Посещений: 
ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ
Каналов кннексинов и паннексинов
|
|
Regulation of connexin- и pannexin-based channels by post-translational modifications Catheleyne D'hondt, Jegan Iyyathurai, Mathieu Vinken, Vera Rogiers, Luc Leybaert, Bernard Himpens, Geert Bultynck  Biology of the Cell
Volume 105, Issue 9, pages 373–398, September 2013 |
Connexin (Cx) и pannexin (Panx) proteins form large conductance channels, which function as regulators of communication between neighbouring cells via gap junctions и/or hemichannels. Intercellular communication is essential to coordinate cellular responses in tissues и organs, thereby fulfilling an essential role in the spreading of signalling, survival и death processes. The functional properties of gap junctions и hemichannels are modulated by different physiological и pathophysiological stimuli. At the molecular level, Cxs и Panxs function as multi-protein channel complexes, regulating their channel localisation и activity. In addition to this, gap junctional channels и hemichannels are modulated by different post-translational modifications (PTMs), including phosphorylation, glycosylation, proteolysis, N-acetylation, S-nitrosylation, ubiquitination, lipidation, hydroxylation, methylation и deamidation. These PTMs influence almost all aspects of communicating junctional channels in normal cell biology и pathophysiology. In this review, we will provide a systematic overview of PTMs of communicating junction proteins и discuss their effects on Cx и Panx-channel activity и localisation.
|
Три семейства белков, описанные как connexin (Cx), pannexin (Panx) и innexin (Inx) белки, как известно, формируют крупные каналы проведения. Inxs, Cxs и Panxs принадлежат одному сверхсемейству (Phelan et al., 1998; Baranova et al., 2004). Семейство Inx беспозвоночных насчитывает 25 генов у Carnorhabditis elegans и 8 у Drosophila melanogaster (Phelan et al., 1998; Yen и Saier, 2007). Семейство Cx позвоночных содержит 21 Cx генов у человека и семейство Panx позвоночных содержит 3 члена (Panx1, Panx2 и Panx3). Cxs, Panxs и Inxs является трансмембранными белками, состоящими из цитоплазматического N-терминального домена (NT), 4 типичных трансмембранных домена (TM; TM1, TM2, TM3, TM4), два домене внеклеточных петель (EL1 и EL2), и одну цитоплазматическую петлю (CL) и и цитоплазматический C-терминальный домен. (CT) (Figure 1). Семейства Cx и Panx обнаруживают структурное и функциональное сходство, включая способность формировать каналы щелевых соединений и полуканалы. Пока роль Panxs в качестве функциональных каналов щелевых соединений на физиологическом уровне остается спорной (for review see D'hondt et al., 2009). Более того, Sosinsky et al. (2011) заявили, что поскольку Panx олигомеры, как было установлено, формируют функциональные каналы в не противопоставленных мембранах, то они д. обозначаться не как полуканалы, а каналы. Недавно новое семейство белков, Ca 2+-homeostasis modulator 1 (CALHM1), обнаружило структурное и функциональное сходство Cx и Panx каналов (Siebert et al., 2013) и опосредует purinergic передачу сигналов от вкусовых почек к вкусовым нервам в ответ на сладкие, горькие и umami вкусовые молекулы (Taruno et al., 2013).
Figure 1. Schematic representation of the sites for post-translational modifications of communicating junction proteins
The post-translational modification sites are predicted sites that were identified using phosphoproteomic strategies. Each modification is represented by another color. "B" means bovine orthologue; "C" means chicken orthologue. Black, phosphorylation sites; orange, glycosylation sites; pink, proteolysis sites; dark blue, lipidation sites; purple, S-nitrosylation sites; red, acetylation sites; grey, deamidation sites; turquoise blue, hydroxylation site; green, ubiquitination site; brown, methylation sites; NT, cytoplasmic N-terminal domain; TM, transmembrane domain (TM; TM1, TM2, TM3, TM4); EL, extracellular loop domain (EL1 и EL2); CL, cytoplasmic loop domain; CT, cytoplasmic C-terminal domain; (see text и table 1 for references).
В плазматической мембране эти каналы функционируют в качестве регуляторов коммуникаций между соседними клетками, или за счет непосредственного образования каналов щелевых соединений, которые образуются, когда два полуканала соседних клеток смыкаются или косвенно паракринным способом путем контроля обмена ионами и метаболитами между внутренней и внеклеточной средой через не противопоставленные др.др. полуканалы (reviewed in D'hondt et al., 2009; 2010). Известно, что каналы щелевых соединений и особенно полуканалы нуждаются в тонкой регуляции, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Не удивительно, что разные физиологические стимулы, такие как повышенная внутриклеточная ацидификация (Morley et al., 1997), меняют трансмембранный или транссоединительный потенциал (Palacios-Prado и Bukauskas, 2011), изменяют внутри- и внеклеточные концентрации кальция (De Vuyst et al., 2006; 2009; Ponsaerts et al., 2010; 2012) и передачу сигналов RhoA (Derangeon et al., 2008; Ponsaerts et al., 2012; Seminario-Vidal et al., 2011), и тем самым модифицируют функциональное состояние щелевых соединений и полуканалов. Кроме того, дополнительные многочисленные белки взаимодействуют с этими каналами и некоторые влияют на локализацию и активность каналов (Herve et al., 2012). Связываемые каналами белки могут быть модифицированы белками с энзиматической активностью, вызывая так наз. post-translational modifications (PTMs) (Johnstone et al., 2012).
General introduction - PTMs
Термин PTM указывает на изменения в полипептидной цепи как результат или добавления или устранения ковалентных функциональных групп или белков. Эти модификации включают phosphorylation, glycosylation, proteolysis, N-acetylation, S-nitrosylation, ubiquitination, lipidation, hydroxylation, methylation и deamidation. Эти PTMs могут быть обратимыми (напр., фосфорилирование) или необратимыми (напр., proteolysis, ubiquitination, sumoylation).
Белковые PTMs играют ключевую роль во многих клеточных процессах, таких как клеточная дифференцировка (Grotenbreg и Ploegh, 2007), деградация белков (Geiss-Friedlиer и Melchior, 2007), сигнальные и регуляторные процессы (Morrison et al., 2002), регуляция экспрессии генов (Vinken et al., 2006) и межбелковые взаимодействия (Larsen et al., 2006). Следовательно, идентификация и понимание PTMs является критическим в понимании клеточной биологии, в лечении и предупреждении болезней. Сегодня более 60 типов PTMs описано в базе данных dbPTM (http://dbptm.mbc.nctu.edu.tw/) (Lee et al., 2006).
Традиционно, PTMs были идентифицированы с помощью Edman деградации, тонкослойной хроматографии, аминокислотного анализа, мечения изотопами (напр., включание [32P]-phosphate), иммунохимии с помощью пан-специфических противо-PTM антител (напр., pan- phosphotyrosine) или PTM-site-специфических антител (напр., anti-phosphoserine остатку 368 из Cx43) и ядерного магнитного резонанса (e.g., 31P-NMR) (Larsen et al., 2006; Kee и Muir, 2012). Техника. которая наиболее широко используется в протеомике для идентификации PTMs это масс-спектрометрия (MS) (Aebersold и Mann, 2003; Yates et al., 2005) для идентификации PTMs по их значениям массы и картирования PTM-сайтов внутри белка (Larsen et al., 2006). Эта техника измеряет добавление или дефицит массы, как результат PTM-индуцированных изменений в молекулярном весе модифицированных аминокислот (Larsen et al., 2006).
