Посещений: 
ЭМБРИОГЕНЕЗ
Сенсоры ретиноевой кислоты
|
|
Transgenic retinoic acid sensor lines in zebrafish indicate regions of available embryonic retinoic acid Amrita Mandal, Ariel Rydeen, Jane Anderson, Mollie R.J. Sorrell, Tomas Zygmunt, Jesus Torres-V?zquez, Joshua S. Waxman
 Developmental Dynamics 242:989-1000, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc. |
Retinoic acid (RA) signaling plays a critical role in vertebrate development. Transcriptional reporters of RA signaling in zebrafish, thus far, have not reflected the broader availability of embryonic RA, necessitating additional tools to enhance our understanding of the spatial and temporal activity of RA signaling in vivo. Results: We have generated novel transgenic RA sensors in which a RA receptor (RAR) ligand-binding domain (RLBD) is fused to the Gal4 DNA-binding domain (GDBD) or a VP16-GDBD (VPBD) construct. Stable transgenic lines expressing these proteins when crossed with UAS reporter lines are responsive to RA. Interestingly, the VPBD RA sensor is significantly more sensitive than the GDBD sensor and demonstrates there may be almost ubiquitous availability of RA within the early embryo. Using confocal microscopy to compare the expression of the GDBD RA sensor to our previously established RA signaling transcriptional reporter line, Tg(12XRARE:EGFP), illustrates these reporters have significant overlap, but that expression from the RA sensor is much broader. We also identify previously unreported domains of expression for the Tg(12XRARE:EGFP) line. Conclusions: Our novel RA sensor lines will be useful and complementary tools for studying RA signaling during development and anatomical structures independent of RA signaling
Рисунки к статье
|
Потребность в передаче сигналов RA впервые была изучена в 1940s и 1950s с использованием дефицитных по витамину А эмбрионов крыс (Warkany and Schraffenberger, 1946; Wilson and Warkany, 1949; Wilson et al., 1953). С тех пор несоответствующая передача сигналов RA была обнаружена в качестве причины для сходного спектра дефектов развития у всех позвоночных, при этом усиление или уменьшение передачи сигналов RA затрагивало многие органы и ткани, включая задний мозг, передние конечности и сердце (Heine et al., 1985; Lammer et al., 1985; Rizzo et al., 1991; Li et al., 1993; Lohnes et al., 1993, 1994; Mendelsohn et al., 1994; Niederreither et al., 1999,2001; Abu-Abed et al., 2001; Sakai et al., 2001; Grandel et al., 2002; Emoto et al.,2005; Sandell et al., 2007). Самой ранней из известных функций передачи сигналов RA постериоризация эмбриональной оси (Duester, 2008; Niederreither and Dolle,2008; Mark et al., 2009), которая является эволюционно законсервированной функцией у хордовых (Campo-Paysaa et al., 2008). У позвоночных в позднем развитии роль передачи сигналов RA включает способствование дифференцировке эпикарда (Braitsch et al., 2012), пролиферации миокарда (Chen et al., 2002), росту передних конечностей (Cooper et al., 2011) и формированию паттерна кардиального тракта оттока (Li et al., 2010).
RA является наиболее активным метаболитом витамина А (retinol) и продуцируется c помощью серии окесидативных реакций c помощью alcohol и aldehyde dehydrogenases внутри специфических мест в эмбрионе (Duester, 2008). Во время развития, RA действует как морфоген и является лигандом для членов семейства ядерных гормональных рецепторов, RA receptors (RARs) (Aranda and Pascual, 2001; Bastien and Rochette-Egly, 2004; White et al., 2007; Duester,2008). RARs действуютна транскрипционном уровне как гетеродимеры с retinoid X receptors (RXRs), которые совместно связывают RA response elements (RAREs). Чаще всего RAR/RXRs гетеродимеры соединяются с т.наз. direct repeat 5 (DR5) сайтом, определяемым по 5-нуклеотидному спейсеру между RAR и RXR связывающими элементами. Однако они обладают некоторой гибкостью и также могут связывать DR1 и DR2 сайты (Bastien and Rochette-Egly, 2004).
