Первые кровеносные сосуды у эмбриона формируются в процессе васкулогенеза, чтобы сформировать полые сосудистые трубки. Последующее развитие сосудистой системы происходит за счет ангиогенеза. Термин ангиогенез соответствует ряду разных клеточных процессов, которые ремоделируют исходное сосудистое сплетение, включая формирование веточек от первичных сосудов в ткани, лишенные сосудов. Формирование межсегментных сосудов (ISVs), которые ответвляются от парной дорсальной аорты дорсально между сомитами в направлении парных задних кардинальных вен является одним из наиболее ранних примеров ангиогенеза ветвления у эмбриона.

Передача сигналов Hedgehog обеспечивается c помощью трех диффузионных лигандов, Sonic hedgehog, Desert Hedgehog и Indian Hedgehog, плюс ко-рецепторы Hh, Smoothened and Patched (Varjosalo and Taipale, 2008). Предыдущие исследования показали, что передача сигналов Hh важна для корректного развития эмбриональной сосудистой системы (Brown et al., 2000; Byrd et al., 2002; Vokes et al., 2004; Coultas et al., 2010). Наиболее убедительные доказательства получены на эмбрионах мышей, лишенных функции SMO или PTCH1, которые вызывают ингибирование или стимуляцию, соотв. Hh сигнального пути. Smo нокаутные эмбрионы погибают благодаря тяжелым нарушениям васкулогенеза, включая неспособность формировать сосудистые трубки (Coultas et al., 2010; Vokes et al., 2004). Стимуляция передачи сигналов Hh у Ptch1 нулевых эмбрионов также приводит к ранней эмбриональной гибели благодаря сосудистым дефектам, включая образование расширенной дорсальной аорты (Coultas et al., 2010). Многочисленные доказательства подтверждают, что Hh не взаимодействуют непосредственно с эндотелиальными клетками (Byrd and Grabel, 2004; Coultas et al., 2010; Moran et al., 2011). Вместо этого наблюдается, что Hh сначала передает сигналы не эндотелиальным тканям, которые затем экспрессируют вторичные регуляторы роста и формирования паттерна эндотелиальной сети. Некоторые самостоятельные сигнальные пути, как было установлено, лежат ниже передачи сигналов Hh в разных онтогенетических контекстах, включая VEGF (Coultas et al., 2010; Lawson et al., 2002; Pola et al., 2001), Notch (Lawson et al., 2002; Lamont and Childs, 2006) и BMP (Astorga and Carlsson, 2007).

Хотя важность передачи сигналов Hh для васкулогенеза доказана, но менее ясны функции передачи сигналов Hh во время ангиогенного роста и ремоделирования васкулатуры. Это прежде всего из-за того, что мышиные эмбрионы, лишенные передачи сигналов Hh, погибают рано во время развития, до пространного ангиогенеза. Мы установили, что передача сигналов Hh существенна для ангиогенного роста ISVs и что стимуляция передачи сигналов Hh ведет к преждевременному росту ISVs. Эти эффекты опосредуются посредством действия VEGF.

DISCUSSION

Hh Signaling Is Essential for Formation of ISVs

Любое ингибирование или избыточная активация передачи сигналов Hh у модельных нокаутных мышей приводит к гибели во время раннего развития из-за неспособности к сборке функциональной сосудистой эндотелиальной системы (Byrd and Grabel, 2004; Coultas et al., 2010; Ellis et al., 2003; Vokes et al., 2004). Из-за этой ранней эмбриональной летальности роль передачи сигналов Hh в регуляции более поздних событий по формированию эмбриональной васкулатуры, особенно по регуляции разветвленного ангиогенеза остается в основном не исследованной. Мы исследовали эмбрионы птиц, используя cyclopamine, чтобы ингибировать сигнальную активность Hh после того, как эндотелиальная сеть уже создана. Наши результаты продемонстрировали, что передача сигналов Hh важна для формирования межсегментных сосудов, ISVs, которые образуются среди первых кровеносных сосудов благодаря ангиогенезу ветвления (Fig. 1). Это первое доказательство важной роли передачи сигналов Hh в регуляции ангиогенного роста во время эмбрионального развития.