Различные PTMs , как было установлено, изменяют регуляцию и локализацию Cxs (Johnstone et al., 2012). Glycosylation является PTM, которая была изучена наиболее пространно для Panxs. К сведению, нет сообщений о PTMs в Inxs.
Figure 2. Post-translational modifications и channel formation of Pannexins
(A) Schematic representation of the transmembrane topology of the three pannexin family members. Based on sequence analysis, Panxs are predicted to contain N-glycosylation (orange residues) (Penuela et al., 2007), phosphorylation (black) sites (Penuela et al., 2007), proteolysis (pink) sites (Chekeni et al., 2010), acetylation (red) sites, S-nitrosylation (purple) sites (Bunse et al., 2010) и ubiquitination (green) sites (Kim et al., 2011) (* = site is biochemically confirmed). Panx1 [426 amino acids (aa)], Panx2 (667 aa) и Panx3 (392 aa) are integral membrane proteins consisting of four transmembrane (TM) domains (numbers indicate the aa position of TM domains), two extracellular loops и 1 intracellular loop. Panx1 has an N-glycosylation site at N254, Panx2 has a predicted N-glycosylation site at N86, и Panx3 at N71. (Modified from Penuela et al., 2009; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=19692571). (B) Panx1 и Panx3 are glycosylated to both a high-mannose form (Gly1) и a complex, extensively glycosylated form (Gly2), whereas Panx2 has only been reported as a high-mannose form (Gly1) or a core unglycosylated isoform (Gly0). (C) Formation of pannexin channels. Homomeric Panx1 (Bruzzone et al., 2005; Dvoriantchikova et al., 2006) и Panx3 (Penuela et al., 2007) but not Panx2 (Bruzzone et al., 2003) hemichannels are formed. Heteromeric Panx1/Panx2 (Penuela et al., 2009) и Panx1/Panx3 (Penuela et al., 2009) hemichannels can be formed, no reports on Panx2/Panx3 hemichannels. Formation of pannexin gap junction channels is still debated ($) (reviewed in D'hondt et al., 2009; Sosinsky et al., 2011). Yet, homotypic Panx1 (Bruzzone et al., 2003), homotypic Panx3 [249] и heterotypic Panx1/Panx2 (Bruzzone et al., 2005; Dvoriantchikova et al., 2006) gap junction channels have been described.
Communicating junction proteins и PTMs
Phosphorylation
Фосфорилирование белков является обратимым процессом, при котором функции белков регулируются с помощью обеспечиваемых киназами добавлений phosphate группы, принципиально к serine (S), threonine (T) или tyrosine (Y) остаткам (Ciesla et al., 2011; Davis, 2011). Наиболее критические события, вовлеченные в клеточную реакцию, это обусловленные фосфорилированием и дефосфорилированием, такие как регуляция ферментативной активности, изменения конформации белка, межбелковые взаимодействия и клеточная локализация (Huttlin et al., 2010; Davis, 2011; Nishi et al., 2011). Аномальное фосфорилирование причастно ко многим тяжелым болезням, подобных раку, болезням головного мозга, ожирению, диабету и нарушениям иммунной системы, влияющим на воспалительную реакцию, активация T лимфоцитов и поддержание гематопоэтических стволовых клеток (Saez et al., 2003; Colomer и Means, 2007).
Cx26, Cx31, Cx32, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46, Cx50 и Cx56, как было установлено, являются фосфобелками (Saez et al., 1998; Lampe и Lau, 2000; Lampe et al., 2000; Locke et al., 2009) (Figure 1, Table 1). Исследования Cx-фосфорилирования сфокусированы на serine (S), threonine (T) и tyrosine (Y) аминокислотах за счет protein kinase B (PKB/Akt) (Dunn et al., 2011), c- и v-src, mitogen-activated protein kinase (MAPK), protein kinase C (PKC), p34cdc2, casein kinase 1 (CK1), protein kinase A (PKA) или calmodulin-зависимых протеин киназных путей (Saez et al., 1998; Lampe et al., 2000; Lampe и Lau, 2004; Solan и Lampe, 2005, 2009) (Table 1). Для Cxs не было описано событий фосфорилирования basic аминокислот.
Table 1. Phosphorylation of connexins и pannexins
В Cxs фосфорилирование цитоплазматических остатков в основном происходит в C-терминальном домен (Cooper et al., 2000; Rikova et al., 2007; Wisniewski et al., 2010), и иногда в N-терминальном домене (Wisniewski et al., 2010; Chen et al., 2012) или цитоплазматическом петлевом домене (Berthoud et al., 1997; Alev et al., 2008; Rigbolt et al., 2011) (Figure 1, Table 1). Во многих тканях Cxs регулируются с помощью фосфорилирования по многим сайтам, приводя к измененному синтезу и обороту, доставке и внедрению в мембрану и агрегации Cx белка. Хотя фосфорилирование Cx участвует в эффективной доставке полуканалов в бляшки щелевых соединений (Palatinus et al., 2011a; Johnson et al., 2012), сборке каналов щелевых соединений, функции и обороте в нормальных и в болезненных состояниях (Saez et al., 1998; Lampe и Lau, 2000, Saez et al., 2003; 2004; Laird, 2005; Solan и Lampe, 2005, 2007, 2009; Marquez-Rosado et al., 2011). Однако подтверждено, что фосфорилирование не нужно для инсерции в мембрану Cx (Musil et al., 1990; Solan и Lampe, 2005) и для образования функциональных каналов (Martinez et al., 2003; Johnstone et al., 2009). Более того, Cx43, укороченный по aa 236, обнаруживает нарушение доставки в мембрану , тогда как Cx43, укороченный по aa 239, остается способен доставляться в мембрану и формировать функциональные каналы щелевых соединений, но не дает функциональные полуканалы (De Vuyst et al., 2007; Wayakanon et al., 2012). Т.о., только часть Cx43 C-терминального домена необходима для его трафика.
Недавно эффекты фосфорилирования на структуру и функцию Cx43 были тщательно рассмотрены (Solan и Lampe, 2009; Jeyaraman et al., 2011; Marquez-Rosado et al., 2011; Johnstone et al., 2012). Список фосфорилированных последовательностей Cx43 и обширный обзор Cx43 множественных мест фосфорилирования (преимущественно по S) представлен Chen et al. (2012). Значительно меньше известно о др. Cx подтипах.
Phosphorylation of Cx43
C-терминальный домен Cx43 играет важную роль в эффективной сборке каналов щелевых соединений, которые организуются в симметричные порядки, приводя к образованию бляшек щелевых соединений (White et al., 1995; Bruzzone et al., 1996). Эти бляшки щелевых соединений расположены вблизи слипчивых и плотных соединений, образуя соединительный комплекс, который сцеплен с актиновым цитоскелетом посредством линкерных молекул, таких как zonula occludens-1 и -2 (ZO-1 и ZO-2) (reviewed in Giepmans, 2004). ZO-1 и ZO-2 взаимодействуют с Cx43 (Singh et al., 2005) и контролируют доставку Cx43 в бляшки щелевых соединений (Toyofuku et al., 1998; Jin et al., 2004; Segretain et al., 2004; Hunter et al., 2005). C-терминальный домен Cx43 содержит 32 аминокислотных остатка, которые фосфорилируются протеин киназами (Marquez-Rosado et al., 2011; Chen et al., 2012), 15 остатков являются S остатками, которые фосфорилируются с помощью Ca2+/calmodulin protein kinase II (CaMKII) (Huang et al., 2011), протеин киназы, регулирующей гомеостаз Ca2+, транскрипцию, апоптоз и ишемическую болезнь сердца (Colomer и Means, 2007; Gomez et al., 2009; Singh et al., 2012).