Знание общих правил связывания RAR привело к генерации ряда синтетических репортеров, содержащих сцепленные DR5 RARE сайты, которые были использованы in vitro и in vivo 3у трансгенных мышей в качестве транскрипционных репортеров передачи сигналов RA (Rossant et al., 1991; Balkan et al., 1992; Nagpal et al.,1992). Сравнительно недавно сходные стратегии были использованы для создания у рыбок данио трансгенной RA сигнальной репортерной линии (Perz-Edwards et al., 2001). Однако ряд более ранних линий у рыбок данио, которые были использованы синтетические промоторы, как и у мышей, обнаруживали существенные позиционные эффекты, обусловленные их инсерциями, даже если они всё ещё оставались чувствительными к RA. Более того, эти RA сигнальные репортерные линии не экспрессировались в некоторых тканях, нуждающихся в передаче сигналов RA (Perz-Edwards et al., 2001). Не смотря на то, что трансгенный RARE репортер мышей обладал более широкой экспрессией по сравнению с трансгенными рыбками данио (Rossant et al., 1991; Balkan et al., 1992), всё ещё неясно отражают ли они или нет усе передачи сигналов RA.
В попытке сделать более чувствительный к передаче сигналов RA репортер, мы сконструировали новый синтетический репортер передачи сигналов RA, состоящий из 12 сцепленных DR5 RARE элементов (Fig. 1C; Waxman and Yelon, 2011), вместо the 3 ранее использованных у мышей и рыбок данио (Rossant et al., 1991; Balkan et al.,1992; Perz-Edwards et al., 2001). Подобно их предшественникам, мы также использовали эту конструкцию в in vitro клеточной культуре и in vivo, чтобы получить стабильные трансгенные линии у рыбок данио. Поскольку 12XRARE трансгенные репортерные линии у рыбок данио были менее чувствительны к позиционным эффектам и были более чувствительными к передаче сигналов RA то стало ясно, что эти репортеры всё ещё не отражают экспрессии в всех тканях передачи сигналов RA (Waxman and Yelon, 2011). Поэтому мы решили создать дополнительно in vivo инструменты, которые будут дополнением к нашим RA сигнальным репортерным трансгенным линиям и помогут нашему пониманию расположения и механизмов передачи сигналов RA внутри эмбриона. Figure 1.
Предыдущие исследования in vitro использовали Gal4 DNA-binding domain (GDBD)/RAR domain слитые белки, чтобы выявить функциональные домены RARs (Nagpal et al., 1992; Allenby et al., 1993). Сравнительно недавно группы приспособили этот метод ligand trap strategy, для использования со многими др. ядерными гормональными рецепторами у стабильных трансгенных рыбок данио, чтобы идентифицировать лиганды для орфановых ядерных гормональных рецепторов (Tiefenbach et al., 2010). Преимущество слитых GDBD-RAR в том, что он может функционировать прежде всего как сенсор лиганда скорее, чем как лиганд-зависимый транскрипционный репортер взаимодействий RXR/RAR. Мы использовали эту стратегию, чтобы получать GDBD и VP16-GDBD (VPBD) слитые белки с лиганд-зависимым доменом для RARab (RLBD) рыбок данио (Fig. 1A, B; Hale et al., 2006; Waxman and Yelon, 2007). Мы охарактризовали эти трансгенные линии и установили, что оба слитых белка чувствительны к RA, хотя слитый VPBD-RLBD значительно более чувствителен и более аккуратно отражает локальные RA, базируясь на доменах экспрессии RA-продуцирующих и -деградирующих энзимов. Мы также сравнили экспрессию aGDBD-RLBD;UAS:mCherry трансгенной репортерной линии с одной из ранее описанных Tg(12XRARE-ef1a:EGFP) линий, используя конфокальную микроскопию. Мы пришли к выводу, что эти новые сенсорные RA линии могут дополнить имеющиеся инструменты и использоваться для анализа in vivo передачи сигналов RA во время развития и в др. контекстах.
