 (Koo et al., 2005), or Hey1 and Hey2 (Fischer et al., 2004), as well as Delta-like 4 (Duarte et al., 2004) were also shown to be essential for arterial specification. Moreover, the Notch-gridlock (Hey2 in mice) signaling axis regulates arterial versus venous cell fate choice in zebrafish. Gridlock, which is normally considered to be downstream of Notch signaling, was recently shown to act upstream of Notch in this context: overexpression of the Notch intracellular domain in gridlock mutants rescues the arterial phenotype (Rowlinson and Gering, 2010).

Первоначально связь между дефинитивным гематопоэзом и ролью в передачи сигналов Notch была установлена Kumano et al., которые показали на мышах, что Notch1 важен для генерации гематопоэтических клеток из эндотелиальных клеток в AGM (Kumano et al., 2003). Напротив, они установили, что потеря Notch не оказывает влияния на первичные гематопоэтические предшественники, генерируемые в желточном мешке. Исследование с использованием химерных бластоцистов для отличия клеточно автономных и клеточно не автономных эффектов передачи сигналов Notch показало, что Notch1 необходим клеточно автономно для становления долговременных дефинитивных HSCs (Hadland et al., 2004). Важная роль передачи сигналов Notch в регенерации HSCs была также подтверждена с использованием RBP-J-дефицитных животных (Robert-Moreno et al., 2005) и мышей с кондиционным удалением mindbomb 1 (Yoon et al., 2008b). Хотя такие эмбрионы дефицитны по происходящим из AGM HSCs, они содержат примитивные предшественники в желчном мешке.

Хотя это исследование потери функции подтвердило важную роль Notch в генерации HSCs во время эмбрионального развития, это может быть просто следствием нарушения спецификации судеб артериальных клеток и васкулогенеза. Эти сомнения были разрешены, показав, что Jag1-, но не Jag2-нулевые эмбрионы неспособны генерировать гематопоэтические предшественники в AGM регионе, но важны для поддержания судеб артериальных клеток (Robert-Moreno et al., 2008). Следовательно, Notch непосредственно ассоциирует с генерацией HSCs, независимо от своей роли во время васкулогенеза.

Список молекулярных нижестоящих мишеней передачи сигналов Notch, участвующих в генерации HSC во время дефинитивного гематопоэза не столь обширен. Это в основном обусловлено неспособностью отличать между мишенями для Notch, необходимыми для индукции спецификации артерий и теми, что необходимы для генерации HSC. Runx1 (Runt-related transcription factor 1), транскрипционный фактор, который важен для появления HSC во время превращения эндотелиальных клеток в гематопоэтические клетки, но не после этого (Chen et al., 2009), действует совместно с CREB-binding protein β и, как полагают, является нижестоящей мишенью передачи сигналов Notch (Burns et al., 2005). Однако непосредственная регуляция Runx1 посредством Notch ещё не выявлена. Не смотря на это, находка, что Runx1 стоит ниже Notch1 и Rbpj у мутантных эмбрионов и что более важно ретровирусная избыточная экспрессия Runx1 в Notch-дефицитных клетках prehematopoietic предшественниках достаточна для восстановления гематопоэтического потенциала, указывая, что Runx1 является ключевым фактором в Notch1-RBP-J-обусловленном гематопоэзе у млекопитающих (Nakagawa et al., 2006).

Исследования на рыбках данио также подтвердили, что экспрессия Runx1 зависит от Notch и способствует экспансии HSC (Burns et al., 2005). Более того, Hey2 гомолог gridlock не только участвует в спецификации артерий (Box 3), но и также играет роль в формировании HSC, поскольку gridlock-дефицитные эмбрионы рыбок данио обнаруживают снижение экспрессии Runx1 (Rowlinson and Gering, 2010). Метод иммунопреципитации хроматина показал, что Notch1 непосредственно рекрутируется на промотор gata2 (Robert-Moreno et al., 2005). Интересно, что устранение передачи сигналов Notch и сопутствующая потеря экспрессии Gata2 ведет к снижению экспрессии Runx1. Gata2 участвует в регуляции экспрессии Runx1 (Nottingham et al., 2007), предоставляя механистическое объяснение регуляции экспрессии Runx1 с помощью Notch (Fig. 6).

Fig. 6.

Выявление лигандов, которые обеспечивают передачу сигналов Notch в AGM неполное. Jag1, но не Jag2 является важным для возникновения нормальных количеств дефинитивных HSCs из AGM (Robert-Moreno et al., 2008). Однако др. Notch лиганды, такие как Delta-like 1 и Delta-like 4 также экспрессируются в AGM регионе (Robert-Moreno et al., 2008; Yoon et al., 2008b). Кондиционное удаление необходимо для определения, какие из этих лигандов играют здесь специфическую роль.

