В ходе развития retina progenitor cells (RPCs) приобретают разные состояния компетентности для спецификации клеточной судьбы путем постоянной подгонки своих прирожденных свойств в ответ на динамически меняющиеся локальные условия (Livesey and Cepko, 2001; Agathocleous and Harris, 2009; Wallace, 2011). В результате образуются 7 типов ретинальных клеток в перекрывающейся пространственно-временной последовательности между днем эмбриогенеза 11 (E11) и постнатальным днем 21 (P21) (Rodieck, 1998; Wallace, 2011).

Пронейральное basic helix-loop-helix (bHLH) семейство транскрипционных факторов имеет специальное значение для становления прирожденных свойств RPCs. Действуя в отдельности или в комбинации пронейральные bHLH факторы управляют детерминацией и формированием разных типов ретинальных клеток (Perron and Harris, 2000; Ohsawa and Kageyama, 2008). Напр., Atoh7, мышиный ортолог Drosophila Atonal, впервые экспрессируется на E11 в субнаборе RPCs и является важным для становления состояния компетентности к судьбе retinal ganglion cell (RGC) (Brown et al., 1998; Yang et al., 2003; Brzezinski et al., 2012). Дифференцировка RGC начинается вскоре в субпопуляции Atoh7-экспрессирующих RPCs. Генетическое устранение Atoh7 приводит ~95% к потере формирования RGC (Fig. 1A) (Brown et al., 2001; Wang et al., 2001). В то же самое время, др. пронейральные bHLH факторы, особенно заметно Neurod1, Math3, Mash1 и Ptf1a, обнаруживаются в разных субпопуляциях RPCs и они необходимы для становления судеб не-RGC клеток (Vetter and Brown, 2001; Akagi et al., 2004; Hatakeyama and Kageyama, 2004; Le et al., 2006; Ohsawa and Kageyama, 2008; Trimarchi et al., 2008). Делеция Neuord1 ведет к потере M-cone типа клеток (Fig. 1B) (Liu et al., 2008), а делеция Ptf1a в субпопуляции RPCs ведет к потере горизонтальных и амакринных клеток (Fujitani et al., 2006). Кроме того, более сложные перекрестные регуляторные взаимодействия между bHLH генами часто необходимы для становления ретинальных типов клеток. Делеция Neurod1 и Math3 вместе ведет к отсутствию амакринных клеток (Inoue et al., 2002),а делеция Math3 и Mash1 регулирует генез биполярных клеток (Hatakeyama and Kageyama, 2004). Пронейральные bHLH гены также участвуют в спецификации специфических субтипов ретинальных клеток. Bhlhb5, член oligo подсемейства bHLH факторов, необходим для формирования type 2 off-cone биполярных клеток и избирательно GABAergic амакринных клеток (Feng et al., 2006). В постнатальной сетчатке, Neurod2 экспрессируется в субнаборах RPCs, Dab+ AII амакринных клетках (AII ACs), RGCs и колбочковых биполярных клетках. Потеря Neurod2 ведет к снижению формирования AII ACs (Cherry et al., 2011), однако неправильная экспрессия Neurod2 вызывает продукцию амакринных клеток и RGCs. Neurod6 обнаруживается в nGnG амакринных клетках, во вновь открытом подклассе подтипов амакринных клеток, и достаточен, чтобы обеспечить формирование этого субкласса амакринных клеток (Kay et al., 2011; Cherry et al., 2011).

Мозаичный пространственно-временной паттерн пронейральных bHLH факторов в развивающейся сетчатке, который, по-видимому, отражает состояние компетенции RPCs, ставит вопрос, как эти bHLH факторы действуют независимо и синергично др. с др. и с non-bHLH факторами, чтобы регулировать состояние компетентности RPCs. Преобладающим мнением относительно детерминации судьбы клеток в развивающейся сетчатке является, что рассеянные пространственно-временные паттерны экспрессии Atoh7, Neurod1 и др. факторов возникают стохастически. Это означает, что все RPCs обладают эквивалентным онтогенетическим потенциалом. Начало экспрессии bHLH гена базируется на подавлении передачи сигналов Notch в субнаборе RPCs (Wallace, 2011). Будучи однажды установленным, каждый субнабор RPCs обнаруживает склонность давать определенный тип нейронов в зависимости от bHLH факторов, ими экспрессируемых (Agathocleous and Harris, 2009; Wallace, 2011).