Cx43 фосфорилируются по Y265 и Y247 с помощью v-src (Swenson et al., 1990; Lin et al., 2001; Solan и Lampe, 2008). Взаимодействие src с Cx43 после фосфорилирования по Y265, как было установлено, регулирует взаимодействие между Cx43 и ZO-1, но ингибирует ли src фосфорилирование Cx43 по Y265 и/или Y247 непосредственно коммуникации щелевых соединений или фосфорилирование с помощью MAPK Cx43 играет более непосредственную роль всё ещё спорно (Zhou et al., 1999; Lin et al., 2001; Cottrell et al., 2003). CK1-обусловленное фосфорилирование C-терминального домена Cx43 по S364 (TenBroek et al., 2001), S325 (Cooper и Lampe, 2002), S328 (Cooper и Lampe, 2002) и S330 (Cooper и Lampe, 2002) усиливает сборку и стыковку щелевых соединений и улучшает коммуникации посредством щелевых соединений (Lampe et al., 2006). В соответствии с этим, ингибирование CK1 существенно снижает перенос краски Lucifer Yellow, указывая тем самым, что CK1-обусловленное фосфорилирование Cx43 по S325/S328/S330 вносит вклад в становление функциональных каналов щелевых соединений. Эти данные полностью согласуются с недавними находками in vivo, использовавшими knock in мышиных моделей, в которых Cx43-S325A/S328A/S330A мешали функции каналов щелевых соединений, тогда как Cx43-S325E/S328E/S330E улучшали функцию каналов щелевых соединений (Remo et al., 2011). Такие мыши были высоко чувствительны к индуцируемым аритмиям, тогда как phospho-mimick (Cx43-S325E/S328E/S330E) knock in у мышей снижал чувствительность к индуцируемым аритмиям и они были резистентны к острому и хроническому патологическому ремоделированию щелевых соединений (Remo et al., 2011).
Фосфорилирование C-терминального домена Cx43 по Y265 (Toyofuku et al., 2001) и по S372/S373 предупреждает взаимодействие с PDZ2-доменом в ZO-1, действуя как переключатель для взаимодействия Cx43 с ZO-1 (Chen et al., 2008; Xiao et al., 2011), и тем самым регулируя образование каналов щелевых соединений (Rhett и Gourdie, 2012). Взаимодействие ZO-1-Cx43, которое концентрируется в регионе плазматической мембраны, окружающей бляшки щелевых соединений, наз. perinexus, управляет балансом между автономными коннексонами в perinexus и коннексонами, включенными в функциональные межклеточные каналы в щелевых соединениях (Hunter et al., 2005; Rhett и Gourdie, 2012). Kalcheva et al. (2007) также показали, что мутация I130T связана с фосфорилированием Cx43. Как следствие, эта мутация приводит к уменьшению доставки и сборки каналов щелевых соединений, снижая межклеточное соединение, ослабляя распространение импульсов и усиливая потенциал аритмий.
Некоторые др. исследования связали снижение коммуникаций посредством щелевых соединений с фосфорилированием Cx43 по разным сайтам, а именно по Y247 (Solan и Lampe, 2008), по S255 (Cottrell et al., 2003; Kanemitsu et al., 1998; Lampe et al., 1998; Warn-Cramer et al., 1998), по S262 (Doble et al., 2004; Norris et al., 2008; Solan и Lampe, 2008; Srisakuldee et al., 2009), по Y265 (Solan и Lampe, 2008), по S279 (Cottrell et al., 2003; Warn-Cramer et al., 1998), по S282 (Warn-Cramer et al., 1998; Cottrell et al., 2003; Solan и Lampe, 2008) и по S368 (Ek-Vitorin et al., 2006; Richards et al., 2004; Solan и Lampe, 2008; Srisakuldee et al., 2009; Straub et al., 2009; Palatinus et al., 2011b). Прямое фосфорилирование Cx43 по S368 также снижало открытие полуканалов (Bao et al., 2004). Cx43 фосфорилирование по S262 и по S368 появляется во время глобальной ишемии и сопровождается ослаблением ишемией вызванного дефосфорилирования Cx43 и предупреждает латерализацию Cx43 (Srisakuldee et al., 2009). PKCepsilon-зависимое фосфорилирование Cx43 по S262 ассоциирует с кардиозащитой (Srisakuldee et al., 2009) (Miura et al., 2007). PKC-зависимое фосфорилирование Cx43 по S368 приводит к увеличению проницаемости Cx43 каналов щелевых соединений, снижению унитарной проводимости (Ek-Vitorin et al., 2006) и восстанавливает коммуникации щелевых соединений, регулир3я заживление ран (Richards et al., 2004). Ранения в виде царапин первичных кератиноцитов человека вызывают увеличение фосфорилирования Cx43 по S368 в клетках, соседствующих с царапиной и снижают перенос краски по краям царапины. In vivo, фосфорилирование Cx43 по S368 остро повышалось в пограничной зоне повреждения после повреждения желудочков, это может вносить вклад в снижение индуцибельных аритмий после повреждений (O'Quinn et al., 2011).
Интернализация Cx43 из бляшек щелевых соединений, также как и оборот Cx (Lampe и Lau, 2000; Laird, 2005) ассоциированы с фосфорилированием S255 и S262 во время митоза (Kanemitsu et al., 1998; Lampe et al., 1998), по S365 (Beardslee et al., 2000; Solan и Lampe, 2007) и по S368 (Lampe и Lau, 2000).
Непосредственное фосфорилирование Cx43, возникающее в результате активации PKB/Akt, контролирует стабильность щелевых соединений и необходимо для образования крупных стабильных щелевых соединений (Dunn et al., 2011). Это фосфорилирование Cx43 может предоставить новую важную информацию о нижестоящих мишенях, необходимых для жизнеспособности и функции роста передачи сигналов Akt в клетках. Важно отметить, что Akt не только фосфорилирует Cx43 каналы, но и также IP3R каналы, чтобы предупредить про-апоптическую передачу сигналов Ca2+ (Szado et al., 2008; Vиerheyden et al., 2009; Decuypere et al., 2011; Marchi et al., 2012). Т.о., не исключено, что Akt может негативно регулировать Cx полуканалы или Panx каналы, учитывая их роль в клеточной гибели (Decrock, De Vuyst et al., 2009; Decrock, Vinken et al., 2009; Chekeni et al., 2010; Decrock et al., 2012; Sиilos et al., 2012).