Интересное наблюдение сделано на рыбках данио, обнаруживающее связь не канонической передачи сигналов Wnt с каскадом Notch при клеточно не автономной спецификации HSCs (Clements et al., 2011). Wnt16, который экспрессируется в сомитах, контролирует появление HSCs путем регуляции экспрессии в сомитах Notch лигандов DeltaC и DeltaD, которые необходимы для артерио-венозной и HSC спецификации. Однако потеря Wnt16 приводит только к дефектам HSC скорее, чем к аномалиям сосудов. Т.о.,Wnt16-Delta-Notch путь, по-видимому, действует отдельно от традиционного Hedgehog-VEGF-Notch каскада в контроле артериально-венозной спецификации и возникновения HSCs.

Notch signaling in adult vertebrate HSCs - a controversy resolved

Хотя исследования, рассмотренные выше четко показывают роль передачи сигналов Notch в развитии эмбриональных HSC, потребность в передаче сигналов Notch в генерации взрослых HSCs остается спорной уже многие годы. Notch1 рецептор впервые идентифицирован в гематопоэтических клетках человека благодаря его вовлечению в хромосомную транслокацию, найденную у небольшой группы детей с T-клеточной острой lymphoblastic leukemia (T-ALL) (Ellisen et al., 1991). Впоследствии, Milner et al. продемонстрировали, что Notch экспрессируется в недифференцированных клетках предшественниках из костного мозга (BM) человека (Milner et al., 1994). Передача сигналов Notch, как было установлено, является важной для некоторых гематопоэтических процессов дифференцировки. Напр., спецификация судьбы T-клеток в противовес судьбе B-клеток в тимусе обеспечивается посредством Notch1/Delta-like 4 взаимодействия, а появление в маргинальной зоне B клеток зависит от Notch2/Delta-like 1 взаимодействия (rev. Radtke et al., 2010). Однако роль передачи сигналов Notch в поддержании у взрослых позвоночных HSC остается спорной в основном из-за неясных результатов в экспериментах с избыточной и недостаточной функцией.

Множественные исследования с избыточностью функции показали, что передача сигналов Notch может увеличивать число недифференцированных гематопоэтических предшественников, включя и HSCs. Добавление растворимого человеческого JAG1 в ex vivo культуры из очищенных кровяных клеток пуповины человека (Karanu et al., 2000) или в in vitro культуры Lin-CD117+Sca1+ (KLS) мышиных BM клеток в комбинации с иммобилизованным сконструированным DL1ext-IgG лигандом плюс ростовые факторы, способствовали in vitro экспансию этих популяций предшественников (Varnum-Finney et al., 2003). Последующие трансплантации любой из клеточных популяций NOD/SCID мышам выявили их кратковременный потенциал к восстановлению. Однако не была проведена серия трансплантаций, чтобы гарантировать долговременный SC потенциал. Jag1-обеспечиваемя передача сигналов Notch1 участвует в экспансии долговременных HSCs. Избыточная экспрессия трансгена активированного parathyroid-hormone (Pth/Pthlh) мутантного рецептора в остеобластах ведет к усилению активности Jag1 ик соотв. увеличению NICD в HSCs. Возникающая в результате Notch-обусловленная экспрессия HSC может быть блокирована in vitro с помощью γ-secretase ингибиторов (Calvi et al., 2003). Не смотря на это, следует отметить, что конституитивная активация Pth/Pthlh в остеобластах д. инициировать экспансию HSC по-другому, независимым от Notch путем. Pth сам по себе оказывает огромное влияние на ремоделирование кости и вызывает секрецию нескольких ростовых факторов, таких как BMPs и insulin-like growth factor 1, которые также д. влиять на гомеостаз HSC (Whitfield et al., 2002; Hadjidakis and Androulakis, 2006). Более того, дополнительные трабекулярные костные структуры и повышенные количества остеобластов наблюдались у таких мышей, фенотип, который наблюдается также у животных с дефицитом BMP receptor 1A, это показывает двухкратное увеличение количества долговременных HSCs. Эти данные также подтверждают тесную взаимосвязь между активацией Pth и высвобождением BMP (Zhang et al., 2003), и тем самым альтернативные механизмы экспансии HSCs.

C др. стороны, подходы по избыточной функции как in vivo, так in vitro показали, что конституитивная избыточная экспрессия NICD сохраняется и/или увеличивает количества гематопоэтических предшественников (Varnum-Finney et al., 2000; Stier et al., 2002). Кроме того, разные роли Notch2 в модуляции роста предшественников и в дифференцировке, как было установлено, в культурах ex vivo, с использованием или Jag1 или Delta-like , чтобы активировать Notch2 в HSCs, которые блокировали миелоидную дифференцировку и усиливали генерацию мультипотентных предшественников (Varnum-Finney et al., 2011). Иммортализованные эндотелиальные клетки, экспрессирующие Notch лиганды Jag1, Jag2, Delta-like 1 и Delta-like 4 подтверждают Notch-обеспечиваемую экспансию долговременной фракции HSC и делают возможным их долговременное восстановление у летально облученных мышей (Butler et al., 2010), только если осуществляется передача сигналов посредством Notch1 и Notch2 рецепторов. Итак, эти подходы показывают достоверное влияние передачи сигналов Notch на HSCs, приводя к существенной in vitro экспансии предшественников.

