Развитие ЦНС начинается в конце гаструляции, когда сигналы от ходы индуцируют лежащую поверх эктодерму формировать нервную пластинку. Посредством серии морфологических изменений в форме клеток, возникают латеральные края нервной пластинки и сливаются по срединной линии, образуя нервную трубку. Первые признаки регионализации и спецификации становятся очевидными, когда передняя часть нервной трубки подразделяется на серию пузырьков головного мозга. Эти пузырьки составляют морфологическую основу отличающихся функциональных единиц головного мозга. Телэнцефалический пузырек в нервной трубке находится на самом переднем конце и дает кору головного мозга, базальные ганглии и гиппокамп. Соседний диэнцефалический пузырек является эмбриональным зачатком таламуся, гипоталамуса и шишковидной железы. Боковые выпячивания диэнцефалона, зрительные пузырьки, дают большую часть структур взрослых глаз. Более каудально мезэнцефалический пузырек генерирует важные центры сенсорного и двигательного контроля, тогда как задний мозг дает мозжечок, мост и продолговатый мозг (medulla). TALE гомеодоменовые белки экспрессируются в каждом из этих пузырьков головного мозга у эмбрионов и взрослых, подтверждая, что они участвуют во множестве различных онтогенетических процессов, включая рост первичного нейроэпителия, выбор клетками нейрональной судьбы, миграцию клеток и формирование нервных связей (circuits).

TALE (three amino acid loop extension) белки являются атипичными содержащими гомеодомен транскрипционными факторами, характеризующимися присутствием трех дополнительных аминокислот между первой и второй спиралью гомеодомена (Burglin, 1997). Эти три аминокислоты почти всегда представлены мотивом proline-tyrosine-proline, вставленным после позиции 23 в гомеодомене. В царстве животных, TALE транскрипционные факторы представлены тремя подклассами: (i) MEINOX (т.e., Meis/Prep) семейство генов, которые включают у позвоночных Meis1-3, Prep1-2 (также известны как Pknox1-2), Tgif1-2, также как и у Drosophila homothorax (hth) и у C. elegans unc-62; (ii) PBC семейство, включает у позвоночных Pbx1-4, у мух extradenticle (exd) и у червей ceh-20; и (iii) более удаленное семейство Iroquois (Iro) (Cavodeassi et al. (2001) or Gamez-Skarmeta and Modolell (2002).

HOX-DEPENDENT FUNCTIONS OF TALE PROTEINS: HINDBRAIN DEVELOPMENT

Задний мозг контролирует критические физиологические процессы, такие как двигательная активность, дыхание, сон и кровообращение. Задний мозг эмбрионов подразделен на семь метамерных сегментных единиц, известных как ромбомеры (r1-r7). Наиболее передней границей r1 является средний мозг, тогда как наиболее задней границей r7 является передняя часть спинного мозга. Каждый ромбомер обладает уникальной экспрессией генов, которая способствует регион-специфической дифференцировке нейронов. Эти компартментализованные единицы становятся высоко консервативными во время эволюции позвоночных и действуют в качестве матрицы для структуры и функции заднего мозга взрослых. TALE и HOX семейства транскрипционных факторов играют ключевую роль в предопределении судеб ромбомерных клеток, качественных особенностей вдоль передне-задней (AP) оси. Сигнальные пути, такие как канонический Wnt, fibroblast growth factor (FGF) и ретиноевой кислоты взаимодействуют с Meis/Pbx/Hox белками множественными способами, чтобы вызвать развитие заднего мозга и, следовательно, контролировать качественные особенности ромбомеров.

Meis, Pbx, and Paralogous Group 1-4 Hox Proteins Regulate Hindbrain Development

Meis1 и Meis3 TALE семейство гомеобоксных белков необходимо для собственно формирования заднего мозга у эмбрионов Xenopus и рыбок данио (Dibner et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001; Choe et al., 2002; Maeda et al., 2002). Ген meis3 экспрессируется, самое раннее, на ст. поздней гаструлы в презумптивном регионе заднего мозга, позднее оказывается локализованным в r2-r4 регионе (Salzberg et al., 1999; Dibner et al., 2001; Vlachakis et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001). Экспрессия генов meis1 и meis2 менее ограничена, распространяется более широко в более передние регионы нервной пластинки, тогда как экспрессия эмбрионального гена prep повсеместна (Cecconi et al., 1997; Oulad-Abdelghani et al., 1997; Ferretti et al., 1999; Maeda et al., 2001, 2002; Sanchez-Guardado et al., 2011; Waskiewicz et al., 2001; Zerucha and Prince, 2001). Потеря функции белка Meis3 за счет или доминантно-негативных или антиморфных белков, morpholino (MO)-based нокдауна экспрессии или генетических мутаций, ведет к потере всего региона заднего мозга, сопровождаемой потерей экспрессии большого количества маркеров заднего мозга, включая гены Hox paralogous group (PG) 1-4 . Это совпадает с экспансией кзади передних маркеров переднего мозга и увеличением структур переднего мозга. Meis3 также достаточен для индукции заднего мозга, т.к. его избыточная экспрессия индуцирует формирование эктопического заднего мозга, при этом репрессируется формирование переднего мозга как в эмбрионах, так и эксплантах (Salzberg et al.,1999; Dibner et al., 2001, 2004; Vlachakis et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001; Elkouby et al., 2010; Gutkovich et al., 2010). У эмбрионов рыбок данио Meis3 действует совместно с HoxB1b (HOXA1 у др. позвоночных) белком, чтобы индуцировать экспрессию маркеров заднего мозга, таких как hoxb1a и krox20 (Vlachakis et al.,2001). Сходным образом, совместная экспрессия HoxD1 и Meis3 усиливает экспрессию маркеров hoxb3 и krox20 (Dibner et al., 2004). Более того, hoxd1 является непосредственной мишенью для Meis3 у Xenopus, действуя ниже Meis3, чтобы индуцировать судьбы клеток заднего мозга (Dibner et al., 2004; Gutkovich et al., 2010).

Из семейства PBC белок Pbx4 (lazarus) непосредственно взаимодействует с Meis1 и Meis3 белками рыбок данио, а пертурбации активности Pbx2 или Pbx4 элиминируют клеточные судьбы r2-r6 (Popperl et al., 1995; Vlachakis et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001, 2002). Сходным образом, Meis1 and Pbx1 белки взаимодействуют, чтобы регулировать спецификацию судеб нервных клеток у Xenopus, а нокдаун Pbx1 также нарушает формирование заднего мозга (Maeda et al., 2002). У Xenopus белки Pbx1 и HoxD1 строго активируются гетерологичным мышиным hoxb1 энхансером, но Meis3 не обнаруживает дополнительных эффектов с белками, протестированными в отдельности или вместе (Chan et al., 1996; Dibner et al., 2004). Партнер белка Pbx, который усиливает активность Meis3 у Xenopus, не идентифицирован. Интересно, что у рыбок данио эктопическая экспрессия Meis1 восстанавливает формирование заднего мозга в отсутствие зиготического белка Pbx4. Это подтверждает потенциал Pbx-независимого механизма активности, хотя нельзя исключить полностью участие материнского Pbx белка (Waskiewicz et al.,2001).

PG1 Hox белки являются ключевыми факторами, контролирующими раннюю спецификацию заднего мозга. Белки группы PG1 Hox являются гомологами гена Drosophila labial и включают HOXA1, HOXB1 и HOXD1 белки. У всех позвоночных экспрессия PG1 Hox генов предшествует экспрессии всех остальных Hox генов в презумптивном регионе заднего мозга на ст. ранней гаструлы и сохраняется в течение стадии нейрулы (Wilkinson et al.,1989; Frohman et al., 1990; Sundin et al., 1990; Murphy и Hill, 1991; Frohman и Martin, 1992; Godsave et al., 1994; Kolm et al., 1997; Rossel и Capecchi,1999; McClintock et al., 2002; McNulty et al., 2005). PG1 гены важны для правильной индукции и сегментации заднего мозга. Комбинированный нокдаун HoxB1a и HoxB1b белков у рыбок данио или делеция Hoxa1 и Hoxb1 генов у эмбрионов мышей ведут к существенной редукции или к полной потере ромбомеров r4 и 5 (Lufkin et al., 1991; Chisaka et al., 1992; Studer et al.,1996, 1998; Gavalas et al., 1998; Rossel и Capecchi, 1999; McClintock et al.,2001, 2002). У эмбрионов Xenopusтройной нокдаун всех генов PG1, hoxa1,hoxb1 и hoxd1 ведет к полной потере r2-6 и весь задний мозг напоминает регион r1, не экспрессирующий Hox (McNulty et al., 2005). Этот фенотип напоминает таковой при потере функции Pbx2 у эмбрионов рыбок данио и указывает на кооперативную функцию Pbx2 и PG1 Hox белков в спецификации регионов r2-6 (Waskiewicz et al., 2002). Подтверждает это предположение то, что HOXA1 hexapeptide мутантные белки, которые неспособны взаимодействовать с PBX белками вызывают тяжелые фенотипические отклонения у мышей (Remacle et al., 2004). Более того, комбинированный фенотип от потери функции PG1 синергично сильнее, чем для каждого из индивидуальных ингибиторов и у Xenopus, нокдаун PG1 может быть устранен с помощью избыточной экспрессии лишь HoxD1 белка. Это подтверждает, по крайней мере, частично функциональную перекрываемость между членами группы PG1 (McNulty et al., 2005).

