Наблюдение интригующих фенотипов у плодовых мушек, у которые специфическая часть тела трансформировалась в др., стало первой ступенью в направлении идентификации Hox генов (Bateson, 1894). Эти гены затем были картированы в результате тщательного генетического анализа, которые далее подтвердил их существенную роль в обеспечении качественных особенностей сегментов вдоль передне-задней (AP) оси эмбрионов Drosophila (Lewis, 1978). Позднее было открыто, что они кодируют транскрипционные факторы, которые обладают общим ДНК-связывающим доменом в 60 аминокислот, известным как homeodomain (HD) (McGinnis et al., 1984). Млекопитающие имеют 39 Hox генов, распределенных по 4-м кластерам, как полагают, результат двойного события дупликации (Krumlauf, 1994). Эти гены могут быть классифицированы, как 13 paralog groups (PGs) в соответствии с гомологией последовательностей и их позицией внутри кластера (Krumlauf, 1994). Количество PG членов в каждом кластере варьирует от 9 до 11, и каждая PG представлена, по крайней мере, двумя кластерами.

У позвоночных онтогенетический процесс под контролем Hox формирует осевой скелет. Производные осевого скелета происходят из сомитов, мезодермальных сегментированных структур, симметрично организованных по обеим сторонам развивающегося спинного мозга (rev. Dubrulle и Pourquie, 2004). Все моситы выглядят морфологически одинаковыми, но продуцируют скелетные элементы (позвонки) с индивидуальными морфологическими характеристиками, которые варьируют в зависимости от из положения вдоль AP эмбриональной оси (rev. Brent и Tabin, 2002). В анатомической перспективе позвоночный столб может быть подразделен на 5 разных регионов: шейный, торакальный, поясничный, крестцовый и хвостовой. Общее количество позвонков в позвоночнике животных и их распределение вдоль этих регионов определяется осевой формулой, которая широко варьирует среди видов позвоночных. Hox гены являются основными регуляторами паттернов дифференцировки сомитов, которые продуцируют соотв. осевую формулу (Krumlauf, 1994). В частности, считается, что специфические комбинации Hox генов вдоль AP оси ответственны за генерацию позвонков с разными анатомическими свойствами (rev. Wellik, 2007).

Большое количество исследований, в основном использовало мышей в качестве модели, была подчеркнута сложность паттерн-формирующих Hox активностей, ведущих к продукции соотв. образом организованного осевого скелета (rev. Mallo et al., 2010). Функции формирования регионального паттерна Hox генов это результат комбинации как уникальных функциональных свойств, ассоциированных с каждым Hox белком, так и соотв. контроля за их пространственной и временной экспрессией. Чрезвычайная изменчивость осевой формулы среди позвоночных может быть результатом в значительной степени диверсификации механизмов, регулирующих экспрессию Hox генов и и активность во время эмбрионального развития.

DEVELOPMENTAL REGULATION OF HOX GENE ACTIVATION

У позвоночных экспрессия Hox генов инициируется в клетках задней части первичной полоски, которая вносит вклад во внеэмбриональную мезодерму, и затем расширяется кпереди в проспективные клетки собственно эмбриона (фаза инициации; rev. Deschamps et al., 1999). Последовательная активация Hox генов непосредственно отражает их положение внутри кластера, при этом экспрессия более задних (5') генов прогрессивно инициируется в более поздние сроки развития (свойство известное, как временная колинеарность; Izpisua-Belmonte et al.,1991). Инициальные домены экспрессии Hox передаются возникающей впоследствии параксиальной мезодерме во время гаструляции, создавая первые паттерны экспрессии Hox в этой мезодермальной ткани (фаза становления; rev. Deschamps et al., 1999). В это время градиенты ретиноевой кислоты (RA), передачи сигналов Fgf и Wnt, как было установлено, модулируют экспрессию Hox генов, возможно посредством совместного действия регуляторов транскрипции Cdx (rev. Mallo et al., 2010). Как только устанавливаются передние границы экспрессии Hox, белки Polycomb group (PcG) и Trithorax group (trxG) оказывают важную роль в поддержании их в течение всего эмбрионального развития (фаза поддержания; rev. Deschamps et al., 1999).