Также функции помимо каналов, а именно, альтерации экспрессии детерминант тканевого гомеостаза и физическое взаимодействие с регуляторами клеточного роста и клеточной гибели, были описаны для Cxs. Напр., Cx-специфический, цис-действующий генный модуль, заостренный как чувствительный к Cx элемент в промоторной области, как полагают, модулирует экспрессию gatekeepers тканевого гомеостаза. Более того, взаимодействие Cxs с регуляторами клеточного роста и клеточной гибели возможно происходит благодаря взаимодействию Cxs с рядом ключевых детерминант тканевого гомеостаза, подобных β-catenin, E-cadherin, ZO proteins, ZO-1-associated nucleic acid binding белку и т.д. (rev. Vinken et al., 2011). Экспрессия множественных апоптических генов изменяется после нокдауна Cx43 (Iacobas et al., 2003), и продукция или активность множества регуляторов тканевого гомеостаза может быть изменена с помощью Cx белков, как самостоятельных единиц (Zhang et al., 2003), тем самым возможно затрагивается становление межклеточных коммуникаций посредством щелевых соединений. Cxs, или, по крайней мере, фрагменты Cx белков (такие как C-терминальные хвосты), располагаются в клеточных ядрах, где они могут непосредственно влиять на транскрипцию генов, но точные механизмы этих независимых от каналов действий Cxs остаются в основном неизвестными (Zhang et al., 2003). После усиленной экспрессии Cx43, часть C-терминального хвоста обнаруживает диффузное распределение в клетке, включая и ядро, приводя в результате к подавлению клеточного роста (rev. Vinken et al., 2011). Избыточная экспрессия Cx43 ингибирует синтез ДНК, независимо от межклеточных контактов или соединения кардиомиоцитов новорожденных (Doble et al., 2004). PKC-обеспечиваемое фосфорилирование разных остатков Cx43, включая S262 (Doble et al., 1996; 2000; Doble et al., 2004), отрицает Cx43-зависимый эффект на подавление роста (Dang et al., 2003) в эмбриональных и неонатальных кардиомиоцитах. Важно, что Cx43-S262D, phospho-mimicking Cx43 вариант, тяжело нарушал подавление синтеза ДНК. Напротив, Cx43-S262A, phospho-dead Cx43 вариант, был очень мощным в подавлении синтеза ДНК. Важно, что в отсутствие межклеточных контактов ингибирующий эффект Cx43's на синтез ДНК не затрагивался мутациями S262A или S262D, указывая, что фосфорилирование регулирует только Cx43-обусловленное подавление синтеза ДНК в присутствие межклеточных контактов (Doble et al., 2004). Однако способность фосфорилирования Cx43, чтобы устранить подавление клеточного роста с помощью Cx43 не нуждается в способности Cx43's формировать каналы щелевых соединений (Doble et al., 2004). Т.о., ожидается, что фосфорилирование Cx43 по S262 и и др. сайтам является, скорее всего, механизмом, с помощью которого митогены способствуют синтезу ДНК и пролиферации кардиомиоцитов и росту несмотря на их межклеточные контакты. Следующим за фактом, что Cx43 подавляет рост клеток, является то, что C-терминальный домен Cx43, как было установлено, усиливает подвижность клеток (увеличивает глиомную миграцию) и достаточен, чтобы индуцировать реорганизацию актинового цитоскелета (Bates et al., 2007; Crespin et al., 2010).
Phosphorylation of other Cx isoforms
Долгое время, Cx26, с его очень коротким C-терминальным доменом, считался не регулируемым с помощью фосфорилирования (Traub et al., 1989). Детальное исследование Locke et al. (2009) выявило фосфорилирование Cx26 phosphorylation по T123в домене цитозольной петли, по T177 в EL2, по S183 и T186 вблизи границы между EL2 и TM4 (Figure 1, Table 1). Эффекты фосфорилирования в домене цитоплазматической петли, домене в котором, по крайней мере, у двух др. Cxs (Cx36 и Cx56) происходит фосфорилирование (Berthoud et al., 1997; Urschel et al., 2006), остаются плохо охарактеризованными. T123N является возможно Cx26deaf missense мутацией, но отсутствует информация об функциональных эффектах мутации в этом сайте (Locke et al., 2009; Park et al., 2000). Согласно кристаллической структуре Cx26 (Maeda et al., 2009), T177 образует стыковочное взаимодействие противопоставленных полуканалов. S183 может играть роль в регуляции стыковки полуканалов, поскольку Cx26deaf S183F мутация существенно снижает образование каналов щелевых соединений (de Zwart-Storm et al., 2008).
Фосфорилирование Cx31 по S263 и S266 регулирует оборот и повышает межклеточные коммуникации Cx31, но фосфорилирование Cx31 не влияет на внутриклеточную доставку белков щелевых соединений (Diestel et al., 2004). Фосфорилирование S263 является критическим, т.к. делает возможным действие CK1 на S266. Быстрое снижение фосфорилирования обнаруживается после замены одного (S266) или обоих сериновых остатков (263 и 266), подчеркивая доминирующую роль фосфорилирования в позиции 263 (Diestel et al., 2004).
Фосфорилирование Cx32 по S233 (Saez et al., 1990) с помощью cAMP-dPK или PKC (Saez et al., 1986; Traub et al., 1987; Takeda et al., 1989; Saez et al., 1990) коррелирует по времени с повышенным проведением через соединения и усилением межклеточных коммуникаций с помощью щелевых соединений (Chanson et al., 1996). Также, S229 фосфорилируется, но в меньшей степени, чем S233 (Saez et al., 1990). Cx32 фосфорилируется по T243 с помощью epidermal growth factor receptor tyrosine kinase (Diez et al., 1995). Кроме того, альтерации в состоянии фосфорилирования C-терминального хвоста Cx32 может регулировать гомеостаз миэлина (Stauch et al., 2012).
Cx36 и ортолог рыб Cx35 являются мишенями для многих киназ (Patel et al., 2006; Urschel et al., 2006; Kothmann et al., 2007; 2009). Фосфорилирование Cx36 было установлено для S110, T111, S293 и S315, это приводило к увеличению синаптической эффективности в форме 'быстрого увеличения' проводимости соединений в N2A клетках, экспрессирующих Cx36 (Alev et al., 2008). PKA-обеспечиваемое фосфорилирование Cx36 ассоциировало со снижением коммуникаций посредством щелевых соединений (Urschel et al., 2006). Напротив, PKA активация protein phosphatase 2A и последующее дефосфорилирование Cx36 по S293 приводит к рассоединению щелевых соединений Cx36 в AII амакринных клетках сетчатки (Kothmann et al., 2009). Следовательно, фосфорилирование Cx36, по-видимому, существенно для поддержания соединения AII амакринных клеток. Эта регуляция, скорее всего, контролируется на уровне индивидуальных Cx36 бляшек и фосфорилирование по Ser293, по-видимому, влияет на проницаемость Cx36 щелевых соединений, но не на доставку Cx36 (Kothmann et al., 2009).
Фосфорилирование Cx37 по S319 осуществляется с помощью glycogen synthase kinase-3, киназы, как известно, сопричастной к пролиферации клеток и раку, как было установлено, ассоциировано со снижением межклеточных коммуникаций посредством щелевых соединений (Morel et al., 2010).
PKA-обеспечиваемое фосфорилирование Cx40 (вероятно по S120 или S345, которые, как известно, предположительно являются сайтами фосфорилирования Cx40 с помощью PKA (Kemp и Pearson, 1990; Kennelly и Krebs, 1991)) регулирует функцию Cx40 щелевых соединений (van Rijen et al., 2000). In vivo, это может приводить к увеличению проводимости между клетками и проницаемости сосудов и в сердце, где экспрессируется Cx40 (van Rijen et al., 2000).
Cx45 фосфорилирование C-терминального домена дифференциально регулирует электрическую проводимость между клетками посредством Cx45 щелевых соединений. По-видимому, регуляция не изменяет проводимость одиночного канала, но, скорее всего, модулирует вероятность открытия Cx45 каналов щелевых соединений (van Veen et al., 2000). Фосфорилирование Cx45 происходит по S381, S382, S384 и S385. Мутирование этих сериновых остатков у phospho-dead мутантов, приводит к неспособности фосфорилирования Cx45, увеличивает скорость оборота Cx45 (Hertlein et al., 1998).