Ранее мы проверяли, может ли замещение одного bHLH гена другим перенаправлять RPCs с одной клеточной судьбы в др. (Mao et al., 2008b). Мы вставляли Neurod1 в локус Atoh7 и показали, что Neurod1 замещает функцию Atoh7 по спецификации судьбы RGC. Результаты подтвердили, что Atoh7-экспрессирующие RPCs в основном программируются с помощью прирожденных механизмов, которые зависят не только от специфического пронейрального bHLH гена (Fig. 1C). В том же самом исследовании мы показали, что Math3 не компенсирует потерю Atoh7. Поэтому мы пришли к заключению, что Neurod1 и Atoh7 имеют сходные гены мишени в развивающейся сетчатке, тогда как Math3 нет. Не смотря на тот факт, что Neurod1 обычно функционирует в RPCs, предназначенных приобрести судьбу амакринных клеток и M-cone клеток, он приспосабливается и интегрируется в чужеродную среду RPCs, предназначенных стать RGC. Отметим, Neurod1-нулевая сетчатка продуцирует полный комплект RGCs, демонстрируя тем самым, что Neurod1-экспрессирующие RPCs играют небольшую, если вообще роль в дифференцировке RGC (Liu et al., 2000; Pennesi et al., 2003; Liu et al., 2008). Следовательно, Neurod1-экспрессирующие RPCs, в отличие от Atoh7-экспрессирующих RPCs, не запрограммированы по своей природе к образованию RGC. Эти результаты снова говорят против того, что RPCs одинаково наделены потенциалом генерировать множественные типы клеток в одно и то же время онтогенеза. Тогда замещение Atoh7 на Neurod1 д. репрограммировать Atoh7-экспрессирующие RPCs в амакринные клетки или M-cone клетки, которые они обычно не дают.

В данном исследовании мы осуществили противоположный эксперимент по вставлению Atoh7 в локус Neurod1. Целью было определить, какая модель лучше всего описывает поведение Neurod1-экспрессирующих RPCs: (1) Atoh7 компенсирует потерю Neurod1, чтобы восстанавливать M-cone клетки; (2) Atoh7 не допустим в Neurod1-экспрессирующих RPCs и не может компенсировать отсутствие Neurod1; или (3) Atoh7 действует доминантно как основной регулятор компетентности RGC (Fig. 1D).

Эксперименты, описанные ниже, показали, что Atoh7 сам по себе достаточен, чтобы перенаправить RPC, предназначенные стать amacrine/M-cone клетками, на приобретение судьбы RGC, и что ранее возникшие Neurod1-экспрессирующие RPCs от природы запрограммированы давать RGCs, однако они нуждаются в Atoh7, чтобы сделать это. Вместе с нашими предыдущими результатами (Mao et al., 2008b), мы полагаем, что в раннем ретиногенезе большинство RPCs обладает онтогенетическим потенциалом дифференцироваться в RGCs. Однако внешнее окружение играет роль в этом процессе, д. существовать незначительные прирожденные отличия между разными субпопуляциями RPC, которые могут быть преодолены за счет экспрессии Atoh7. Кроме того, мы идентифицировали bona fide Atoh7-связывающий энхансер в области интрона 3 neurexin III (Nrxn3). Мы продемонстрировали, что этот энхансер связывается и используется с помощью Atoh7, но не с помощью Neurod1 в развивающейся сетчатке. Помещая энхансер Nrxn3 рядом с базальным промотором, мы показали, что энхансер распознается с помощью и Atoh7 и Neurod1. Следовательно, Nrxn3 энхансерный элемент избирательно используется сходными факторами зависимым от контекста способом, обеспечивая тем самым механизм детерминации специализированных функций, которые существуют среди множества пронейральных bHLH факторов.