Molecular Response to Inhibition of Hh Signaling

Две части доказательств строго указывают на то, что Hh не передает сигналы непосредственно эндотелиальным клеткам, чтобы модулировать их поведение. Во-первых, хотя глобальный нокаут функции Smoothened вызывает раннюю эмбриональную гибель из-за сосудистых дефектов (Coultas et al., 2010; Vokes et al., 2004), мыши, лишенные функции Smoothened особенно в эндотелиальных клетках, жизнеспособны (White et al., 2007). Во-вторых, активация экспрессии PTCH1 , которая служит как индикатор активной передачи сигналов Hh (Pearse et al., 2001), не выявляется в эндотелиальных клетках цыплят (Moran et al., 2011). Итак, эти данные строго подтверждают, что эффекты Hh на развитие эндотелия обеспечиваются c помощью др. регуляторных факторов.

Чтобы идентифицировать молекулярные пути, на которые влияет ингибирование передачи сигналов Hh, мы исследовали уровни экспрессии 21 гена кандидата, влияющих на регуляцию эндотелиального роста и функции. Наши результаты показали, что только два белка, DLL4 и VEGFA, обнаруживали существенное снижение, когда нарушалась передача сигналов Hh (Fig. 2). Точная регуляция уровней экспрессии обоих этих генов, как известно, критическая для сосудистого развития, поскольку потеря одной копии является эмбриональной леталью (Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al, 1996; Duarte et al., 2004; Gale et al., 2004). С др. стороны наблюдение, что транскрипционные уровни многочисленных ограниченных эндотелием или специфических маркеров оказывались неизменными, показывает, что воздействие cyclopamine оказывает незначительный или не оказывает эффекта на общее количество эндотелиальных клеток или их профиль генной экспрессии.

Neither Notch Nor BMP Signaling Is Required for Growth of ISVs

Поскольку экспрессия DLL4 снижена у эмбрионов кур с ингибированным Hh, поэтому исследовали роль передачи сигналов Notch в росте ISV более детально. В результате мы оказались способны продемонстрировать, что уровни транскриптов для ряда компонентов пути передачи сигналов Notch, в самом деле, депрессированы, если передача сигналов Hh ингибирована (Fig. 3A), при помощи ингибитора Notch, DAPT, это не вызывало каких-либо обнаружимых отклонений в образовании ISV . Этот эксперимент был повторен в др. время и с др. дозами DAPT (данные не показаны), но не наблюдалось эффектов в формировании сосудистого паттерна, вплоть до доз, которые нарушали жизнеспособность эмбрионов. Эти результаты оказались неожиданными, поскольку предыдущие исследования показали, что прекращение передачи сигналов Notch у эмбрионов мыши нарушает формирование сосудистого паттерна. Напр., когда функция NOTCH4 устранялась, то инициальная сосудистая сеть формировалась нормально, но ремоделирование и ветвление сосудов тяжело нарушалось (Krebs et al., 2000). Сходным образом, мышиные эмбрионы, гетерозиготные по дефицитному Notch лиганду, DLL4, обнаруживали дефекты ветвления и ремоделирования сосудов (Duarte et al., 2004; Gale et al., 2004; Krebs et al., 2004). С др. стороны, передача сигналов Notch, по-видимому, не была важной для роста ISVs у эмбрионов рыбок данио. Нокдаун Dll4 с использованием morpholinos, или воздействие на эмбрионов DAPT, приводило в целом к нормальному образованию ISVs (Leslie et al., 2007). Исследования на эмбрионах рыбок данио с мутациями в некоторых др. Notch сигнальных генов (deltaC, deltaD и notch1a) выявило лишь незначительные аномалии в росте ISV и только в задних регионах эмбриона (Therapontus and Vargesson, 2010). Итак, наши данные подтвердили, что передача сигналов Notch не играет центральной роли в регуляции роста ISV у эмбрионов кур, ситуация, которая очень сильно напоминает формирование сосудистого паттерна у рыбок данио скорее, чем у мышей.