Низкие уровни синтеза Cx46 и и низкая скорость фосфорилирования Cx46 выявлены в первичных культурах хрусталиков эмбрионов крыс и в культурах органов телят (Jiang et al., 1993). Cx46 фосфорилирование (в основном остатка T (Lin et al., 2004; Zampighi et al., 2005) и небольшой фракции S остатков (Lin et al., 2004)) в C-терминальном домене (также для ортолога Cx44 телят) (Shearer et al., 2008) подтвердило его возникновение благодаря активации PKC-gamma (Lin et al., 2004; Saleh et al., 2001). Интересно, что роль PKC-gamma, как полагают, контролирует кортикальные щелевые соединения хрусталика (Saleh et al., 2001).
Cx50 фосфорилирование по T остаткам было обнаружено по всему хрусталику (Lin et al., 2004), и по S остаткам как в C-терминальном домене, так и в центральном цитоплазматическом домене петли в телячьем ортологе Cx49 (Shearer et al., 2008). PKC-gamma-обусловленное фосфорилирование по S и T остаткам снижает плотность Cx50 каналов, собираемых в щелевых соединениях, тогда как увеличивает плотность Cx50 полуканалов (Zampighi et al., 2005). В хрусталиках цыплят, Cx50 (куриным ортологом является Cx45.6) фосфорилируется in vivo с помощью PKA по S395, приводя к увеличению стыковки в щелевых соединениях и открытию полуканалов, это поддерживает метаболическое купирование и транспорт в хрусталиковых волокнах (Liu et al., 2011). Cx50 фосфорилирование по S395 , по-видимому, не отвечает за альтерации в проводимости каналов (Liu et al., 2011). Фосфорилирование Cx50 по S364 (Yin et al., 2000), по-видимому, стимулирует оборот Cx50 преимущественно посредством протеосомного пути и это фосфорилирование ингибирует расщепление Cx50 с помощью caspase-3 (Yin et al., 2008).
Cx56 фосфорилируется по S493 и S118 в ответ на активацию PKC с помощью TPA (12-0-tetradecanoyl phorbol 13-acetate). Это подтверждает, что фосфорилирование Cx56 по S118 участвует в TPA-индуцированном снижении межклеточных коммуникаций и ускорении деградации Cx56 (Berthoud et al., 1997).
Phosphorylation of Panxs
На сегодня имеется ограниченная информация о фосфорилировании Panx, предполагается, что по аналогии с фосфорилированием Cx, пропускная способность каналов, базирующихся на Panx, испытывает влияние из-за фосфорилирования. Сайты фосфорилирования были предположены, исходя из предсказания для Panx1 и Panx3 (Barbe et al., 2006; Penuela et al., 2007) (Figure 1, Table 1 и Figure 2A). Недавно установлено, что Panx2, по-видимому, фосфорилируется по S514 (Ultanir et al., 2012), это единственный сайт фосфорилирования, биохимически подтвержденный для Panxs.
Glycosylation
Glycosylation of Cxs
Cxs белки, по-видимому, не гликозилируются и возможно лишены потенциальных сайтов гликозилирования в своих внеклеточных петлях. N-концы некоторых Cxs содержат потенциальные консенсусные сайты N-glycosylation. Из-за их локализации в цитоплазме и их доступности для энзимов гликозилирования, они не используются (Rahman et al., 1993; Wang et al., 1995; Saez et al., 2003). Однако активность Cx43 каналов может быть изменена с помощью превентивного гликозилирования белков с помощью tunicamycin или с помощью удаления внеклеточно расположенных glycans с помощью ферментативного дегликозилирования (Wang и Mehta, 1995; Wang et al., 1995). Также образованию Cx43 щелевых соединений препятствует олигосахаридная часть гликопротеинов плазматической мембраны, поскольку ингибирование гликозилирования устраняет эти ограничения (Wang и Mehta, 1995). Гликозилирование N-cadherin, обеспечиваемое с помощью sialic кислоты на клеточной поверхности, вовлекающее sialylated N-cadherin в лечение sialidase, также ассоциирует с ингибированием доставки Cx43 в бляшки и со снижением функции Cx43 щелевых соединений в раковых клетках (Li et al., 2010).
Glycosylation of Panxs
В противовес Cx каналам образование функциональных Panx каналов в плазматической мембране и распределение Panxs регулируются с помощью гликозилирования и с помощью взаимодействия между членами семейства Panx (Penuela et al., 2009). Гликозилирование играет также важную роль в доставке Panxs на клеточную поверхность.
Panx1 и Panx3 (Boassa et al., 2007; Penuela et al., 2007, 2008) и Panx2 (Penuela et al., 2009) являются гликопротеинами, состоящими вероятно только из одной гликановой цепи (Penuela et al., 2009). Консенсусный сайт для N-сцепленного гликозилирования Panx1 находится во второй внеклеточной петле в N254 (Penuela et al., 2007), Panx3 может быть гликозилирован по N71 (Penuela et al., 2007) и Panx 2 гликозилирование происходит по N86 (Penuela et al., 2009), оба находятся в его первой внеклеточной петле (Figures 1 и 2A). Panx1, как было установлено, существует в трех разных состояниях гликозилирования: в виде стержневого не гликозилированного белка (Gly0), в виде белка, высоко гликозилированного маннозой (Gly1), ассоциированного с ER и в виде сложных, экстенсивно гликозилированных видов (Gly2), которые модифицируются в аппарате Гольджи перед доставкой на клеточную поверхность, Panx2, как было установлено, существует только как Gly0 вид и Gly1 вид, а Panx3 существует как Gly1 вид и Gly2 вид (Boassa et al., 2007; Penuela et al., 2007; Boassa et al., 2008; Penuela et al., 2009; Prochnow et al., 2009) (Figure 2B). In vivo, не все изоформы Panx обусловлены гликозилированием. Определенные регуляторные механизмы контролируют Panx1 и Panx3 в семенниках, семявыносящих протоках и в разных регионах придатков яичка. Изменения в гликозилированных изоформах Panx могут регулироваться с помощью андрогенов, которые могут лежать в основе увеличения количества изоформ, наблюдаемого после кастрации (Turmel et al., 2011). Подтверждает это то, что N-гликозилирование уже было продемонстрировано как зависимое от андрогенов в придатках яичек крыс (Iusem et al., 1984).