Активация Hox генов происходит одновременно с эмбриональным ростом у эмбрионов позвоночных и, в результате прогрессивной активации во времени эти гены приобретают пространственный компонент, при этом 3' Hox гены начинают экспрессироваться на более передних уровнях эмбриона по сравнению с теми, что на 5' конце кластера. В соответствии с этим, экспрессия Hox генов у эмбрионов лягушек инициируется по времени в колинеарной последовательности в неорганизованной мезодерме на стадии гаструлы и это совпадает со становлением AP характеристик в этой ткани (Wacker et al., 1994). Эти мезодермальные клетки оказываются более не компетентными экспрессировать дополнительные Hox гены, как только они разворачиваются (involute) в губе бластопора во время гаструляции и покидают "поле индукции Hox," и, поэтому, их AP характеристики фиксируются на этой ранней эмбриональной стадии. После этой колинеарной активации Hox гены, как было установлено, контролируют время проникновения клеток во время гаструляции в эмбрионы кур и тем самым время, в течение которого эти клетки достигают эмбриональной оси (Iimura и Pourquie, 2006). В целом, эти результаты строго подтверждают мнение, что время активации Hox генов в мезодерме во время гаструляции в основном предопределяет AP домены экспрессии Hox и контролирует качественные особенности позвонков.

Timing of Hox Gene Activation и Alterations in the Axial Skeleton

Разные исследования показали, что у разных видов позвоночных специфические Hox гены экспрессируются на AP уровнях в соответствии с определенными характеристиками осевого скелета. Напр., ранний сравнительный анализ, сконцентрировавшийся на на переходе от шеи к тораксу, выявил, что этот анатомический признак обычно ассоциирован с активацией генов, соответствующих HoxPG6 (Gaunt,1994; Burke et al., 1995). Это подтверждает роль HoxPG6 генов в старте закладки области осевого скелета, содержащей рёбра. Подтверждение этой гипотезы получено в экспериментах с трансгенами у мышей, показавших способность Hoxb6 гена индуцировать эктопические ребра (Vinagre et al., 2010). Следовательно, механизмы, регулирующие точное время активации HoxPG6 у разных видов позвоночных д. непосредственно влиять на количество позвонковых сегментов в их шеях.

Сравнительно недавно, сходная корреляция между экспрессией Hox гена и паттернами позвонков получена для каудального конце туловища. В частности, наблюдалось, что активация HoxPG10 - HoxPG13 генов сильно задержана у эмбрионов змей и безногих позвоночных, грубо соответствуя переходу от туловища к хвосту и окончанию удлиняющейся оси (Woltering et al., 2009; Di-Po? et al., 2010). Эти результаты показывают, что удивительно длинные дорсальные (содержащие ребра) регионы характерны для этих животных и могут быть результатом изменений во времени активации этих задних Hox генов.

Функциональная связь между временам активации Hox генов и и формированием осевого паттерна далее была продемонстрирована экспериментально на мышах. Некоторые из этих экспериментов использовали преждевременную экспрессию некоторых Hox генов, используя трансгенные подходы (Kessel et al., 1990; Lufkin et al., 1992; Carapu?o et al.,2005; Vinagre et al., 2010). Такие трансгенные мыши обнаруживали разные типы гомеотических трансформаций в своем осевом скелете, которые коррелировали с передней экспансией активности генов, экспрессируемых с трансгена. Хотя эти эксперименты могут быть интерпретированы в терминах измененной пространственной экспрессии, точная взаимосвязь между онтогенетическим временем и AP уровнями показывает, что они могут быть также следствием более ранней, чем в норме активации специфического Hox гена. В соответствии с этой гипотезой, преждевременная активация Hoxd4 дает фенотип, напоминающий тот, что возникает в результате избыточной экспрессии этого гна при использовании энхансера более переднего Hox гена (Lufkin et al., 1992; Bel-Vialar et al., 2000).

Разные исследования тестировали функциональные следствия модифицирования известных регуляторных регионов внутри Hox локусов. Делеция важного Hoxc8 энхансера у мышей в основном воспроизводила фенотипические характеристики, наблюдаемые после инактивации гена Hoxc8 (Juan и Ruddle, 2003). Интерсно, что удаление этого энхансера задерживает активацию, Hoxc8, но, по-видимому, не оказывает влияния на его экспрессию на более поздних ст. развития. Более того, аналог Hoxc8 энхансера у кур управляет экспрессией репортерных генов из более задних осевых уровней в параксиальной мезодерме эмбрионов трансгенных мышей (Belting et al., 1998). Это согласуется с пониженным количеством торакальных позвонков у кур по сравнению с мышами. К сходному выводу привели два in vivo исследования в Hoxd кластере. В частности, удаление регуляторного региона внутри задней области этого кластера приводило к задержке активации Hoxd11 и вызывало смещение кзади крестца подобно тому, как это происходило у Hoxd11 мутантных мышей (Z?k?ny et al., 1997). Когда в комплементарном наборе экспериментов этот энхансер замещался соотв. регуляторным элементом от рыбок данио, то активация Hoxd11 обнаруживалась в более раннее время развития и приводила к транспозиции крестца в противоположном направлении, уменьшая поясничную область на один сегмент (G?rard et al., 1997). Эти эксперименты подтвердили, что точный временной контроль инициальной активации Hox гена важен для процессов формирования паттерна в параксиальной мезодерме. Кроме того, они показали, что эволюция дискретных регуляторных регионов может играть существенную роль в определении времени видоспецифичной активации Hox генов и и может поэтому служить в качестве инструмента при определении закладки разных осевых формул у разных видов позвоночных.

