При ангиогенезе важность передачи сигналов киназы хорошо известна, как на уровне рецепторов, так и внутри клетки (Olsson et al.,2006). Завершение передачи сигналов киназы безусловно существенно и поэтому фосфорилирование белков мишеней сбалансировано c помощью дефосфорилирования и деградации белков. Имеется несколько повсеместных протеин фосфатаз, но на сегодня известна только одна специфичная для сосудов протеин фосфатаза; vascular endothelial-protein phosphatase (VE-PTP). Этот белок является трансмембранной тирозин фосфатазой, важной для нормального ангиогенеза и эмбриогенеза (Dominguez et al.,2007). Поэтому важно идентифицировать и охарактеризовать роль дополнительных фосфатах, избирательно экспрессирующихся в сосудистой сети. С этой целью мы показали, что Paladin, предполагаемая протеин фосфатаза , является цитоплазматическим белком, экспрессирующемся в сосудистой сети развивающихся и взрослых тканей мышей, а также у нормальных людей и в сосудах головного мозга. Мы идентифицировали Paladin вдвух независимых скринингах (Wallgard et al.,2008; Kalen et al.,2009). При одном подходе Paladin был среди 58 генов, идентифицированных в качестве стержневого набора генов с широкой и всеобщей экспрессией в сосудах мышей (Wallgard et al.,2008). В этом наборе 26 генов были известными регуляторами биологии сосудов. Несмотря на огромный интерес к генетической регуляции ангиогенеза, мы установили -по большей степени нгеожиданно для себя-что только немногие гены среди этих 26 были детально охарактеризованы относительно паттерна их экспрессии, i.e., Ptprb (VE-PTP), EphB4, CD31, VE-cadherin, Vegfr2, Alk1, endoglin, Notch4, Robo4, Tie1 и Nrp1. Чтобы исследовать экспрессию Paladin, мы использовали антитела против Paladin а также новый целевой аллель мыши, обладающий LacZ репортерным геном.

Анализ экспрессии генов, базирующийся на LacZ репортере имеет сво за и против. В целом это чувствительный и очень специфический метод детекции активности генов, но почти всегда имеется риск, что делеция генов будет затрагивать промотор и поэтому не будет воспроизводить настоящий паттерн экспрессии мРНК эндогенного гена. Кроме того, период полужизни LacZ белка длинный и поэтому быстрые on/off изменения в экспрессии генов не могут быть отслежены. В свете этого мы сравнивали экспрессию LacZ репортера с мРНК c помощью гибридизации in situ Paladin как это рекомендуется Genepaint. На ст. E14.5 гибридизация in situ мРНК и паттерны экспрессии LacZ оказались в основном теми же самым. Кроме того, мы использовали поликлональные антисыворотки против Paladin человека, который также прекрасно реагировал с белком мыши, для окрашивания тканей мыши. Сравнение экспрессии LacZ репортера и окрашивания белка Paladin у эмбрионов на ст. E14.5 и в головном мозге на ст. P5 давало почти идентичные паттерны окрашивания. Следовательно, мы пришли к выводу, что Paladin LacZ репортер в точности воспроизводит экспрессию мРНК и белка Paladin во время эмбриогенеза и раннего постнатального развития.

Антисыворотка против Paladin была создана c помощью проекта Human Protein Atlas, который используется для систематической генерации специфических антител на глобальной шкале в комбинации с высокопроизводительной продукцией лишенных сродства поликлональных антител с базирующимся на иммуногистохимическом профилировании белков в тканях и микромассивах клеток (Ponten et al.,2011). Все данные по экспрессиим белков опубликованы и свободно доступны на портале Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org; Uhlen et al.,2005,2010). В результате подобных усилий были созданы два разных ти па антител в отношении двух не перекрывающихся эпитопов человеческого белка Paladin (HPA015696 and HPA017343). Окрашивание с использованием анти-Paladin антител HPA015696 безусловно давало более отчетливое соотношение сигнала к фону по сравнению с HPA017343. Поэтому мы анализировали только изображения с использованием HPA015696. Выявлены различия в окрашивании сосудов в головном мозге, легких, почках, поджелудочной железе, плаценте и коже. Однако окрашивание было в основном локализованного в эндотелиальных клетках, даже если субнабор из vSMC был также позитивным. Исключительно эндотелиальное окрашивание было выявлено в большом количестве как капилляров, так и крупных сосудах при сравнении с мышиным Paladin LacZ репортером. Окрашивание вне сосудов наблюдалось в кардиомиоцитах, макрофагах легких, микроглии ЦНС и в клетках стенок латеральных желудочков головного мозга. По сравнению с экспрессией LacZ репортера у мышей, анализ окрашивания тканей человека в Human Protein Atlas выявил дополнительное окрашивание в кишечнике, эпителии почечных канальцев, нервных клетках коры головного мозга, а также иногда в панкреатических островках Лангерганса и миоцитах поперечно-полосатых скелетных мышц. Мы прилши к выводу, экспрессия мышиного и человеческого гена и белка перекрывается в значительной степени. Однако окрашивание антителами тканей человека указывает на более широкую экспрессию белка человека по сравнению с геном и белком мыши, как внутри, так и вне сосудистой сети. Кроме того, окрашивание человеческим Paladin во взрослых тканях преимущественно локализовалось в эндотелии с противовес окрашиванию у мышей. Учтя это мы проверяли экспрессию Paladin LacZ репортера у мышей как с использованием окрашивания антителами Paladin, так и сравнивая с гибридизацией in situ мРНК, мы смогли утверждать, что различия, наблюдаемые между мышами и человеком отражают настоящие отличия в регуляции гена и белка скорее, чем технические аспекты используемых методов. a