Гликозилирование, как полагают, контролирует доставку Panx1 на клеточную поверхность (Boassa et al., 2007). Дефицитные по гликозилированию мутанты Panx1N254Q (Boassa et al., 2007), обнаруживают дефекты доставки и очень заметно распределены во внутриклеточных компартментах (Penuela et al., 2008). После совместной экспрессии с Panx1, восстанавливается доставка Panx1N254Q на клеточную поверхность (Boassa et al., 2008). В соответствии с этим, доставка мутантного Panx3-GFP осуществляется в основном на клеточную поверхность после совместной трансфекции с Panx1, а совместная экспрессия Panx1N254Q с Panx3-GFP сохраняет их расположение только во внутриклеточных сайтах (Penuela et al., 2009). Эти данные подтверждают, что мутанты, дефицитные по гликозилированию Panx1N254Q препятствуют доставке Panx3-GFP на клеточную поверхность. Дефицитные по гликозилированию мутанты Panx1N254Q и Panx3N71Q, как было установлено, обнаруживают способность формировать функциональные каналы, пригодные для поглощения краски (Penuela et al., 2007), указывая тем самым, что субпопуляция этих мутантов может правильно доставляться на плазматическую мембрану. Напротив, zfPanx1N246K, который является мутантом с дефицитом гликозилирования у рыбок данио Panx1, способен доставляться на клеточную поверхность, но обнаруживает нарушение поглощения ethidium bromide по сравнению с дикого типа zfPanx1 (Prochnow et al., 2009). Более того, Gehi et al. (2011) предоставили доказательства, что Panx1 нуждается в гликозилировании в Gly2 тип, чтобы соотв. доставляться на клеточную поверхность, и что C-терминальный домен Panx1 является критическим для доставки Panx1 и удержания на клеточной поверхности. В отсутствие C-терминального домена, гликозилирование Panx1 ограничивается состоянием Gly1, а созревание Panx1 в Gly2 тип ингибируется, приводя к сохранению Panx1 в ER (Gehi et al., 2011). C-терминально укороченный Panx1T307 гликозилируется преимущественно в Gly1 тип и располагается во внутриклеточных компартментах. В противовес восстановлению доставки на клеточную поверхность дефицитного по гликозилированию мутантного Panx1N254Q или доставке мутантного Panx3-GFP после одновременной экспрессии с Panx1, перемешивание с Panx1 не приводит к восстановлению Panx1T307 на клеточной поверхности. Более того, Panx1T307 действует преимущественно, редуцируя доставку Panx1 на клеточную поверхность (Gehi et al., 2011).
В то время как Panx1, даже в виде Gly0 (Boassa et al., 2008), и Panx3 способнык доставке на клеточную поверхность, чтобы сформировать функциональные каналы, Panx2 в основном располагается во внутриклеточных компартментах (Penuela et al., 2009). Можно предположить, что крупный C-терминальный домен Panx2 препятствует его доставке. Хотя субпопуляция Panx2 обнаружена в плазматической мембране (Zappala et al., 2006; Penuela et al., 2009), с образованием функциональных Panx2 каналов, пригодных для поглощения краски, хотя и в меньшей степени, чем Panx1 или Panx3 (Penuela et al., 2009). Интересно, что совместная экспрессия Panx2 с Panx1, снижает это потребление краски по сравнению с Panx1 или Panx2 в отдельности (Penuela et al., 2009) (rev. D'hondt et al., 2010). Уровень PTMs в Panx2, по-видимому, менее сравним с таковыми для Panx1 и Panx3 (Penuela et al., 2009), возможно из-за того, что Panx2 не существует в сильно гликозилированной форме Gly2, которая способна к доставке на плазматическую мембрану.
Процесс доставки Panxs на поверхность клетки напоминает таковой для Cx43 (Thomas et al., 2005). COPII пузырьками обеспечиваемый транспорт Panx1 и Panx3 из ER в аппарат Гольджи сопровождается дальнейшим гликозилированием Panxs до Gly2 вида в аппарате Гольджи и Panxs затем собственно доставляются на клеточную поверхность (Bhalla-Gehi et al., 2010).
Итак, популяция всех трех членов семейства Panx может располагаться и функционировать на клеточной поверхности как каналы одиночной мембраны. Взаимодействие разных подтипов Panx, по-видимому, высоко регулируется за счет состояния гликозилирования и их перемешивание может существенно влиять на функциональность формируемых мономерных или гетеромерных каналов.
Proteolysis
Proteolysis of Cxs
Протеолиз связан с Cx43, Cx46 (Cx44 и Cx56, телячий и куриный ортологи, соотв.), Cx50 (Cx49 и Cx45.6 телячий и куриный ортологи) и Panx1 (Figure 1). Укорочение эндогенного C-терминального хвоста описано для Cx43, Cx50, и наблюдается присутствие свободных фрагментов C-конца Cx43 в культивируемых клетках (Joshi-Mukherjee et al., 2007) (Figure 1). Свойства каналов щелевых соединений и, следовательно, межклеточные коммуникации посредством щелевых соединений изменяются при укорочении C-терминального домена Cx43 (Bates et al., 2007). Пока не получено доказательств изменений подвижности в результате этого укорочения (Moorby, 2000Bates et al., 2007).
Аутофагия, как было установлено, участвует в протеолизе дикого типа Cx50 и Cx43 (Lichtenstein et al., 2011). Выявлена совместная локализация внутриклеточных Cxs с p62, белком, который может служить в качестве рецептора грузов для деградации с помощью аутофагии. Более того, обработка с помощью chloroquine, ингибитора лизосомной протеазы, блокирует голоданием индуцированное снижение уровней Cx (Lichtenstein et al., 2011). Это подтверждено и недавним сообщением, показавшим, что щелевые соединения после интернализации деградируются с помощью аутофагии (Fong et al., 2012). Аутофагия, как было установлено, модулирует интернализацию и деградацию Cx43 с помощью ubiquitinylation Cxs в плазматической мембране (Bejarano et al., 2012).
Cx46 и Cx50, которые экспрессируются в клетках хрусталиковых волокон человека в сердцевине хрусталика (Paul et al., 1991; Donaldson et al., 1992; White et al., 1992) подвергаются протеолитическому расщеплению своих С концов во время созревания волокон. Cx46 и Cx50 важны для роста и прозрачности хрусталиков (Gong et al., 2007). Отсутствие Cx46 и Cx50 приводит к аберрантным коммуникациям посредством щелевых соединений, вызывая разные типы катаракт за счет повреждения клеток внутренних хрусталиковых волокон (Xia et al., 2006). Ядерные катаракты вызываются разрушением Cx46 у мышей, что связано с протеолизом gamma-crystallins (Gong et al., 1997; Xia et al., 2006), приводя к их агрегации и последующему помутнению хрусталиков (Baruch et al., 2001). Ca2+-зависимая cysteine протеаза (calpain) Lp82, как было установлено, является ключевым ингибитором протеолиза gamma-crystallin (Baruch et al., 2001), это указывает на критическую роль Cx46 щелевых соединений в поддержании гомеостаза Ca2+ и, следовательно, в контроле calpain Lp82 (Baruch et al., 2001). Также связанные с возрастом катаракты у Cx46-нокаутных мышей возникают в результате увеличения внутриклеточного [Ca2+], и тем самым активации calpain3 изоформы Lp82/85 (Tang et al., 2007). Расщепление Cx46 также связано с пространственным перераспределением бляшек щелевых соединений в хрусталике (Jacobs et al., 2004). Cx44, телячий ортолог Cx46 расщепляется по L255 (Shearer et al., 2008). Успехи и открытия клинических проявлений, связанных с дисфункцией Cx46 и Cx50 рассмотрены в обзоре Jiang (2010).
Два сайта расщепления с помощью calpain (E290 и S300) были идентифицированы в Cx50 (Lin et al., 1997). Также Cx49, телячий ортолог Cx50 (Rao et al., 1990), расщепляется с помощью calpain по E290 (Lin et al., 1997; Shearer et al., 2008) и S300 (Lin et al., 1997). C-терминальное укорочение Cx50 не ингибирует образование гомотипических и гетеротипических каналов. Однако, достоверное снижение проводимости наблюдается в укороченных каналах, феномен не зависящий от альтераций напряжением управляемых чувствительности, кинетики или пропускания химических соединений (DeRosa et al., 2006). Cx45.6, куриный ортолог Cx50, является непосредственной мишенью caspase-3, а расщепление с помощью caspase-3 между G361 и E367 ведет к возникновению укорочения Cx45.6, которое может быть модулировано с помощью специфического фосфорилирования Cx (Yin et al., 2000; Yin et al., 2001; Yin et al., 2008).