Epigenetic Regulation of the Hox Clock in Axial Progenitors

Ассоциация между временными аспектами активации Hox генов и и формированием мезодермального паттерна подтверждает, что понимание механистических и молекулярных основ временной активации Hox генов является важным для дальнейшего понимания морфогенеза и эволюции осевого скелета позвоночных. Несколько элегантных генетических исследований на мышах, осуществлённых более 10 лет тому назад, подтвердили существование репрессивных условий внутри Hox кластеров. Внесение Hoxd9/lacZ и Hoxd11/lacZ трансгенов в эктопическую заднюю геномную позицию в кластере Hoxd (между Hoxd13 и Evx2) привело к задержке экспрессии репортерного гена, это специфически коррелировало с местом интеграции, хотя ограниченное пространственное распределение трансгенов оставалось в основном неизменным (van der Hoeven et al., 1996). Более того, последовательные вставки Hoxd9/lacZ трансгена выше кластера Hoxd выявило геномное расположение регуляторного элемента, нарушающего эти репрессивные условия (Kondo и Duboule, 1999). Делеция этого элемента приводит к преждевременной экспрессии Hox гена в инициальной фазе активации и ведет к гомеотическим трансформациям осевого скелета (Kondo и Duboule, 1999). Корректные осевые паттерны экспрессии генов Hox несмотря на это распознаются позднее в развитии. Хотя эти исследования согласуются с регуляторным механизмом высшего порядка, который устанавливает репрессивные условия на 5' конце кластера и специфически контролирует последовательную инициацию экспрессии Hox генов. Низкого порядка регуляторный механизм, участвующий в активации транскрипции с помощью ген-специфических коротко действующих регуляторных элементов, д. позднее регулировать экспрессию Hox во время фазы становления, генерируя пространственно ограниченные домены экспрессии.

Позднее было предположено, что определенная структура хроматина ответственна за репрессивные условия в кластере и что прогрессивное открытие хроматина д. приводить к последовательному 3' - 5' высвобождению Hox генов из репрессии и к активации транскрипции (Kmita и Duboule, 2003). Подтверждение этой гипотезы предоставлено недавними сообщениями, показавшими , что время активации Hox генов строго коррелирует со структурными модификациями хроматина кластера в 3' - 5' направлении (Chambeyron и Bickmore, 2004; Chambeyron et al., 2005; Morey et al., 2007; Soshnikova и Duboule, 2009; Noordermeer et al., 2011). В частности, последовательная активация Hoxb генов в эмбриональных стволовых (ES) клетках после добавления RA коррелирует с прогрессивным приобретением активных гистоновых модификаций (di-метилирование лизина 4 гистона H3 (H3K4me2) и ацетилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9ac)) на промоторах Hoxb1 и Hoxb9 (Chambeyron и Bickmore, 2004). Более того, системный анализ распределения двух гистоновых модификаций (tri-метилирование лизина27 гистона H3 [H3K27me3] и tri-метилирование лизина 4 гистона H3 [H3K4me3]) во время активации Hoxd кластера в первичной оси тела эмбриона мыши, выявило, что такой же механизм также появляется in vivo (Soshnikova и Duboule, 2009; Noordermeer et al., 2011). Колинеарная во времени экспрессия Hoxd генов, как было установлено, коррелирует с прогрессивным колинеарным снижением в распределении репрессивной метки H3K27me3 и повышением активной метки H3K4me3 (Fig. 1). Эти динамические изменения в хроматине предшествуют инициации экспрессии Hoxd и не детерминируются с помощью механизма разрастания,ак первоначально предполагалось, т.к. распределение гистоновых меток в основном поправляется после разрушения целостности кластера (Soshnikova и Duboule, 2009). Помимо этих эпигенетических модификаций наблюдаются деконденсация хроматина и ядерное репозиционирование доменов активного хроматина, конкурентно с активацией генов в ES клетках и в AP эмбриональной оси (Chambeyron et al.,2005; Morey et al., 2007; Noordermeer et al., 2011). Figure 1.