Ранняя экспрессии белков PG1 является обязательным условием для собственно последовательной экспрессии позднее, более кзади экспрессирующихся PG2-4 Hox генов (Dibner et al.,2004; McNulty et al., 2005). У PG2 мутантных мышей развитие региона r3/r4 нарушается, в результате нарушения образования границы между r2/r3. Клетки в r2 экспрессируют только Hoxa2, самый передний из всех Hox генов, а потеря функции Hoxa2 вызывает частичное превращение судьбы из r2 в r1 (Prince и Lumsden, 1994; Gavalas et al.,1997; Davenne et al., 1999; Barrow et al., 2000; Ren et al., 2002; Oury et al., 2006). R3 экспрессирует Hoxa2 и Hoxb2. Мыши, мутантые тольк по Hoxb2 не обнаруживают дефектов сегментации заднего мозга, у Hoxa2/Hoxb2 двойных мутантных мышей, границы r2/3 и r3/r4 теряются, указывая на синергичную функцию обоих генов PG2 (Davenne et al., 1999). Hox PG1 и PG2 гены экспрессируются в r4, но с временными отличиями. У многих PG3 мутантов качественные особенности r5/6 нарушены и эктопически активируется r4-специфическая экспрессия Hoxb1 в r5/6 (Gaufo et al.,2003). У PG4 мутантов, напротив, развитие заднего мозга происходит нормально (Horan et al., 1995).

Signaling Pathways Induce and Shape the Hindbrain Primordium: Wnt/β-catenin, FGF, и Retinoic Acid

Канонический путь передачи сигналов Wnt регулирует физиологические процессы у эмбрионов и взрослых. Аномальна передача сигналов Wnt участвует в возникновении многих болезней человека, таких как рак, старение и дегенеративные нарушения (reviewed in Moon et al.,2004; Clevers, 2006). Wnt-лиганд запускают каскад событий, ведущий к активации транскрипции репрессированных генов мишеней. В отсутствие взаимодействия Wnt-лиганд, β-catenin направляется на обеспечиваемую ubiquitin деградацию за счет активностей Axin, APC и glycogen synthase kinase-3β (GSK3β). Секретируемые Wnt белки связывают Frizzled (Fz) и низкой плотности lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) рецепторный комплекс. Wnt-лиганд соединение запускает фосфорилирование LRP6, которое в конечном итоге предупреждает деградацию β-catenin. Стабилизированный β-catenin белок затем подвергается транслокации в ядро, где он связывает TCF/LEF белки и непосредственно активирует транскрипцию генов (MacDonald et al., 2009).

Передача сигналов Wnt/β-catenin является обязательной для экспрессии большинства Hox генов заднего и спинного мозга во время спецификации нервной пластинки у позвоночных, включая PG1 Hox белки. Многие Wnt лиганды экспрессируются в развивающейся нервной системе эмбрионов позвоночных (rev. Elkouby и Frank, 2010). Их участие в заднем нейральном развитии впервые было показано с помощью Wnt1 и Wnt3a дефицитных эмбрионов мыши, у которых структцры среднего, заднего и спинного мозга оказывались неспособны развиваться лродным образом (McMahon et al., 1992; Augustine et al.,1995, 1993). Wnt3 нулевые эмбрионы мышей обнаруживали сходный фенотип заднего укорочения с драматической экспансией маркеров переднего мозга и потерей экспрессии Hoxb1 в r4 (Liu et al., 1999). Сходное наблюдение было сделано на ранней стадии эмбрионов кур, которым имплантировали кусочки, смоченные растворимой ингибирующей формой Frizzled рецептора (mFrz8-CRD), у них маркеры переднего мозга распространялись шире, а экспрессия маркеров заднего мозга подавлялась (Nordstrom et al., 2002). Кроме того, у mFrz8-CRD обработанных задних нейральных эксплантов экспрессия маркеров заднего и спинного мозга также элиминировалась (Nordstrom et al., 2002, 2006). Потребность в передаче сигналов Wnt для заднего нейрального развития подтверждена на эмбрионах Xenopus, т.к. экспрессия доминантно-негативного белка Wnt (ингибирующего активность Wnt1, Wnt3a и Wnt8) вызывает anteriorized фенотип. Более того, подобно Wnt3^-/- эмбрионам мышей, эти эмбрионы обнаруживали дефекты закрытия нервной трубки (McGrew et al., 1997). Недавно потребность в происходящем из мезодермы Wnt3a для индукции заднего мозга была выявлена в экспериментах по нокдауну у Xenopus (Elkouby et al., 2010). Wnt3a морфанты эмбрионы обнаруживали дефекты нейральной конвергенции и вытягивания, при этом наблюдалась каудальная экспансия маркеров переднего мозга и исчезновение маркеров заднего мозга на ст. нейрулы. Наконец, обработка эмбрионов рыбок данио специфическими Wnt3a- и Wnt8-MOs подтвердила их роль в развитии заднего и спинного мозга (Erter et al., 2001; Lekven et al., 2001).

Передача сигналов Wnt3a и активность генов Meis/Hox тесно связаны во время индукции заднего мозга. У Wnt3a морфантов эмбрионов Xenopus на ст. гаструлы, начало экспрессии meis3 и hoxd1 теряется в презумптивной нейральной пластинке (Elkouby et al., 2010). Фактически, meis3 и hoxd1 являются непосредственными генами мишенями β-catenin (Elkouby et al., 2010; Janssens et al., 2010; Rieden et al., 2010). Xenopus meis3 промотор/энхансер обладают двумя законсервированными сайтами связывания β-catenin, которые необходимы для управления экспрессией репортеров в заднем мозге. Эти два сайта, связываются β-catenin in vivo (Elkouby et al., 2010). Более того, эктопическая экспрессия Meis3 может устранять фенотип потери заднего мозга у эмбрионов, дефицитных по зиготической передаче сигналов Wnt (экспериментально индуцируемой или инъекцией Wnt3a-MOs или эктопической экспрессией Dkk1). Следовательно, индуцирующая задний мозг активность Wnt3a в основном обеспечивается с помощью Meis3. К тому же, поскольку правильная экспрессия PG2-4 Hox генов зависит от соотв. индукции PG1 Hox генов, то позднее экспрессия Hox генов в заднем мозге косвенно регулируется с помощью Wnt пути (Dibner et al.,2004; McNulty et al., 2005; Rieden et al., 2010). Т.о., у Xenopus прямая индукция экспрессии meis3 и PG1 Hox генов с помощью Wnt/β-catenin пути является одной из самых ранних ступеней программы развития заднего мозга, это ставит передачу сигналов Wnt на вершину этой иерархии.

Интересно, что Meis3 индуцирует позднюю специфичную для нервной пластинки экспрессию гена wnt3a (Elkouby et al., 2012). Взаимная позитивная регуляция между клеточно автономным транскрипционным регулятором, подобным Meis3, и секретируемым белком, подобным Wnt3a, д. теоретически приводить к обильной экспрессии обоих белков и тем самым к прогрессивной caudalization всей нервной пластинки. Это предупреждается с помощью двойной негативной петли обратной связи: Wnt3a активирует экспрессию белка цинковые пальчики Teashirt 1 (Tsh1), который в свою очередь негативно регулирует активность Meis3 и тем самым ограничивает его активность регионом заднего мозга (Elkouby et al., 2012).

Fibroblast growth factors (FGFs) являются сигнальными лигандами, которые регулируют образование мезодермы и нейроэктодермы и обеспечивают формирование паттерна во время раннего развития позвоночных (rev. Dorey и Amaya, 2010). Передача сигналов FGFs осуществляется посредством специфических рецепторных тирозин киназ, расположенных в клеточной мембране. Путь передачи сигналов FGF является критическим для правильной дифференцировки многих клеток и тканей у эмбрионов, а нарушение передачи сигналов FGF ассоциирует с широким спектром патологий, таких как дефекты скелета, нейродегенеративные болезни, метаболические нарушения и рак.

экспрессия FGF3/8 в заднем мозге законсервирована у всех позвоночных (Mahmood et al., 1995; Lombardo et al., 1998; Maves et al., 2002; Walshe et al.,2002). У эмбрионов рыбок данио fgf3 и fgf8 гены экспрессируются в презумптивной области примордия заднего мозга на 80-90% epiboly, перед началом экспрессии маркеров сегментации заднего мозга (Maves et al., 2002; Walshe et al.,2002). При инициации сегментации транскрипты fgf3/8 экспрессируются широко в центральном регионе r4 region, с перекрыванием области r3/r5. Когда формируются морфологически различимые сегменты fgf3 продолжает экспрессироваться в r4, но экспрессия fgf8 гаснет, при этом наблюдается новый сдвиг экспрессии в более переднюю область перешейка. Ранняя передача сигналов FGF3/8 в r4 образует первичный центр индукции заднего мозга (Maves et al., 2002; Walshe et al., 2002). Это впервые наблюдалось у эмбрионов кур и рыбок данио, у которых трансплантированные клетки r4 индуцировали эктопическую экспрессию маркеров r5/6, окружающих трансплантат, фенотип сильно напоминающий таковой при эктопической экспрессии FGF3/8 (Graham и Lumsden, 1996; Maves et al., 2002). Активности FGF3 и FGF8 функционально перекрываются, поскольку сильный фенотип потери заднего мозга, обнаруживается только после нокдауна обоих белков (Maves et al., 2002; Walshe et al., 2002). Следовательно, ранняя экспрессия генов fgf3 и fgf8 является критической для инициальной индукции заднего мозга.