Proteolysis of Panxs
Panx1 является мишенью для caspase 3 и 7-обеспечиваемого протеолиза. Идентифицированы два сайта расщепления каспазами, а именно, в домене цитоплазматической петли в aa 164-167 (DMRD) и в C-терминальном домене aa 376-379 (DVVD) (Figures 1 и 2A). Каспазами вызываемое расщепление C-терминального домена Panx1 необходимо для индукции Panx1-обусловленной проницаемости плазматической мембраны во время апоптоза. Экспрессия укороченного Panx1 (предположительно в месте расщепления каспазой) приводит к постоянно открытому каналу (Chekeni et al., 2010). Это подтверждено недавним исследованием, показавшим, что расщепление каспазой Panx1 ведет к активации канала за счет диссоциации C-терминального домена от поры канала (Sиilos et al., 2012). Эти результаты указывают на то, что интактный, ассоциированный с порой C-терминальный домен ингибирует полной длины канал hPANX1. Следовательно, каспазой обусловленное расщепление Panxs устраняет ключевые ингибирующие C-терминального домена детерминанты, активируя тем самым hPanx1 (Sиilos et al., 2012).
N-Acetylation
Acetylation of Cxs
Ацетилирование в Cxs может участвовать в регуляции пропускной способности и проницаемости Cxs, поскольку N концы Cxs регулируют пропускную способность и проницаемость канала (Verselis et al., 1994; Oh et al., 1999; Oh et al., 2000; Purnick, Benjamin et al., 2000; Purnick, Oh et al., 2000). Более того, первые 10 остатков Cx26 и Cx32, как полагают, расположены в поре канала (Purnick et al., 2000).
В Cx44 и Cx49, N-терминальный M-остаток эндогенно удаляется, а заново экспозированный N-терминальный G-остаток становится ацетилированным (Shearer et al., 2008).
Множественные сайты ацетилирования были идентифицированы в домене цитоплазматической петли в Cx26, этот регион используется в пропускной способности с помощью pH и внутримолекулярных взаимодействий во многих Cxs (Figure 1) (Manthey et al., 2001; Shibayama et al., 2006; Ponsaerts et al., 2010). Ацетилирование выявлено в M1 с помощью MS/MS (тандемной масс спектрометрии) и в K15, K102, K103, K105, K108, K112 и K116 с помощью MS (Locke et al., 2009) (Figure 1).
N-терминальное ацетилирование происходит во всех белках с последовательностью M1D2 (methionine на первой позиции и aspartic acid на второй позиции белка), таких как Cx26, тем самым устраняется её положительный заряд. Это может оказывать выраженное влияние на пропускную способность Cx-каналов, поскольку N-терминальный домен укладывается в водную пору, чтобы действовать как сенсор напряжения и открывать Cxs (Purnick et al., 2000; Oh et al., 2004; Oshima et al., 2007; Maeda et al., 2009 ).
В Cx26, ацетилирование K15 может затрагивать избирательность заряда проникающих веществ и/или пропускную способность, зависимую от напряжения, т.к. K15 расположен на наружном крае цитоплазматического входа/вестибюля канальной поры вблизи 'шарнирного' региона, в котором N-терминальный домен поворачивает в пору, чтобы сформировать напряжением контролируемый сенсор/проход (Maeda et al., 2009; Purnick et al., 2000). Некоторые внутренние K-остатки в принципе могут быть ацетилированы в Cx26 домене цитоплазматической петли вблизи TM2. Домен цитоплазматической петли Cx участвует в пропускной способности с помощью pH и родственных внутримолекулярных взаимодействий (Manthey et al., 2001; Shibayama et al., 2006), так что динамическое модулирование заряда этого домена с помощью множественных ацетилирований может модулировать этот процесс, как это происходит в др. белках (Yang и Seto, 2008).
Часть Cx44 и Cx49 ацетилирована. N-ацетилирование вновь возникших N концов, как было установлено, происходит после удаления N-терминального Met остатка (Shearer et al., 2008).
N(epsilon)-lysine ацетилирование Cx43 предопределяет диссоциацию из щелевых соединений и латерализацию Cx43, при этом ингибируя её ассоциацию с щелевыми соединениями на интеркалярных дисках, это может иметь физиопатологические последствия для соединения клеток и кардиальной функции (Colussi et al., 2011).
Ацетилирование может также регулировать уровни Cx-белка. Ингибиторы histone deacetylase [подобные Trichostatin A (TSA)], которые мешают ацетилированию стержневых гистонов, влияют на структуру хроматина и, следовательно, на экспрессию разных генов (Vanhaecke et al., 2004; Papeleu et al., 2005). TSA дифференциально воздействует на уровни Cx-белков и локализацию и усиливает межклеточные коммуникации посредством щелевых соединений в первичных культурах гепатоцитов крыс. Воздействие TSA увеличивает уровни Cx32 белка и накопление Cx43 в ядерном компартменте первичных культивируемых гепатоцитов. В культивируемых клетках воздействие TSA ведет к снижению уровней Cx26 белка и Cx26 преимущественно располагается в цитозоле (Vinken et al., 2006).
Acetylation of Panxs
Места ацетилирования Panx1 были предсказаны в K202, K203 и K211, а в Panx2 места ацетилирования в K456 и K459 (Figures 1 и 2A). Но не получены функциональные доказательства ацетилирования Panxs.
S-Nitrosylation
Nitrosylation of Cxs
NO донор S-nitroso-N-acetylpenicillamine существенно снижает перенос краски через каналы Cx37 щелевых соединений в культивируемых эндотелиальных клетках пупочной вены человека (Kameritsch et al., 2005). Согласно этому исследованию, также электрическое купирование каналов Cx37 щелевых соединений снижено после воздействия NO на эндотелиальные клетки микрососудов (McKinnon et al., 2009). Недавно, Straub et al. (2011) установили, что Cx43 постоянно S-nitrosylated по C271 (Figure 1). S-nitrosylation может регулировать проницаемость каналов щелевых соединений миоэндотелиальных соединений, которые являются своеобразным типом щелевых соединений, которые облегчают непосредственные коммуникации между эндотелиальными клетками и сосудистыми гладкомышечными клетками внутри резистентных артерий в стенках кровеносных сосудов (Straub et al., 2011).
Также, полуканалы Cx, по-видимому, регулируемые с помощью S-nitrosylation. Метаболическое ингибирование увеличивает количество Cx43 полуканалов на клеточной поверхности и усиливает поглощение краски. Это связано со множественными молекулярными изменениями, включая S-nitrosylation внутриклеточных Cx43 C-остатков (Retamal et al., 2006; Retamal et al., 2007). В кардиомиоцитах и кортикальных астроцитах, открытие Cx43 полуканалов вызывается гипоксией, потерей кислорода или во время длительного периода ишемии, это может быть обусловлено дефосфорилированием Cx43 полуканалов или оксидативными модификациями, обусловленными повышенной продукцией NO (и др. реактивных видов кислорода) (Kim et al., 1999; Bao et al., 2004). Также предполагается регуляция Cx46 полуканалов с помощью NO (Retamal et al., 2009).
Nitrosylation of Panxs
На сегодня доказательства прямой модуляции Panx1 каналов с помощью S-nitrosylation отсутствуют. Хотя, поскольку Panx1 содержит множественные цистеиновые остатки cysteine residues и поскольку Panx1 экспрессируется в тканях с повышенной продукцией NO, нельзя отрицать, что Panx1 каналы могут подвергаться S-nitrosylation. Более того, мутация C346 в С-конце Panx1 (Bunse et al., 2010) и C40 в регионе, выстилающем пору, первого трансмембранного домена Panx1 дает постоянно протекающие каналы (Bunse et al., 2011), указывая на важность цистеиновых остатков Panx1 в регуляции пропускной способности и проницаемости каналов (Figures 1 и 2A).