При характеристике паттерна экспрессии Paladin у мышей мы были поражены его динамической экспрессией во время развития сосудов; преимущественно экспрессия начиналась в эндотелиальных клетках примитивного капиллярного сплетения и венах, но со временем сдвигалась на перициты и vSMCs артерий в зрелой сосудистой сети (Table 1). Такой тип паттерна экспрессии ранее не был описан детально. Среди 26 известных сосудистых регуляторов, относящихся к стержневому кластеру, имеются, по крайней мере, три др. гена, которые экспрессируются как в эндотелиальных, так интрамуральных клетках; Ephrin-B2 (Gale et al.,2001), Notch4 (Lindner et al.,2001), Alk1 (Yao et al.,2007) и adrenomedullin корецептор Calcrl (calcitonin like receptor-like; Kamitani et al.,1999). Однако динамика их экспрессии неизвестна. Более того, если говорить о генах вне основного кластера, существуют дополнительны концентрирующиеся в сосудах гены, экспрессирующиеся как в эндотелиальных, так и внутристеночных клетках, напр., CD13 (aminopeptidase N; Rangel et al.,2007) и Gpr124 (Kuhnert et al.,2010). Т.о., сосудистые гены экспрессируются, (i) как в эндотелии, так и внутристеночных клетках (Paladin, Gpr124), (ii) преимущественно в эндотелии (CD31, VE-cadherin) или (iii) преимущественно в гладкомышечных клетках и перицитах (?-SMA, RGS5). Интересно, что Paladin-и подобные ему др. гены-сдвигают экспрессию с одного типа клеток на др. со временем. Регуляция транскрипции этих трех основных паттернов экспрессии также отличается. Для специфической эндотелиальной экспрессии, Black с сотр. показали, что комбинация двух транскрипционных фактороров (сами не экспрессирующиеся избирательно в эндотелиальных клетках) ведет к синергичной активации специфичной для эндотелия транскрипции (De Val et al.,2008). Контроль транскрипции генов, сдвигающих свою экспрессию с эндотелиальных на интрамуральные клетки, пока не выявлен. Чтобы выяснить этот механизм, важно еще более охарактеризовать экспрессию др. сосудистых генов. Table 1. Summary of Paladin Expression in the Vasculaturea

Относительно функции Paladin, Huang с сотр. ранее показали, что Paladin негативно регулирует количество, передачу сигналов инсулиновых рецепторов, и их AKT фосфорилирование (Huang et al.,2009). Хотя мы не смогли выявить экспрессию Paladin LacZ репортера в островках Лангерганса мышей, это возможно из-за того, что нокаутная конструкция вызывает делецию существенного региона промотора, необходимого для этой экспрессии, или что существуют различия в экспрессии между мышами и человеком. Теперь известно, что паттерн экспрессии Paladin в основном касается сосудистой сети в позднем эмбриогенезе и у взрослых, можно предполагать, что одной из дополнительных функций Paladin является регуляция передачи сигналов в сосудах. Более того, ранее мы установили, что у рыбок данио Paladin важен для нормального развития сосудов и сосудистого кровоснабжения (Kalen et al.,2009). Поэтому возможно, что Paladin выполняет более широкую роль в регуляции рецепторной тирозин киназы и AKT фосфорилирования в сосудистой сети. Принимая во внимание, что Paladin имеет 4 предсказанные S/T/Y фосфатазных домена и негативно регулирует инсулиновую рецепторную тирозин киназу и AKT фосфорилирование, Huang ссотр. не смогли подтвердить фосфатазную активность белка (Huang et al.,2009). Члены сверхсемейства PTP могут быть подразделены на 4 основных подсемейства, типы 1 - 4, исходя из их аминокислотных последовательностей и присутствия функциональных доменов (Alonso et al.,2004; (Mustelin,2007). Ген полной длины Paladin человека обнаруживает слабую гомологию с DUSP23 (dual specificity phosphatase 23), которая относится к PTP подсемейству 1. DUSP23 ,как было установлено, усиливает передачу сигналов MAPK не зависимую от каталитического сайта, поскольку действует как каркас и усиливает MAPK связывание с JNK и p38 (Takagaki et al.,2004: Wu et al.,2004). Др. белок, содержащий каталитически неактивный фосфатазный домен с ролью в эндотелиальной биологии, это His-домен содержащая protein tyrosine phosphatase (HD-PTP). HD-PTP является классическим не трансмембранным PTP, экспрессирующимся широко и обнаруживающим регуляцию эндотелиальной миграции посредством инактивации c помощью Src kinase и модуляции FAK фосфорилирования (Castiglioni et al.,2007, 2009). HD-PTP является каталитически неактивной из-за неправильной аминокислотной последовательности в PTP домене (Gingras et al.,2009). Это подтверждает, что могут существовать несколько каталитически неактивных PTPs, которые обладают критическими функциями в сосудистой биологии. Важно установить, является ли Paladin одним из таких каталитически неактивных фосфатаза-подобных белков и как Paladin как и др. фосфатаза-подобные белки, влияют на передачу сигналов и ангиогенез.