У эмбрионов Xenopus, рыбок данио и кур передача сигналов FGF действует ниже передачи сигналов Wnt (Domingos et al., 2001; Rhinn et al., 2005; Nordstrom et al., 2006; Elkouby et al., 2010). Это, по крайней мере, частично обеспечивается с помощью Meis3, поскольку белок Meis3 непосредственно активирует экспрессию генов fgf3 и fgf8, а экспрессия fgf3 в r4 теряется у Meis3 морфантных эмбрионов Xenopus (Gutkovich et al., 2010). Это согласуется с частой гетеродимеризацией Meis и Pbx белков, функция белков Pbx2 и Pbx4 необходима также для начала экспрессии fgf3 и fgf8 в заднем мозге рыбок данио (Waskiewicz et al., 2002). Заметим, что белок Meis3 не может индуцировать судьбы клеток заднего мозга в отсутствие ниже стоящей передачи сигналов FGF/MAPK, это указывает на о. что Meis3-обусловленная активация пути FGF/MAPK является центральным аспектом его caudalizing активности (Ribisi et al., 2000; Aamar и Frank, 2004). Protein phosphatase 1 регуляторная субъединица (ppp1r14al) белка также участвует в спецификации индуцирующего центра заднего мозга в r4. Ген ppp1r14al прямо активируется с помощью HoxB1b/Meis3 белков в r4 эмбрионов рыбок данио, а Meis3/Pbx4/HoxB1b белки соединяются с его энхансером in vivo (Choe et al.,2011). Ppp1r14al, в свою очередь, регулирует активацию экспрессии fgf3 в r4, тогда как формирование заднего мозга сильно нарушается с помощью нокдауна белка ppp1r14al.

экспрессия PG2-3 Hox генов также зависит от FGF. FGF3 косвенно активирует экспрессию Hoxa2, Hoxb2 и Hoxb3 путем индукции транскрипционных факторов Pea/Krox20 (Manzanares et al., 1999, 2002; Maconochie et al., 2001; Weisinger et al., 2010). У мышей и рыбок данио промотор Krox20 имеет функциональный r3-специфичный сайт связывания Hox/Meis/Pbx, хотя он, по-видимому, не является непосредственной Meis3-мишенью у Xenopus (Wassef et al., 2008; Stedman et al., 2009; Elkouby et al., 2010). У эмбрионов рыбок данио транскрипционная активация krox20 также нуждается в варианте белка hepatocyte nuclear factor-1 (vHnf1), который содействует активности FGF по индукции экспрессии генов mafb/kreisler/valentino и krox20. vHnf1 белок в свою очередь репрессирует экспрессию hoxb1, ограничивая его экспрессию r4, и тем самым делая возможным выбор судеб для более задних ромбомеров (Wiellette и Sive, 2003; Hernandez et al., 2004). Впоследствии vHnf1 вместе с Mafb активирует экспрессию hoxa3 и hoxb3 в r5/6, чтобы специфицировать качественные особенности r5/6 (Manzanares et al., 1999; Hernandez et al., 2004). Т.о., в заднем мозге, r4 FGF-индуцирующий центр устанавливается в кардинальной позиции, действуя ниже белков Meis/Pbx/Hox PG1 группы, но выше активности PG2-3 Hox генов.

Ретиноевая кислота (RA) является производным витамина A, который действует как мощный сигнальный лиганд во время раннего развития позвоночных. RA действует как диффундирующий морфоген, а избыток RA во время эмбриогенеза нарушает развитие головного мозга, конечностей, сердца, кишечника и др. органов. Синтез и уровни RA и тонко регулируются благодаря взаимодействию и дифференциальной экспрессии RA синтезирующих и RA деградирующих энзимов (rev. White и Schilling, 2008). RA связывает RA рецепторы (RARs), которые контактируют с ДНК как гетеродимеры с retinoid X рецепторами в транскрипционных регуляторных регионах, наз. retinoic acid response elements (RAREs). Связывание RA изменяет конформацию RAR, которая модулирует связывание дополнительных транскрипционных регуляторных белков, которые могут активировать или репрессировать экспрессию генов.

В заднем мозге позвоночных, RA является критической для образования задних ромбомеров. Ингибирование передачи сигналов RA вызывает потерю r4 - r7 регионов, тогда как избыток активности RA вызывает расширение задних ромбомеров, при этом параллельно теряются передние ромбомеры (rev. White и Schilling,2008). RA играет критическую роль путем регуляции экспрессии генов Hox PG1-4 (Bel-Vialar et al., 2002). Гены Hoxa1, Hoxb1, Hoxa4, Hoxb4 и Hoxd4 содержат сильно законсервированные RAREs, которые действуют как позитивно так и негативно, модулируя корректность пространственной и временной экспрессии этих генов в заднем мозге (Whiting et al., 1991; Langston и Gudas, 1992; Popperl и Featherstone,1993; Moroni et al., 1993; Marshall et al., 1994; Studer et al., 1994, 1998; Frasch et al., 1995; Dup? et al., 1997; Gould et al., 1998; Nolte et al., 2003). У Xenopus, гены hoxd1 и hoxa1 являются непосредственными мишенями для RA (Kolm et al., 1997). Сходным образом, высоко консервативные 3' RAREs в генах Hoxa1 и Hoxb1 мышей необходимы для их инициальной активации в регионе r3/4 region (Langston и Gudas, 1992; Marshall et al., 1994; Frasch et al., 1995). Уровни RA в заднем мозге регулируются c помощью временного и пространственного взаимодействия RA синтезирующих и деградирующих энзимов, aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 (ALDH1a2/Raldh2), и Cyp26 (White и Schilling, 2008). У мышей и Xenopus, экспрессия мезодермального гена Raldh2 регулируется c помощью HOXA1/PBX1/MEIS2 белков и все три белка связывают консервативный энхансерный элемент в гене Raldh2 in vivo (Vitobello et al.,2011). Поэтому мутанты Hoxa1/Pbx1/Meis2 или эмбрионы, подвергнутые нокдауну, обнаруживают дефекты истощения RA в заднем мозге, вызываемые ослаблением синтеза RA из=за подавления экспрессии мезодермального гена Raldh2 (Vitobello et al., 2011).

RA активирует более передние Hox PG1 гены, что сопровождается более поздней активацией PG2-4 Hox генов. Первоначально, Hoxa1 действует совместно в белками Meis/Pbx и RA, чтобы активировать экспрессию hoxb1. Hoxb1 в свою очередь, запускает каскад событий посредством Krox20, это ведет к активации экспрессии hoxa2, hoxb2, и hoxb3. Кроме того, активность Meis3 необходима для RA-обеспечиваемой индукции экспрессии гена hoxd1, а активности Meis3 и RA действуют совместно, чтобы индуцировать hoxd1 , а экспрессия рецепторного для ретиноевой кислоты гена RARa2.2 в заднем мозге Xenopus, т.о., тонко регулирует формирование паттерна активности RA (Dibner et al., 2004). У эмбрионов рыбок данио, ранняя экспрессия cyp26 и hoxb1b перекрывается в заднем мозге, подтверждая, что уровни RA д. тонко контролироваться в регионе r4 (Kudoh et al., 2002). Дальнейшим подтверждением этого механизма тонкой настройки, явилось то, что RA действует, чтобы репрессировать экспрессию Hoxb1 вне r4 посредством 5' RARE, как это было показано на эмбрионах кур и мышей (Studer et al.,1994). Позднее RA непосредственно активирует экспрессию более задних Hox PG4 генов в r6/7 (Whiting et al., 1991; Moroni et al., 1993; Popperl и Featherstone, 1993; Morrison et al., 1997; Gould et al., 1998; Nolte et al., 2003;). Передача сигналов RA действует ниже передачи сигналов FGF у Xenopus и рыбок данио. У рыбок данио эктопическая активность FGF3 ингибирует экспрессию cyp26, тогда как впереди расширяет экспрессию hoxb1. Напротив, ингибирование передачи сигналов FGF увеличивает экспрессию cyp26, в тоже время редуцирует экспрессию hoxb1b (Kudoh et al., 2002). Удивительно, хотя основное построение (blue-print) заднего мозга идентично у всех позвоночных, некоторые аспекты индукции заднего мозга, по-видимому, отличаются. Напр., у рыбок данио уровни экспрессии гена meis3 высоко чувствительны к уровням RA, но этого не происходит у Xenopus, где уровни экспрессии meis3 вдоль АP оси слегка сдвинуты, но не достоверно изменяются при модулировании уровней передачи сигналов RA (Kudoh et al., 2002; Dibner et al., 2004).