Многообещающий модифицированный подход используется сегодня в клинической фазе 1 трансплантационных испытаний myeloablative крови пупочного канатика. Ex vivo культуры экспансии CD34+ предшественников крови из пупочного канатика в присутствии Notch лигандов показали более чем 100-кратное увеличение клеток CD34⁺, которые эффективно заново заселяли immunocompromised NOD.SCID IL-2 receptor γ chain нокаутных (NSG) мышей (Delaney et al., 2010). Этот метод может предоставить мощный терапевтический подход в свете ограниченных количеств доступных HSCs, т.к. он д. облегчать и содействовать гематопоэтическому восстановлению., Хотя эти доказательства показывают, что передача сигналов Notch играет важную роль в экспансии и пролиферации мультипотентных предшественников, это недвусмысленно показывает, что передача сигналов Notch важна для HSCs после их появления у ранних и постнатальных эмбрионов.

Однако некоторые генетические исследования с использованием подходов по потере функции не выявили важной роли передачи сигналов Notch для взрослых HSCs. Кондиционная делеция любого из Jag1, Notch1, Notch1 и Notch2 вместе, или Rbpj во взрослых HSCs не обнаруживает эффекта на поддержание или пролиферацию HSC (Radtke et al., 1999; Mancini et al., 2005; Maillard et al., 2008). Сходным образом, комбинаторная делеция Jag1 в BM стромальных клетках и инактивация Notch1 в HSCs не обнаруживает эффекта на поддержание HSC, тем самым исключается важный вклад Jag1-обеспечиваемой передачи сигналов Notch1 для самообновления во взрослых HSC (Mancini et al., 2005). Однако эти исследования не изучали перекрываемость, связанную с экспрессией др. Notch рецепторов или лигандов в гематопоэтической ткани. Этот вопрос был в дальнейшем исследован с использованием генетических подходов с ингибированием всех канонических Notch сигналов во взрослых HSCs за счет кондиционного устранения Rbpj, и в параллельных экспериментах с доминантно-негативной (dn) MAML1 ретровирусной конструкцией (Maillard et al., 2008), экспрессируемой в HSCs. Ни RBPJ-дефицитные, ни dnMAML1-экспрессирующие HSCs не обнаруживали каких-либо дефектов HSC (Maillard et al., 2008). Хотя Notch1, Notch2 и Hes1 экспрессируются в HSCs, хотя и на низком уровне транскрипции (Maillard et al., 2008), физиологическая роль транскрипционной мишени для Notch Hes1 не была установлена в HSCs (Wendorff et al., 2010). Следовательно, эти результаты предоставляют убедительные доказательства, что передача сигналов Notch не играет обязательной физиологической роли в гомеостазе взрослых HSC при устойчивых условиях или в конкурентных и стрессовых ситуациях. Не смотря на то, что передача сигналов Notch необязательна во взрослых HSCs, исследования показывают, что HSCs могут успешно увеличиваться в числе при активации Notch in vitro, что до сих пор используется, особенно в клинических целях (Fig. 6).

Conclusions

The role of Notch signaling in SCs has been the focus of many scientists from different disciplines. Interplay between Notch ligands and receptors influences stem and progenitor cell maintenance, lineage specification mediated through either binary cell fate decisions or lateral inhibition, and induction of terminal differentiation (Dumortier et al., 2005). Drosophila, zebrafish and murine SCs of the embryonic and adult nervous systems have been shown to require Notch signaling to preserve the neuronal stem/progenitor pool. As neurogenic Notch mutations in Drosophila also caused muscle defects, Notch signaling was implicated in regulation of myogenesis (Poulson, 1937; Bate et al., 1993). It was also recently shown that Notch acts as a SC gatekeeper in muscle progenitors during development and adulthood. How Notch signaling restores the regenerative potential of aged muscle cells or how it inhibits differentiation of muscle SCs remains unknown. In intestinal SC biology, the Notch pathway plays an important role in mice and flies. Whereas Notch signaling is necessary for SC maintenance in mice, it is only important for proper differentiation of intestinal progenitor cells in Drosophila. An interesting exception is seen in the vertebrate hematopoietic system where Notch signaling is essential for embryonic HSC development but dispensable for adult HSCs. These findings are summarized and compared in detail in Table 2. Efforts that merge genetic approaches, cell culture and pre-clinical model systems advance and strengthen our current understanding of Notch signaling in SCs. How this can be exploited for therapeutic interventions in disease remains to be seen.

Stem cells living with a Notch Ute Koch, Rajwinder Lehal and Freddy Radtke Development 2013. 140, 689-704.

Stem cells living with a Notch
Ute Koch, Rajwinder Lehal and Freddy Radtke
Development 2013. 140, 689-704.