Более того, Panx1 и Panx2 каналы участвуют в вызываемой ишемией гибели нервных клеток, состоянии, при котором продукция NO заметно возрастает (Bargiotas et al., 2011). В соответствии с этим, открытие Panx полуканалов может обеспечить избыточную генерацию NO и гибель нервных клеток во время ишемии. Это ослабляется с помощью ингибитора NO synthase или уменьшения окисленных sulphhydryl групп с помощью восстановительного агента DTT (Zhang et al., 2008).
Ubiquitination и sumoylation
Ubiquitination of Cxs (Leithe и Rivedal, 2007) (Figure 1)
Cx43 monoubiquitinated по K9 и K303 (Wagner et al., 2011). PKC- и MAPK-обеспечиваемое убиквитинирование Cx43 в плазматической мембране, по-видимому, регулирует эндоцитоз Cx43. Более того, Nedd4-обеспечиваемое убиквитинирование Cx43 в плазматической мембране, которое модулируется с помощью фосфорилирования Cx43 (Leithe и Rivedal, 2007), по-видимому, необходимо для инициации зависимой от аутофагии интернализации и деградации Cx43 (Bejarano et al., 2012). В согласии с этим исследованием также был идентифицирован ubiquitin-binding protein p62/sequestosome 1 в целенаправленно интернализуемых Cx43 щелевых соединениях (Fong et al., 2012).
Убиквитинирование Cx43 не контролирует ни стабильность щелевых соединений, ни оборот Cx43, поскольку мутантный Cx43 со всеми лизинами, превращенными в аргинины ведет себя также как дикого типа Cx43 в присутствии протеосомных и лизосомных ингибиторов (Dunn et al., 2011).
Cx46-индуцируемая деградация Cx43, скорее всего, обеспечивается с помощью ubiquitin-proteasome пути, с участием внутриклеточного домена C-терминального хвоста Cx46 (Banerjee et al., 2011).
Недавно, Kjenseth et al. (2012) впервые идентифицировали Cx43 в качестве белка мишени для SUMOylation по K144 или K237, т.о., Cx43 щелевые соединения могут регулироваться с помощью системы SUMO (Figure 1).
Ubiquitination of Panxs
Panx1, как было установлено, убиквитинируется по K381 и K409 (Kim et al., 2011) (Figures 1 и 2A), но функциональные доказательства слабые.
Lipidation
Lipidation of Cxs
Хотя хорошо известно, что Cxs ассоциируют с липидными платформами (Locke et al., 2005), имеется мало сообщений о lipidation в Cxs. Palmitoylation конца C-терминального домена mCx32 (остатки 277-283) (Locke et al., 2006) и palmitoylation одного или обоих цистеинов в С-терминальной последовательности CSAC C-терминального домена Cx32 (Linder и Deschenes, 2003) описаны и `unspecified prenylation' в Cx32 C280SAC283 в трансфицированных COS клетках (Huang et al., 2005), как было установлено, является geranylation (Locke et al., 2006) (Figure 1).
Lipidation of Panxs
Panx2 имеет depalmitoylated (~60 kDa) форму, которая располагается преимущественно на плазматической мембране, тогда как palmitoylated форма Panx2 (~85 kDa), как полагают, располагается в Гольджи и/или ER (Swayne et al., 2010). Точное место palmitoylation пока неизвестно.
Hydroxylation
Гидроксилирование происходит на N-конце Cx32 или в N2 или N14 (Locke et al., 2006) и в Cx26 в N14 N-терминального домена, в N113 в цитоплазматической петле и или в N170 или N176 во второй внеклеточной петле (Locke et al., 2009; Locke et al., 2006) (Figure 1).
Пропускная способность Cx26 затрагивается при двух Cx26 deaf мутациях по N14, а именно, мутация N14Y и мутация в N14K. N14Y мутация снижает проводимость через щелевые соединения, а N14K мутация дает функциональные каналы, но они лишены зависимости от напряжения (Purnick et al., 2000; Arita et al., 2006; Maeda et al., 2009). Поскольку N14K не вносит заряда, то эта мутация лучше всего может воспроизводить потерю гидроксилирования. N176 может непосредственно вовлечена в стыковочное взаимодействие между противостоящими полуканалами (Maeda et al., 2009).
Methylation
В Cx26, K61, R75 и или K221 или K223, как было установлено, являются местами метилирования (Locke et al., 2009) (Figure 1). Важно, что R75 в Cx26 затрагивается с помощью болезнь-вызывающих мутаций в Cx26. Напр., R75Q или R75W мутации в Cx26 приводят к неспособности формировать функциональные каналы щелевых соединений, обнаруживая измененные зависимость от напряжения и проницаемость и действуют как доминантно негативные по отношению к др. Cxs, включая и Cx26. Роль автономных R75W каналов в гибели кохлеарных клеток и в доминантной глухоте вполне возможна и это ассоциирует с Palmoplantar keratoderma (Richard et al., 1998; Chen et al., 2005; Deng et al., 2006).
Deamidation
В C-терминальном домене Cx43, deamidation происходит по N329 и Q333(Huang et al., 2011) (Figure 1). В телячьем Cx49, deamidation происходит по N121 (Shearer et al., 2008). Биохимические доказательства всё ещё необходимы.
Conclusion
Although important insights have been gained regarding PTMs as a regulatory mechanism for Cx и Panx communicating channels at the cellular level и PTM-target sites have been associated with disease-causing mutations, in vivo proof for the relevance of PTM-dependent Cx- и Panx-channel regulation is often lacking. Thus, mutations in Cx и Panx-coding genes may lead to the defective Cx и Panx channels, in part because they lack PTMs essential for their function as communicating channels in controlling physiological processes. Recently, this has been shown in a Cx43-phosphorylation dead- и Cx43-phosphorylation mimick-knock-in mouse model (Remo et al., 2011). In a Cx43-phosphorylation dead-model, Cx43 phosphorylation is unabled by mutating the phosphorylation sites и in a Cx43-phosphorylation mimic-knock-in mouse model, mutations are inserted in order to mimic phosphorylation. Given the central role of PTMs in controlling many cell biological aspects of и functional properties of Cx и Panx channels, unequivocally establishing their relevance in vivo и in pathological conditions will be important. PTM directly affect the activity, trafficking, localisation и expression of gap junction channels. Furthermore, given the fact that both Cxs и Panxs can form gap junction channels (note that gap junction formation is still debated for Panxs) и hemichannels (Ishikawa et al., 2011; Kar et al., 2012; Wang et al., 2012) и the emerging roles for Cx hemichannels in physiological processes (Kar et al., 2012; Stehberg et al., 2012), it will be important to elucidate how PTMs influence both channel types. PTMs does not necessarily need to exert the same outcome on gap junctions versus hemichannels, as molecular events like intramolecular loop/tail interactions underlying their opening и closing may have opposite outcomes (Ponsaerts et al., 2010; Evans et al., 2012; Ponsaerts et al., 2012). Finally, beyond phosphorylation events, it is critical to understи how other chemical modifications of Cx и Panx proteins (like S-nitrosylation, acetylation и deamidation) regulate their activity и how these are altered during pathological conditions.
|