Итак, экспериментальные наблюдения на разных видах позвоночных подтверждают модель инициальной индукции заднего мозга, согласно которой передача мезодермальных сигналов Wnt3a первоначально действует выше белков Meis3/Pbx (Fig. 1A). Meis/Pbx белки в последствие индуцируют экспрессию PG1 Hox и FGF3/8 генов в r4, которые в дальнейшем активируют экспрессию Hox генов. Уровни мезодермального Raldh2 и нейрального Cyp26 контролируют уровни RA в заднем мозге. Комбинированная активность Meis/Pbx/Hox белков тонко настраивается c помощью уровней RA в заднем мозге, чтобы специфицировать дифференциальную экспрессию Hox генов и сегментацию заднего мозга на разные ромбомеры вдоль AP оси (Fig. 1B). Это простейшая унифицированная модель для инициальной индукции заднего мозга, включая передачу сигналов Wnt, FGF и RA и активности белков Meis/Pbx/Hox. Безусловно, эта модель упрощает сложные нюансы потенциальных региональных и временных взаимодействий между Meis/Pbx, разными Hox белками и сигнальными путями на разных AP уровнях заднего мозга. Необходимо дальнейшее выяснение нижестоящих генов мишеней для Meis/Pbx/Hox, чтобы полностью понять сложную природу всех этих взаимодействий и их эффекты на экспрессию генов заднего мозга и формирование паттерна. Figure 1.

Upstream и Downstream to TALE и Hox Proteins in the Hindbrain

Во время развития заднего мозга, Meis/Pbx и Hox белки взаимодействуют на двух разных уровнях. В раннем развитии Meis белки необходимы для инициальной активации экспрессии PG1-4 Hox генов заднего мозга. Позднее, комбинации Meis/Pbx/Hox белков соединяются с генами мишенями, чтобы активировать их транскрипцию. Некоторые из этих генов Hox также активируют самих себя, но гены мишени non-Hox также располагаются ниже Meis/Pbx/Hox (Rohrschneider et al., 2007; Choe et al., 2011). Meis/Pbx белки действуют как транскрипционные активаторы в индукции заднего мозга (Dibner et al., 2001). У эмбрионов рыбок данио, ChIP исследования показали, что Meis/Pbx белки специфически связывают промоторы hoxb1a и hoxb2a в соотв. тканях их экспрессии (Choe et al., 2009). Эти промоторы также оказались обогащены ацетилированием гистона H4. У эмбрионов, эктопически экспрессирующих доминантно негативные Pbx белки, активность Meis/Pbx была ингибирована и ацетилирование гистонов си ль но снижено. Более того, формирование белкового комплекса Meis/Pbx удаляет histone deacetylase (HDAC) с Hox регулируемх промоторов. Кроме того, Meis также, по-видимому, является критическим для рекрутирования CBP/p300 гистоновой ацетилазы на Hox промоторы. Т.о., функция Meis в качестве прямого транскрипционного активатора генов мишеней осуществляется путем контроля доступности HDAC/CBP белков на промотор hoxb1a (Choe et al., 2009).

В ромбомерных сегментах экспрессия Hox генов контролируется c помощью ауто - и перекрестно-регуляторного связывания Meis/Pbx/Hox белков с энхансерными элементами. Напр., мышиный энхансер гена Hoxb1, который управляет экспрессией в r4, обладает самостоятельными Meis/Pbx и Hox/Pbx сайтами связывания. HOXA1 вместе с белками Meis/Pbx первоначально активирует этот энхансер, но позднее HOXB1 сам по себе, вместе с HOXB2, MEIS3 и PBX2/4 белками необходим для поддержания экспрессии в r4 (Popperl et al., 1995; Ferretti et al., 2005). Известно множество дополнительных примеров таких взаимозависимых, перекрестно-регуляторных перекрестно-регуляторных петель. Напр., hoxd1, hoxb2 и hoxa2 нуждаются в Meis/Pbx для своей экспрессии (Ferretti et al., 2000; Elkouby et al., 2010). Экспрессия Hoxb2 непосредственно активируется HOXB1 в r4 и HOXB2 белком, затем управляется экспрессией Hoxb1. Т.о., Hoxb2 косвенно контролирует свою собственную экспрессию посредством Hoxb1 (Maconochie et al., 1997; Davenne et al., 1999; Jacobs et al., 1999; Ferretti et al., 2000; Gavalas et al., 2003). Экспрессия Hoxa2 в r4 также регулируется за счет консервативных энхансерных элементов позвоночных, которые связывают Meis/Pbx и HOXB1/HOXA2 белки (Tampel et al., 2006, 2007; Lampe et al., 2008). В более передних r2-r3, Meis3/Pbx белки необходимы для ранней нейральной экспрессии hoxa2 у Xenopus (Elkouby et al., 2010), но в настоящее время неясно, происходит ли это непосредственно или косвенно (Tempel et al., 2008). Более каудальная экспрессия Hoxa3 в r5/6 контролируется c помощью элемента, связывающего Meis/Pbx и HOXA3/HOXB3 белки, как было установлено, на мышах и курах (Manzanares et al., 2001). В r6/7, гены Hoxb4 и Hoxd4 первоначально активируются посредством своих RARE элементов c помощью RA (Whiting et al., 1991; Moroni et al.,1993; Popperl и Featherstone, 1993; Gould et al., 1998; Nolte et al., 2003), но позднее экспрессия Hoxb4 поддерживается c помощью MEIS1/PBX и отдельного чувствительного к HOXB4/HOXD4 элемента (Gould et al., 1998, 1997; Serpente et al.,2005). Заметим, что мышиный RARβ ген сам по себе содержит HOXB4/HOXD4 чувуствительный1 элемент, который может быть связан Meis/Pbx белками вместе с Hox (Serpente et al., 2005). Это предоставляет позитивную feed-forward петлю для поддержания уровней RA и экспрессии PG4 Hox в r6/7. Наконец, дополнительным уровнем сложности является то, что все ромбомеры неспособны развиваться собственно после нокдауна Meis3 у Xenopus, несмотря на тот факт, что экспрессия meis3 ограничена r2-4 (Dibner et al., 2001; Gutkovich et al., 2010). Это, скорее всего, результат элиминации ранней экспрессии fgf3 в r4 у истощенных по Meis3 эмбрионов, которые обусловливают неавтономные эффекты. Т.о., любая прямая активация meis/pbx/hox энхансерных последовательностей в r5-7 может обусловливаться дополнительными Meis или Prep белками.

У Xenopus, Meis3, по-видимому, прямо ауто-регулирует собственную экспрессию. Как было установлено c помощью биоинформатики и ChIP исследований, имеются два функциональных сайта связывания белка Meis в промоторе гена meis3 in vivo. На поздней ст. гаструлы, Meis3 белок активирует свою собственную экспрессию (Elkouby et al., 2012); позднее, на ст. ранней нейрулы, Meis3 индуцирует экспрессию гена tsh1. Tsh1 белок вместе с Meis3 связывает промотор meis3 и негативно регулирует его экспрессию. Meis3/Tsh1 взаимодействия также контролируют соотношение окончательно дифференцированных первичных нейронов в противовес пролиферирующим предшественникам нейронов заднего мозга в течение модуляции клеточного цикла (Elkouby et al., 2012). Заметим, сходная роль была предположена для Meis1/2 в развивающшейся сетчатке (Bessa et al., 2008; Heine et al.,2008).

Два исследования на рыбках данио идентифицировали новые специфичные для заднего мозга гены мишени, которые лежат ниже Meis/Pbx/Hox PG1 белков (Rohrschneider et al., 2007; Choe et al., 2011). Одно исследование сравнивало экспрессию генов hoxb1a у мутантных или нормальных эмбрионов, идентифицировало 8 новых генов, экспрессирующихся специфически в r4 (Rohrschneider et al., 2007). Один из этих генов, prickle1b,как было установлено, необходим для миграции лицевых двигательных нейронов. Дополнительное исследование на рыбках данио имело целью выделение генов мишеней для Hoxb1b и привело к идентификации 25 новых специфичных для заднего мозга генов (Choe et al., 2011). Др. исследования также идентифицировали индивидуальные гены мишени для Meis/Pbx/Hox. Ген LIM domain only-1 (Lmo1) сильно зависит от MEIS/PBX/HOX PG2 белков в отношении своей экспрессии в заднем мозге мышей (Matis et al., 2007). Более того, paired-like Homeobox 2b (Phox2b)ген, обязательный детерминант спецификации висцеральных двигательных нейронов, является непосредственной мишенью MEIS/PBX/HOXB1-2 белков в r4 (Samad et al., 2004). Наконец, в r4 мышей, ген энхансер рецепторной тирозин киназы EphA2 непосредственно регулируется c помощью HOXA1/B1 и PBX белков и его экспрессия теряется у Xenopus морфантов Meis3 (Chen и Ruley, 1998; Dibner et al., 2001). Ephrin лиганды и Eph рецепторные белки экспрессируются в перемежающихся ромбомерах в виде комплементарных паттернов экспрессии, управляющих привлечением/отталкиванием между разными клеточными популяциями, которые подразделяют задний мозг на метамерные ромбомерные сегменты (rev. Sela-Donenfeld и Wilkinson, 2005). Базируясь на биоинформационных предсказаниях недавнее исследование на рыбках данио выявило функциональную энхансерную последовательность, содержащую мотивы связывания Meis (Burzynski et al., 2012).