Hh,как было установлено, регулирует экспрессию BMP4 во время развития сосудистой сети желточного мешка мыши (Astorga and Carlsson, 2007) и поэтому мы предприняли серию экспериментов, чтобы определить может ли передача сигналов BMP участвовать в регуляции выростов ISV outgrowth. Однако исследования уровней транскриптов BMP2 и BMP4 c помощью qRT-PCR не выявило изменений когда передача сигналов Hh была ингибировна и мы не наблюдали заметных отклонений в количестве фосфорилированного SMAD1/5 (Supp. Fig. S1). Поэтому очевидно, что передача сигналов, BMP не участвует в регуляции роста ISV ниже Hh.

VEGF Signaling Is Regulated by Hh and Is Required for ISV Formation

Предыдущие исследования продемонстрировали, что экспрессия VEGF регулируется c помощью Hh (Coultas et al., 2010; Pola et al., 2001; White et al., 2007) и наш анализ эндотелиальных регуляторных и маркерных генов выявил, что VEGFA является единственным геном, чьи уровни транскриптов снижаются, когда ингибирована передача сигналов Hh (Fig. 2). Экспериментально добавление VEGF способно восстановить ангиогенное ветвление в присутствии Hh ингибитора cyclopamine (Fig. 5A-D), тогда как специфическое ингибирование сигнального пути VEGF приводит к полному отсутствию новых ISVs, точно также как и при ингибировании Hh (Figs. 5E,F, 6E). В согласии с предыдущими исследованиями (Lobov et al., 2007), мы показали, что VEGF активирует экспрессию DLL4 (Supp. Fig. S2). Следовательно, наблюдаемое снижение экспрессии DLL4 у эмбрионов, обработанных cyclopamine (Fig. 2) может быть нижестоящим эффектом снижения активности VEGF .

Стимуляция передачи сигналов Hh приводит к усилению уровней экспрессии VEGFA, выявляемых как с помощью гибридизации in situ так и qRT-PCR (Fig. 4), и это сопровождается усилением количества ISVs (Fig. 6D). Это последнее наблюдение контрастирует с результатами предыдущих исследований по стимуляции передачи сигналов Hh у эмбрионов мышей с помощью устранения функции PTCH1 (Coultas et al., 2010). У Ptch1 нулевых животных наблюдалась измененная структура сосудов, включая увеличение в диаметре DA, но не увеличение экспрессии Vegfa. Имеются, по крайней мере, две причины кажущегося расхождения между нашим исследованием и работами на мышах. Во-первых, в исследованиях на курах исследовались более поздние ст. сосудистого развития после инициации сосудистого сплетения и во-вторых, мышиные эмбрионы были уже тяжело повреждены онтогенетически из-за времени проведения эксперимента и не могли отражать нормальную сигнальную реакцию. Несмотря на это наше наблюдение увеличения экспрессии VEGFA в ответ на усиление передачи сигналов Hh подсказывает правдоподобный механизм увеличения образования ISV, поскольку нет альтернативы VEGF в исследованиях на мышах.

Итак, наше исследование подтверждает постоянную роль Hh в регуляции формирования сосудистого паттерна в ходе всего эмбрионального развития, включая регуляцию ангиогенеза ветвления. Скорее, чем действие по принципу включение-выключение экспрессии VEGF, Hh, скорее всего, участвует в поддержании уровней экспрессии VEGF внутри очень четких границ, необходимых для нормального развития эндотелия.

Hedgehog regulates angiogenesis of intersegmental vessels through the VEGF signaling pathway Carlos M. Moran, Candace T. Myers, Cristy M. Lewis, Paul A. KriegDevelopmental Dynamics Volume 241, Issue 6, pages 1034–1042, June 2012

Hedgehog regulates angiogenesis of intersegmental vessels through the VEGF signaling pathway
Carlos M. Moran, Candace T. Myers, Cristy M. Lewis, Paul A. Krieg
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 6, pages 1034–1042, June 2012