DISCUSSION
Наша характеристика α-actin:GDBD-RLBD;UAS трансгенных репортеров подтвердила, что они чувствительны к и пригодны для обнаружения эмбриональной RA. Интересно, что регионализованная экспрессия с помощью GDBD-RLBD;UAS репортерной линии в среднем регионе эмбриона позади заднего мозга перекрывается существенно с предыдущими данными нашей репортерной трансгенной линии 12XRARE:EGFP (Waxman and Yelon, 2011). Экспрессия RA репортера сенсора начинается раньше и экспрессируется более широко, чем в случае 12XRARE:EGFP репортерной линии, что можно было предвидеть, поскольку RARE репортер зависит от RA плюс RAR/RXR взаимодействий. Более широкая экспрессия RA сенсорного репортера также подтверждает мнение, что имеются ткани, которые , скорее всего, чувствительны е RA, но не столь строго представляют экспрессию с помощью трансгенной линии 12XRARE:EGFP (Waxman and Yelon, 2011). Поскольку очень вероятно, что RLBD взаимодействует с транскрипционными активаторами и репрессорами (Aranda and Pascual, 2001; Bastien and Rochette-Egly, 2004), даже если теоретически он не должен зависеть от RXR (Tiefenbach et al., 2010), мы не может исключить, что тренскрипционные регуляторные белки, которые взаимодействуют с GDBD-RLBD слитым белком посредством RLBD, влияют на временную и пространственную экспрессию репортера (Bastien and Rochette-Egly, 2004). Важно, что регионализованная экспрессия RA сенсора и RARE трансгенных линий не коррелирует с экспрессией RA генов мишеней и чувствительными тканями во время ранней и средней стадией сомитогенеза (Grandel et al., 2002; Hernandez et al., 2004, 2007; Maves and Kimmel, 2005; Waxman et al., 2008; Feng et al., 2010). Однако, если сравнить β-actin:VPBD-RLBD;UAS репортер, то наша характеристика также подтверждает, что обе они могут выявлять более высокие уровни устойчивой RA.
Если сравнивать экспрессию β-actin:GDBD-RLBD;UAS и 12XRARE:EGFP репортеров с β-actin:VPBD-RLBD;UAS репортером, то становится ясно, что β-actin:VPBD-RLBD;UAS репортер экспрессируется значительно шире по всему трансгенному эмбриону и строже коррелирует с экспрессией aldh1a2, aldh1a3 и cyp26a1 (Grandel et al., 2002; Emoto et al., 2005; Maves and Kimmel, 2005; Liang et al., 2008; French et al., 2009). Поскольку мы не может устранить экспрессию репортера β-actin:VPBD-RLBD;UAS у трансгенных эмбрионов, то это указывает связанные возможности, которые не исключают др. др.: имеется некоторая транскрипционная активация UAS репортера с VPBD домена, которая не зависит от RA или имеются низкие уровни RA, которые всё ещё обнаруживаются с помощью VPDB-RLBD слитого белка, которые мы не можем устранить. Хотя мы не можем ещё делать различия между этими возможностями, имеется аргумент в пользу последней возможности, что если и имеется независимая от RA экспрессия репортера, мы не ожидаем иметь локальную экспрессию репортера, которая строго коррелирует с продукциейs RA и деградирующими энзимами. Более того, предыдущие исследования также продемонстрировали, что всё ещё имеется экспрессия чувствительных к RA генов у эмбрионов рыбок данио, даже при высоких концентрациях (5 µM) воздействия DEAB (Maves and Kimmel, 2005), это подтверждает, что воздействие DEAB , скорее всего, не полностью устраняет эмбриональную RA или передачу сигналов RA. Следовательно, исходя из предположения, что β-actin:VPBD-RLBD;UAS трансгенный репортер выявляет доступную эмбриональную RA, то наш анализ подтверждает провокационную гипотезу, что RA может быть доступной почти по всему эмбриону, включая наиболее передние ткани эмбриона, которые ранее не предполагались как воспринимающие эмбриональную RA на более ранних стадиях.
Мы полагаем, что VPBD-RLBD; UAS трансгенные линии также пригодны, информативны и являются дополнительными инструментами, усиливающими чувствительность к RA, с этой точки зрения они действительно ограничивают своё широкое использование, поскольку мы обнаружили, что они не выявляют достоверные флюктуации в экспрессии репортера, когда модулируется передача сигналов RA. Тем не менее этот анализ подкрепляет идею, что в будущем сходные стратегии с использованием альтернативных доменов активации транскрипции в комбинации со слитым белком GDBD-RLBD окажутся способными создавать высоко чувствительные репортерные линии, которые аккуратно выявят доступные низкие концентрации RA, элиминируя вероятность независимой от лиганда активации транскрипции.
Кроме того, будучи индикаторами чувствительности и доступности RA, наш конфокальный анализ RA сенсора и 12XRARE:EGFP трансгенных линий подтвердил, что такие трансгены , скорее всего, будут пригодными инструменатами для изучения развития RA-независимых процессов. В частности, мы представляем, что эти линии будут пригодны для изучения развития специфических популяций нейронов в головном мозге и спинном мозге благодаря экспрессии флюоресцентных белков в аксонах, а также в нефронах, где экспрессия персистирует столь долго, пока мы отслеживали экспрессию у эмбрионов. Итак, наши исследования с использованием трансгенных рыбок данио и метода слияния Gal4 служат прецедентом создания сходных линий для изучения передачи сигналов RA и функции др. ядерных гормональных рецепторов у др. модельных организмов.
|