HOX-INDEPENDENT FUNCTIONS OF TALE PROTEINS: EYE, MIDBRAIN, AND FOREBRAIN DEVELOPMENT

Передняя граница экспрессии генов Hox соответствует границе между ромбомерами r1 и r2, мез-, ди- и телэнцефалон развиваются без какого-либо непосредственного вклада членов кластера Hox. Тем не менее белки семейств PBC и Meis/Prep широко экспрессируются впереди от границы r1/2, подтверждая, что они контролируют программы клеточной дифференцировки, независимых от Hox белков.

A (Largely) Conserved Role for Homothorax/Meis During Early Eye Development

На первый взгляд компаундные глаза артропод и глазные хрусталики позвоночных имеют мало общего за исключением того, что оба содержат клетки, которые детектируют свет и превращают его в электрохимические сигналы. Компаундные глаза состоят из множественных единиц омматидий, каждая состоит из 8 свет воспринимающих фоторецепторов и дополнительных клеток. Сетчатка позвоночных является многоклеточной, слоистой структурой, которая выстилает заднюю часть глаза. Сетчатка позвоночных и компаундные глаза беспозвоночных не только отличаются существенно по своей анатомической структуре, но и также развиваются из сильно отличающихся доменов клеток предшественников у эмбрионов. Зачатки глаз беспозвоночных (глазные имагинальные диски) являются эпителиальными образованиями (infolding), тогда как нейральная сетчатка позвоночных развивается их зрительного пузырька, выроста из нервной трубки.

Поэтому довольно удивительно открытие, что транскрипционный фактор Pax6 и его ортолог у мух eyeless (ey) не только необходим для развития глаз у обоих типов животных, но и также достаточен для запуска развития эктопических глаз при эктопической экспрессии в определенных регионах эмбриона (Hill et al., 1991; Quiring et al., 1994; Halder et al., 1995; Chow et al., 1999; Gehring и Ikeo, 1999). Частичная функциональная консервация впоследствии была описана и для др. транскрипционных факторов, включая basic helix-loop-helix типа пронейральный ген athonal (ato)/Ath5, который участвует в наделении клеток предшественников компетентностью выхода из клеточного цикла и инициирует дифференцировку нейронов (Brown et al., 2001; Kay et al., 2001; Wang et al., 2001). Недавние работы на Drosophila, рыбках данио, курах и мышах подтвердили участие Meis/Prep класса белков в этой эволюционно законсервированной сети, которая контролирует развитие глаз.

Глазные имагинальные диски Drosophila специфицируются у поздних эмбрионов благодаря экспрессии ортологов Pax6, ey и twin of eyeless (toy) (Czerny et al., 1999). В раннем личиночном развитии клетки предшественники глазных имагинальных дисков быстро пролиферируют и экспрессируют Meis/Prep ортолог homothorax (hth) вместе с ey и toy (Pai et al., 1998; Pichaud и Casares, 2000; Bessa et al., 2002). В конце личиночного развития. во время третьей личиночной стадии (L3), волна дифференцировки проходит поперек глазного имагинального диска, которая может быть морфологически распознаваться как морфогенетическая борозда morphogenetic furrow (MF; Fig. 2A). По мере продвижения MF от заднего края глаза к переднему, она координирует клеточные деления и инициирует развитие фоторецепторов (Wolff и Ready, 1991). Ген hth в кооперации с ey способствует пролиферации клеток впереди MF (Bessa et al., 2002; Lopes и Casares, 2010). Более каудальнееклетки подвергаются нескольким раундам быстрых клеточных делений, прежде чем они подвергнутся временному аресту их клеточного цикла на ст. G1. Белок hth модулирует кинетику этих клеточных делений за счет регуляции cdc25/string (stg), протеин фосфатазы, которая облегчает прохождение через клеточный цикл (Lopes и Casares, 2010). Как только клетки подвергаются временному G1-аресту, они подавляют hth и индуцируют экспрессию пронейрального гена ato (Bessa et al., 2002; Lopes и Casares, 2010). Экспрессия ato, в свою очередь, является обязательным условием для дальнейшей дифференцировки и образования зрелых омматидий (Jarman et al., 1994). Следовательно, подавление hth и активация ato ассоциированы с переходом из незрелых клеток предшественников к детерминированным клеткам предшественникам в зачатках глаз мух. Следовательно, оба фактора влияют на развитие глаз противоположными способами: hth удерживает клетки в недифференцированном состоянии, а ato запускает нейрональную дифференцировку (Bessa et al., 2002). Figure 2.

Эти события частично законсервированы в развивающейся сетчатке позвоночных (Fig.2B). В сетчатке дифференцируются 6 типов нейронов и один тип глии в течение длительного периода и последовательных волн, которые напоминают таковую в развивающихся глазах Drosophila (Livesey и Cepko, 2001). Каждая волна инициируется в центре сетчатки в тесной близости к зрительному стебельку и распространяется в направлении краев сетчатки. В удивительном сходстве с Drosophila L3 глазными имагиналными дисками, экспрессия atonal-homologue 5 (Ath5/Atoh7) тесно связана с инициацией нейрогенеза сетчатки у всех позвоночных (Brown et al., 2001; Kay et al.,2001; Wang et al., 2001). Паттерны пространственно-временной экспрессии Meis1 и Meis2 параллельны с таковой hth во время раннего развития сетчатки у некоторых позвоночных. Гены meis1 у рыб и MEIS2 у кур униформно транскрибируются в раннем зрительном пузырьке, когда клетки пролиферируют. Подобно L3 глазным имагинальным дискам, оба белка подавляются в виде волны от центра к периферии, параллельно появляются клетки, экспрессирующие ath5 (Bessa et al., 2008; Heine et al., 2008). Более того, оба Meis белка способствуют быстрой пролиферации клеток предшественников путем регуляции c-myc и/или cyclinD1 (ccnd1), двух главных регуляторов прохождения через G1-фазу клеточного цикла. Так. у мух, рыб и кур клетки предшественники сетчатки впереди первой нейрогенной волны экспрессируют MEIS/Hth белок, который поддерживает их пролиферативное состояние. Соответственно, у рыб или кур с нарушенной функцией Meis1 или MEIS2 возникает микрофталмия и мыши, несущие целенаправленную делецию локуса Meis1, которая приводит к экспрессии укороченного, доминантно-негативного белка, обнаруживают маленькие глаза (Hisa et al., 2004; Bessa et al., 2008; Heine et al., 2008). Белки семейства Meis т.о. контролируют пролиферацию клеток ретинальных предшественников и и рост глаза у позвоночных и беспозвоночных.

Некоторые аспекты регуляции Meis/hth также законсервированы. У Drosophila, экспрессия hth подавляется в ответ на BMP (bone morphogenetic protein) 2/4 ортолог decapentaplegic (dpp) и hedgehog (hh) сигналы (Bessa et al., 2002; Firth и Baker, 2009; Lopes и Casares, 2010). Белок hh продуцируется дифференцированными клетками позади борозды и передает короткого действия сигналы, чтобы индуцировать dpp в MF (Heberlein et al., 1993). Итак, hh и dpp управляют продвижением вперед MF, частично кооперативно подавляя экспрессию hth в домене предшественников впереди борозды (Lopes и Casares, 2010). Сходным образом, ортолог hedgehog позвоночных Sonic hedgehog (Shh) экспрессируется клетками зрительного стебелька, а также ретинальными ганглиолярными клетками, когда их дифференцировка распространяется по сетчатке. Shh управляет нейрогенезом сетчатки, хотя лежащие в основе механизмы всё ещё остаются спорными (Neumann и Nuesslein-Volhard,2000; Zhang и Yang, 2001; Wang et al., 2005; Kay et al., 2005; Locker et al.,2006). У эмбрионов кур в сетчатке волна репрессии MEIS2 от центра к периферии, которая обычно сопровождается продукцией экспрессирующих ATH5 клеток, ускоряется, когда сетчатка принуждается к избыточной экспрессии SHH (Heine et al., 2009). В противоположность Drosophila, однако, передача сигналов BMP2/4 не участвует в подавлении MEIS2 (Heine et al., 2009). Это не удивительно, т.к. продвижение MF и развитие омматидий у Drosophila может происходить в отсутствие dpp, указывая тем самым, что передача сигналов hedgehog может быть первичным механизмом, гарантирующим продвижение нейрогенной волны поперек зачатка глаз (Burke и Basler,1996). Молекулярные детали лежащие в основе негативной регуляции MEIS2 с помощью hedgehog предстоит выяснить и пока неясно, если потеря транскриптов MEIS2, которая происходит во время нормального развития сетчатки, является ли результатом секреции SHH зрительным стебельком, вновь рожденных клеток ретинальных ганглиев или того и др. Тем не менее, эти результаты говорят в пользу эволюционно законсервированных регуляторных взаимоотношений передачи сигналов hedgehog и экспрессии MEIS/hth.

Несмотря на множественные сходства в функции белков MEIS/Hth в глазах позвоночных и беспозвоночных, видоспецифические различия также существуют. Напр., временная последовательность экспрессии Meis1 и Meis2 отличается между видами. В сетчатке эмбрионов кур MEIS2 присутствует на высоких уровнях в клетках предшественниках впереди первой нейрогенной волны, тогда как экспрессия MEIS1 продолжается в пролиферирующих клетках предшественников в течение всего развития сетчатки. Напротив, Meis2, по-видимому, не играет существенной роли в развитии сетчатки на сравнимых эмбриональных стадиях у мышей и рыб (Bumsted-O'Brien et al., 2007; Bessa et al., 2008; Heine et al., 2008) (D. Engelkamp и D. Schulte, unpublished results). Клетки предшественников сетчатки т.о. экспрессируют два белка семейства MEIS во время развития, когда у мышей и рыб экспрессируется только один. Принимая во внимание, что глаза у этих видов существенно варьируют в отношении общего размера и клеточного состава, то такие различия могут отражать видо-специфические стратегии адаптации роста глаз и дифференцировки сетчатки к отличающимся условиям обитания животных.

Later Roles for TALE Proteins in Visual System Development

TALE гомеодоменовые белки также контролируют поздние стадии развития глаз, такие как спецификация клеточных судеб и образование сети нейронов. Напр., 5'-TG-3'-interacting factor (TGIF), наиболее удаленный родственный член подкласса MEIS/PREP гомеодоменовых TALE белков, участвует в генерации амакринных клеток сетчатки, промежуточных нейронов, которые регулируют параллельный процессинг зрительных сигналов в сетчатке (W?ssle, 2004; Satoh и Watanabe, 2008). MEIS2 может также играть роль в спецификации определенных подтипов амакринных клеток, хотя молекулярные детали взаимоотношений между TGIF и MEIS2 остаются невыясненными (Bumsted-O'Brien et al., 2007; Satoh и Watanabe, 2008).

TALE белки также вносят вклад в упорядоченные проекции аксонов клеток ретинальных ганглиев в головной мозг. Принципиальным свойством аксональных проекций в зрительной системе является их организация в топографические карты, при этом соседние нервные клетки в одной структуре формируют синапсы с близко расположенными нейронами в структуре мишени. Формирование ретинотектальной карты базируется на контролируемой во времени и пространстве экспрессии белков клеточной поверхности, таких как Eph рецепторные тирозин киназы и ephrins, и на транскрипционных регуляторах, которые контролируют их градированную экспрессию в сетчатке и tectum. Нокдаун pbx2 на pbx4-мутантном фоне у рыбок данио изменяет формирование паттерна сетчатки и тектума и вызывает ошибки в нахождении путей клетками ретинальных ганглиев (French et al., 2007). Это может быть объяснено потерей экспрессии нескольких факторов, которые, как было установлено, контролируют формирование паттерна ретинальных ганглиолярных клеток и формирование ретинотектальной карты, такие как raldh2/aldh1a2 (Hyatt et al., 1996; Sen et al., 2005; Halilagic et al., 2007), tbx5 (Koshiba-Takeuchi et al., 2000) и hmx4/soho-1 (Schulte и Cepko, 2000). Сходным образом, нокдаун у рыбок данио meis1 ведет к частичной вентрализации и к тонким изменениям качественн6ых особенностей nasal-temporal частей сетчатки (Erickson et al., 2010). Это, скорее всего, обусловлено изменением профиля экспрессии генов, формирующих паттерн сетчатки, tbx5, vax2 (Schulte et al., 1999; Mui et al., 2002), foxg1a и foxd1 (Yuasa et al., 1996), некоторых Eph/ephrin молекул, которые, как известно, являются транскрипционными мишенями этих паттерн формирующих генов, и изменением передачи сигналов BMP- и FGF.

The Meis/Prep-cyclinD1 Relationship

Ранее описанное наблюдение, что белки MEIS/Hth, модулирующие рост глаз посредством регуляции транскрипции cdc25/stg и G1-S cyclinccnd1, влияют на белки семейства Meis для поддержания баланса между пролиферацией и дифференцировкой глазных предшественников. Регуляция двух важных митогенных триггеров с помощью белков семейства Meis удивительна, принимая во внимание, что нарушение регуляции Meis оказывается ассоциированным с несколькими формами рака (Geerts et al., 2003; Crijns et al., 2007). В самом деле, cyclinD3 (Ccnd3) является непосредственной мишенью MEIS1 у мышей, моделирующих острую миелоидную лейкемию (AML) (Argiropoulos et al., 2010).

Регуляторные взаимоотношения между MEIS-белками и Ccnd1 обнаруживают интересный поворот с открытием, что Meis2 сам по себе является транскрипционной мишенью для ассоциированной с ДНК формой CCND1 в сетчатке мышей (Bienvenu et al., 2010). Помимо своей роли в качестве регулятора клеточного цикла, CCND1 также присутствует в комплексах из транскрипционных факторов. CCND1, как было установлено, ассоциирует с различными транскрипционными кофакторами, включая гистоновые ацетил трансферазы P/CAF и NcoA/SRC1a, гистоновую деацетилазу HDAC3 или TFAII250, компонент сердцевины комплекса транскрипционных факторов (Coqueret, 2002). Иммунопреципитация хроматина, сопровождаемая анализом микромассива ДНК (ChIP-chip) из тканей мышей, экспрессирующих нагруженные epitope формы CCND1 in vivo, выявило присутствие CCND1 в промоторной области некоторых обильно экспрессируемых генов (Bienvenu et al., 2010). Поразительно, Meis2 находится среди генов, связываемых с помощью CCND1 в сетчатке P0 мышей. Последующе определение профиля экспрессии показало, что транскрипты Meis2 сильно уменьшены в количестве в сетчатке мышей, мутантных по Ccnd1, указывая, что Meis2 обычно находится под позитивным контролем Ccnd1. Исследования (ChIP по всей сетчатке на ст. P0) пока не позволяют установить, происходит ли эта регуляция во всех клетках, которые совместно экспрессируют оба белка или ограничена определенным типом клеток. Тем не менее, эти результаты подтверждают интригующую модель, что CCND1 и MEIS2 участвуют в позитивной реципрокной регуляции и взаимно усиливают экспрессию др. др. Эта модель пока тестирована в тканях вне сетчатки мышей и пока еще не распространена на др. TALE белки, но она может помочь понять полный онкогенный потенциал белков семейства MEIS/PREP.

The Meis/Prep-Pax6 Relationship

Работы с белками семейства MEIS в развивающемся глазу также открыли регуляторные взаимодействия между MEIS/PREP и PAX6 белками. Pax6 и его мушиный ортолог ey являются ключевыми регуляторами развития глаз у Metazoans, но Pax6 также выполняет критические функции в развитии др. тканей и органов, включая разные регионы головного мозга, спинного мозга, обонятельной системы и поджелудочной железы (Hogan et al., 1988, 1986; Hill et al., 1991; Stoykova и Gruss, 1994; Ericson et al., 1997; St-Onge et al., 1997). В зачатке головного мозга позвоночных Pax6 является первым, экспрессируемым в конце гаструляции во всей передней части нервной пластинки. Позднее экспрессия постепенно ограничивается зрительными пузырьками и лежаей поверх их не нейральной поверхностной эктодермой, где он совместно экспрессируется с Meis1 и Meis2. Хотя геномная организация генетического локуса Pax6 очень сложная, короче, идентифицирован в 107 bp цис-регуляторный элемент, который управляет экспрессией в проспективном хрусталике мышей (Williams et al., 1998; Kammandel et al., 1999). Этот элемент связывается с помощью MEIS1 и MEIS2 в развивающемся хрусталике и связывание MEIS необходимо для его активности (Zhang et al., 2002). TALE гомеодоменовое семейство белков, следовательно, функционирует выше Pax6 во время образования хрусталика. MEIS2 также непосредственно или косвенно участвует в регуляции PAX6 в сетчатке эмбрионов кур (Heine et al., 2008). Ген pax6 был также идентифицирован в качестве мишени для Meis2 в оптическом бокале и хрусталике рыбок медака (Conte et al., 2010). У Prep1-гипоморфных мышей, уровни транскриптов Pax6 были достоверно снижены, это указывает на то, что также в этих тканях Pax6 стоит ниже активности Meis/Prep белков (Ferretti et al., 2006). Поскольку Pax6 является ключевым регулятором глазной судьбы, то эти находки подтверждают, что Meis/Prep могут связывать спецификацию ретинальных судеб и контроль роста в развивающемся глазу. Противоположная регуляция, а именно, контроль meis1 с помощью Pax6, также происходит, по крайней мере, у рыбок данио (Royo et al., 2012). Энхансерный элемент гена meis1 у рыбок данио, который управляет экспрессией в эмбриональной нейральной сетчатке и в разных регионах головного мозга, содержит два законсервированных консенсусных сайта связывания в Pax6, которые необходимы для нормальной экспрессии meis1 в сетчатке. Хотя биологическое значение этих сайтов неясно, реципрокная регуляция Meis и Pax6 возможна.

МикроРНК miR-9 и miR-204 целенаправленно воздействуют на Meis2 в переднем мозге и хрусталике, соотв.,(Conte et al., 2010; Shibata et al., 2011; Hoffmann et al., 2012). У мышей, лишенных mir9-2 и mir9-3, экспрессия Meis2 в телэнцефалоне увеличивается и домен его экспрессии расширяется дорсально. Очевидно, повышенная экспрессия Meis2 у таких мышей сопровождается одновременным снижением экспрессии Pax6, это подтверждает, что в этой системе Meis2 негативно регулирует Pax6 (Shibata et al., 2011). У рыбок медака, mir-204 непосредственно регулирует экспрессию meis2 в хрусталике и сетчатке, а избыточная экспрессия mir-204 напоминает фенотипические отклонения, наблюдаемые у моделей с потерей функции meis2 (Conte et al., 2010). В резком контрасте с телэнцефалоном мыши, однако, mir-204 обусловленная потеря экспрессии meis2 сопровождается параллельной потерей экспрессии pax6 в глазах медака, указывая на позитивную регуляцию pax6 с помощью meis2. Хотя оба исследования ещё раз предоставили неотразимые доказательства для транскрипционного пути Meis-Pax6, они также подтвердили, что этот путь, скорее всего, существенно модифицируется в разных физиологических контекстах.

Усилением сложности регуляторных взаимоотношений между Meis/Prep и Pax6, стала находка, что в отсутствии насыщения связывание PREP1 с двумя эволюционно консервативными, низкого сродства сайтами связывания в расширенном Pax6 хрусталиковом регуляторном регионе является критическим для корректного времени и уровня экспрессии Pax6 в хрусталике (Rowan et al., 2010). Функция Pax6 в развитии глаз сильно зависит от дозы гена. Мыши, несущие множественные копии гена Pax6, обнаруживают тяжелые нарушения глаз, которые обнаруживают некоторые общие признаки (такие как микрофталмия и катаракты), при этом мыши гетерозиготны по мутации потери функции Pax6/sey (Schedl et al., 1996; van Raamsdonk и Tilghman, 2000). Исследование Rowan и коллег идентифицировало два новых сайта связывания для PREP1 в Pax6 хрусталиковом энхансере, оба они обладают филогенетически законсервированными заменами нуклеотидов по сравнению с оптимальным консенсусным мотивом для Meis/Prep белков, которые были идентифицированы путем отбора in vitro (Chang et al., 1997). Оба мотива обнаруживали связывание PREP1 уровнях ниже насыщения в эмбриональном хрусталике, а связывание PREP1 активирует соотв. энхансер synergistically зависимым от дозы способом. Зависимая от дозы активация экспрессии генов с помощью PREP1 ранее также наблюдалась для fatty acid binding protein 7(FABP7)/brain lipid binding protein (BLBP) при синдроме Дауна (Sanchez-Font et al.,2003). Присутствие множественных сайтов связывания с низким сродством, которые могут быть связаны noncooperatively с помощью PREP1 в хрусталиковом энхансере Pax6, делает возможным более тонкий контроль над уровнями экспрессии Pax6, чем присутствие единственного сайта высокого сродства (Rowan et al., 2010). Можно предположить, что сходные механизмы могут объяснить некоторые дивергентные функции, которые были описаны для TALE-белков в разных онтогенетических контекстах или болезнях. В целом геномные подходы, подобные ChIP-Seq или ChIP-chip несомненно помогут ответить на этот вопрос.

TALE Proteins in Midbrain Development

Meis и Pbx белки также выполняют фундаментальные роли в развитии среднего мтозга. Средний мозг является важным центром сенсорно-моторной интеграции, он развивается из мезэнцефалического пузыря. Дорсальный регион, происходящий из мезэнцефалической алярной пластинки, представлен superior и inferior colliculi у млекопитающих или optic tecta у позвоночных не-млекопитающих. Он участвует в переработке зрительной и слуховой информации. Вентральная часть среднего мозга, происходящая из мезэнцефалической базальной пластинки, представлена substantia nigra и вентральной tegmental областью, двумя важными сайтами продукции допамина. Развитие среднего мозга тесно сцеплено с активностью организатора mid-hindbrain boundary (MHB, или организатора перешейка), группы клеток, расположенной в соединении между мезэнцефалическим и метэнцефалическим пузырями (Wurst и Bally-Cuif,2001). Клетки организатора MHB секретируют дальнодействующие и короткодействующие сигнальные молекулы, которые необходимы и достаточны для развития соседних структур среднего и заднего мозга (Itasaki и Nakamura, 1992; Crossley et al., 1996).

Поддержание MHB у рыбок данио нуждается в сочетанной активности Pbx и Engrailed (Erickson et al., 2007). Глобальное истощение Pbx белков в нервной трубке не нарушает инициального становления и позиционирования MHB или начало экспрессии ассоциированных с MHB генов, но затрагивает поддержание MHB. Истощенные по Pbx, эмбрионы лишены видимых структур MHB на поздних сомитных ст. и образуют недоразвитый тектум (tecta). Pbx белки соединяются с Engrailed2a (Eng2a), с гомеодомен содержащим транскрипционным фактором, ассоциированным c активностью MHB, посредством мотива, напоминающего первичный связывающий домен у Hox-белков. Pbx и Engrailed кооперируются в поддержании MHB, поскольку мутация Pbx-связывающего мотива в Eng2a делает белок биологически неактивным (Erickson et al.,2007). И опять это генетическое взаимодействие эволюционно законсервировано: у Drosophila engrailed (en) ассоциирует с exd in vitro и кооперирует в exd и hth при формировании границы компартмента эмбриона (Peltenburg и Murre, 1996; Kobayashi et al., 2003).

Описана и роль белков семейства Meis в развитии среднего мозга (Erickson et al., 2007; Agoston и Schulte, 2009; Agoston et al., 2012). Meis2 обильно экспрессируется в алярной пластинке мезэнцефалона мышей и кур, в зачатке tectum и superior colliculus соотв. (Cecconi et al., 1997; Agoston и Schulte, 2009). MEIS2 необходим и достаточен для развития тектума у эмбрионов кур. В резком контрасте к PBX, однако, формирование и поддержание MHB не зависело от MEIS2 (Erickson et al., 2007; Agoston и Schulte, 2009). Сходным образом, эмбрионы рыбок данио, у которых экспрессия meis1 подавлена имеют маленький тектум (tecta) и обнаруживают дефекты ретинотектального картирования (mapping), но не обнаруживают заметных нарушений в экспрессии ассоциированных с MHB генов (Erickson et al., 2007). PBX белки, т.о., скорее всего, действуют раньше, чем MEIS или обладают дополнительными функциями в генетическом каскаде, которых регулирует развитие тектума. У эмбрионов кур MEIS2 запускает эктопическое развитие тектума благодаря взаимодействию с OTX2, с не-Hox гомеодоменовым белком, который важен для развития всех передних структур головного мозга, включая средний мозг. Соединение MEIS2 с OTX2 конкурирует с ассоциацией транскрипционного ко-репрессора TLE4/GRG4 с OTX2 в зачатке тектума, освобождает OTX2 от TLE-обеспечиваемой репрессии и тем самым делеает возможным начало развития тектума (Agoston и Schulte, 2009). Взаимодействие между MEIS2 и OTX2 не нуждается в каких-либо белках lklz соединения с ДНК. Это указывает на то, что белки семейства MEIS могут модулировать экспрессию, по крайней мере, за счет двух разных механизмов. Они могут непосредственно воздействовать на промоторный/энхансерный регионы нижестоящих генов и они могут инициировать контролируемую сборку и разборку транскрипционных регуляторных комплексов, независимых от ДНК. Интересно, что очень сходный способ действия был описан ранее для TGIF (Wotton et al., 1999). TGIF первоначально был идентифицирован в отношении своей способности конкурировать с retinoic X receptors (RXR) за соединение с чувствительными к RXR элементами в промоторе генов, чувствительных к ретиноевой кислоте, ингибируя тем самым индуцируемую ретиноевой кислотой активацию транскрипции этих генов (Bertolino et al., 1995). Однако, TGIF репрессирует также активацию транскрипции нежестоящего TGF-β сигнального пути (Wotton et al., 1999). Сигналы TGF-β передаются в клетки посредством smad-белков, которые транслоцируются в клеточное ядро и активируют экспрессию генов путем взаимодействия с транскрипционными коактиваторами, такими как histone acetyl transferases p300 и CBP (Shi и Massague, 2003). TGIF конкурирует с p300 за соединение с SMAD2 и рекрутирует транскрипционный корепрессор, подобный гистоновым деацетилазам, в комплекс, это ведет к репрессии индуцируемой TGF-β транскрипции (Heinzel et al., 1997; Wotton et al., 1999; Sharma и Sun, 2001). Хотя в конце концов это приводит к очень отличающимся результатам преодоления транскрипционной репрессии в случае взаимодействия MEIS2 с OTX2 или индукции репрессии в случае взаимодействия TGIF с SMAD2- в обоих контекстах TALE гомеодоменовые белки регулируют экспрессию генов путем изменений состава предсуществующих комплексов транскрипционных факторов.

MEIS2 нижестоящие мишени в тектуме включают ephrin B1 (EFNB1, у кур) и EphA8 (у мышей), две молекулы клеточной поверхности, участвующие собственно в развитии retinotectal retinocollicular проекций (Shim et al., 2007; Agoston и Schulte, 2009). В переднем мозге экспрессия др. Eph рецептора, EphA7, непосредственно регулируется с помощью PBX1 (Pietri et al., 2012). Помимо OTX2, MEIS2 также непосредственно взаимодействует с PAX3 и PAX7 у эмбрионов кур, двумя paired box транскрипционными факторами, которые действуют в сети, участвующей в формообразовании MHB (Matsunaga et al., 2001; Agoston и Schulte, 2009).

В противовес дорсальной части среднего мозга роль TALE белков в вентральной части среднего мозга недостаточно изучена. Недавнее исследование участия PBX белков в дифференцировке допаминергических клеток проведено в вентральной части среднего мозга (Sgado et al., 2012). Дофаминовая система участвует в широком наборе функций, включая мотивацию, преобразование воздаяния должного (reward processing) и волевые движения, а вентральная часть среднего мозга содержит несколько ключевых компонентов этой системы. Pbx1 и Prep1 экспрессируются в допаминергических нейронах мезэнцефалона sj время эмбриогенеза и у взрослых. У Pbx1-дефицитных мышей, развитие допаминергических нейронов среднего мозга первоначально обычное, но проекции аксонов перемещаются неправильно в середине беременности, это, скорее всего, обусловлено потерей экспрессии высокого сродства netrin рецептора DCC в этих клетках (Sgado et al., 2012). Эти результаты подчеркивают роль PBX белков в развитии допаминергических нейронов, хотя точная роль TALE белков в дофаминовой системе нуждается в дальнейшем исследовании.

TALE Proteins in Forebrain Development

TALE гомеодоменовые белки также регулируют некоторые аспекты развития переднего мозга. Информация о роли TALE белков в развитии переднего мозга получена в результате анализа экспрессии, некоторые из них уже были ассоциированы с инициальным клонированием генов (Roberts et al., 1995; Bertolino et al., 1996; Cecconi et al., 1997; Oulad-Abdelghani et al., 1997; Toresson et al., 1999, 2000; Schnabel et al., 2001; Coy и Borycki, 2010). В противоположность заднему и среднему мозгу и сетчатке, известны лишь немногие механистические детали о функции TALE белков в переднем мозге. Скорее всего, участие TALE белков в развитии переднего мозга в основном базируется на ассоциации определенных мутаций со специфическими дефектами коры у людей и мышей.

Meis1 и Meis2 экспрессируются в латеральных и медиальных ганглиолярных возвышениях (LGE и MGE) вентральной части переднего мозга с частично перекрывающимися доменами экспрессии (Toresson et al., 2000). Фактически, Meis2 был идентифицирован с помощью подхода по subtraction cloning для генов, концентрирующихся в LGE (Toresson et al., 1999). MGE и LGE дают базальные ганглии, включая полосатое тело (striatum) и являются также основным источником GABA-ергических промежуточных нейронов коры головного мозга, гиппокампа и обонятельных луковиц (Parnavelas, 2000). Некоторые исследования помещают MEIS белки в регуляторную сеть, которая контролирует развитие и функцию нейронов полосатого тела и кортикальных промежуточных нейронов. Напр., MEIS2 участвует в регуляции Dlx (distal-less homeobox) генов, которые необходимы для дифференцировки и миграции нейронов в вентральной части телэнцефалона. В частности, MEIS2 активирует транскрипцию энхансера в кластере Dlx5/6, который управляет экспрессией Dlx в постмитотических проекционных нейронах полосатого тела, происходящих из предшественников LGE (Ghanem et al., 2008). Напротив, Meis гены были идентифицированы с помощью ChIP-chip в качестве непосредственных мишеней для ARX (aristaless-related homeobox) белка (Friocourt и Parnavelas, 2011; Quill? et al., 2011). ARX преимущественно экспрессируется в GABA-ергических промежуточных нейронах коры, а мутации в гене ARX ведут к широкому спектру фенотипических отклонений головного мозга у людей, включая особую форму X-сцепленной лиссэнцефалии (Kitamura et al., 2002). Наконец, экспрессия D1A dopamine рецептора, одного из доминирующих допаминовых рецепторов в нейронах полосатого тела, находится под непосредственной регуляцией MEIS2 и TGIF (Yang et al., 2000). Интересно, что оба TALE белка конкурируют за соединение с перекрывающимися сайтами, стоящими выше места старта транскрипции D1A, осуществляя противоположные функции. MEIS2 активирует транскрипцию D1A, тогда как TGIF репрессирует её. Следовательно, баланс между уровнями экспрессии MEIS2 и TGIF может определять обилие D1A рецепторов в данной клетке и, следовательно, предопределять способность клеток реагировать на допаминовые сигналы. Связь между TALE белками и dopaminergic нейротрансмиссией в полосатом теле, скорее всего, имеет клиническое значение, поскольку дофаминовая система участвует в возникновении болезни Паркинсона, также как и в возникновении нейропсихиатрических нарушений, таких как шизофрения, пагубные привычки и obsessive-compulsive нарушениями. Фактически, недавний анализ сцепления по всему геному идентифицировал MEIS2 и PBX1 в качестве потенциальных генов кандидатов, участвующих в патогенезе obsessive-compulsive нарушений (Nestadt et al., 2012).

Во-вторых, хорошо изучен пример роли TALE гомеодоменовых белков в развитии переднего мозга с вовлечением TGIF при голопрозэнцефалии (Gripp et al., 2000). Голопрозэнцефалия является врожденным нарушением переднего мозга, при котором первичный пузырь телэнцефалона оказывается неспособным делиться на два полушария головного мозга, как результат формирование дефектного паттерна срединной линии. Ген TGIF человека расположен на 18p11.3, в геномом регионе, ассоциированном с семейной HE4 формой голопрозэнцефалии. Некоторые гетерозиготные мутации потери функции TGIF были идентифицированы у индивидов с голопрозэнцефалией (Gripp et al., 2000). В противоположность человеку, однако, одиночная мутация Tgif оказывается недостаточной, чтобы вызывать голопрозэнцефалию у мышей, но одновременно необходима делеция родственного Tgif2 гена (Shen и Walsh, 2005; Taniguchi et al., 2012). Как было установлено в серии генетических экспериментов у мышей, TGIF и TGIF2 действуют механистически, чтобы модулировать Shh-путь путем ограничения передачи сигналов Nodal посредством ингибирования SMAD2 (Taniguchi et al., 2012).

В-третьих, ген PREP1 расположен на хромосоме 21q22.3 и значит в геномной области, которая умножается при синдроме Дауна. Уровни экспрессии PREP1 не сбалансированы в головном мозге плодов при синдроме Дауна, приводя к умеренному, но достоверному уменьшению регуляции генов, расположенных в др. местах генома. Одним из таких генов является FABP7/BLBP, который картирован на хромосоме 6 (Sanchez-Font et al., 2003). FABP7/BLBP экспрессируется в радиальной глие, которая является общим генеральным предшественником как нейронов, так и глии головного мозга и ключевым элементом в наведении новорожденных нейронов (Feng et al., 1994; Malatesta et al., 2000; Campbell и G?tz, 2002). PREP1 может т.о. вносить вклад в нейрологические проявления синдрома Дауна. Подтверждает это предположение повышенный уровень PREP1 в фибробластах пациентов с синдромом Дауна, повышенная чувствительность этих клеток к генотоксическим стрессам, таким как иррадиация УФЛ (Micali et al., 2010).

Наконец, продукция гипоталямусом gonadotropin-releasing hormone (GnRH) регулируется мультимерным комплексом, представленным POU-транскрипционным фактором Oct1 вместе с Prep1 и Pbx1b (Rave-Harel et al., 2004). GnRH является пептидным гормоном, ответственным за высвобождение follicle-stimulating hormone (FSH) и luteinizing hormone (LH) гипофизом, чтобы контролировать репродуктивную функцию у самцов и самок. Интересно, что PREP1 и PBX1 белки также участвуют непосредственно в регуляции экспрессии FSH в гипофизе (Bailey et al., 2004). TALE гомеодоменовые транскрипционные факторы т.о., выступают в качестве модуляторов репродуктивной оси.

Perspectives

Although substantial progress has been made in understanding the many и often divergent roles of TALE homeodomain proteins in patterning, cell fate specification и differentiation in the vertebrate CNS, obtaining a comprehensive picture of the gene regulatory networks driven by this protein family continues to be a long-term goal. The Meis/Pbx genes are expressed in gastrula stage embryos at the earliest onset of neural development, и identification и characterization of their earliest direct-targets will be crucial for understanding the initial events in neuronal specification и patterning. Using combined strategies of RNA-seq, microarray, и ChIP-seq assays in different vertebrate embryo model systems such as zebrafish, Xenopus, chick, и mouse will hopefully identify new gene targets и further elucidate the Hox-dependent и -independent Meis/Pbx interactions that occur during brain development. Moreover, all TALE proteins are expressed as multiple splice variants, which often differ quite remarkably in their exon composition и hence may regulate gene expression in very different ways (Asahara et al.,1999). For instance, splice variants of hth that lack the homeodomain have different developmental functions than the full-length protein (Noro et al.,2006). It is, therefore, highly likely that some of the alternatively spliced forms of other TALE proteins also possess unique, still undiscovered activities during brain development. Finally, little is known to date about whether TALE proteins are posttranslationally modified in response to extracellular signals. Availability of PBX1 in the cell nucleus, for example, depends on phosphorylation by protein kinase A (Kilstrup-Nielsen et al., 2003). If и how the activity of other TALE proteins is subject to similar regulatory mechanisms и whether such modifications impact on CNS development, are still open questions.

TALE transcription factors during early development of the vertebrate brain and eye Dorothea Schulte, Dale Frank Developmental Dynamics 243:99-116, 2014.

TALE transcription factors during early development of the vertebrate brain and eye
Dorothea Schulte, Dale Frank
Developmental Dynamics 243:99-116, 2014.