Хотя строгая корреляция, наблюдаемая между специфическими гистоновыми модификациями и экспрессией Hox у ранних эмбрионов, подтверждает её важную биологическую роль, их функциональные взаимоотношения остаются неуловимы. Гистоновые модификации, ассоциированные с активным и неактивным состояниями хроматина во время активации Hox кластеров подтверждают участие PcG и trxG белков в этом процессе. PcG и trxG гены были первоначально идентифицированы у плодовых мушек (Lewis, 1978), где они оказывались вовлечены в поддержание соотв. доменов экспрессии Hox генов после их инициальной активации (Simon et al., 1992). PcG белки, по-видимому, действуют в двух крупных мультимерных комплексах, известных как Polycomb Repressive Complexes (PRC). Гистон метилтрансферазная активность PRC2 накладывает H3K27me3 на гистоны в хроматине мишени. Эта гистоновая модификация затем распознается с помощью PRC1, чья активность способствует конденсации и молчанию хроматина ассоциированных локусов (Cao et al., 2005; Eskeland et al., 2010), возможно за счет моноубиквитинирования H2AK119 (Cao et al., 2005). Активность trxG также ассоциирована с мультимерным комплексом, который вносит активную H3K4me3 модификацию в нуклеосомы мишени, индуцируя тем самым ремоделирование локального хроматина и активацию генов (Milne et al., 2002). Базовый принцип активности PcG и trxG, по-видимому, сходен в системах позвоночных, хотя существование большого числа компоентов добавляет ещё один уровень сложности для анализа их функции (rev. Schuettengruber et al., 2007).

Генетические исследования на мышах показали, что PcG и trxG гены существенны для собственно формирования АР паттерна осевого скелета (van der Lugt et al., 1994, 1996; Akasaka et al., 1996; Cor? et al., 1997; Yu et al., 1998; del Mar Lorente et al., 2000; Terranova et al., 2006). В частности, мыши, дефицитные по PRC1 белкам Bmi1 (van der Lugt et al., 1994), M33 (Cor? et al., 1997), Mel18 (Akasaka et al., 1996) и Ring1A (del Mar Lorente et al., 2000) обнаруживают задние трансформации осевого скелета, которые коррелируют с anteriorization экспрессии Hox генов в параксиальной мезодерме. Фенотипы скелета, наблюдаемые у всех этих мутантных эмбрионов обычно слабо выражены и затрагивается, по-видимому, только экспрессия специфических субнаборов Hox генов. Это может отражать функциональную избыточность между различными компонентами PRC1. В соответствии с этим одновременная инактивация Bmi1 и Mel18 (Akasaka et al., 2001) и Bmi1 и M33 (Bel et al., 1998) вызывает более тяжелые фенотипические отклонения скелета. Альтернативно, умеренные фенотипические отклонения могут указывать на то, что мультимерные комплексы собираются в тканях тканеспецифическим образом, при этом в каждой используется специфический субнабор регуляторных процессов.

Напротив, инактивация PRC2 членов Eed, Ezh2 и Suz12 во всех случаях оказывает радикальные эффекты на эмбриональное развитие мышей, поскольку мутанты погибают во время гаструляции с тяжелыми дефектами формирования АР паттерна (Shumacher et al., 1996; O'Carroll et al., 2001; Pasini et al., 2004). Ранняя эмбриональная летальность PRC2 мутантных эмбрионов, скорее всего, отражает широкую биологическую роль этих белков в регуляции экспрессии генов и мешает анализу осевого скелета на поздних стадиях развития. Однако, Eed гипоморфные мутанты обнаруживают задние гомеотические трансформации осевого скелета, напоминающие таковые у PRC1 мутантов (Shumacher et al., 1996), подтверждая участие обоих PRCs в регуляции Hox генов. Возможно, что более сильные фенотипические отклонения, наблюдаемые у PRC2 мутантных эмбрионов являются следствием меньшей перекрываемости активностей компонентов этого комплекса. Кондиционные делеции членов PRC2 комплекса необходимы для дальнейшего анализа их роли в регуляции Hox генов и формирования осевого паттерна особенно во время инициальной активации экспрессии Hox генов.

Анализ экспрессии показывает, что инактивация компонентов PRC1 вызывает передний сдвиг в сомитах экспрессии специфических Hox генов. Однако, время инициации активации Hox генов, по-видимому, в основном не затрагивается. Следовательно, потребность в PRC1 для поддержания доменов экспрессии Hox, по-видимому, подтверждается этими данными, вклад этого комплекса в инициальную ступень активации Hox генов остается неясным. Однако, исследования, проведенные на мутантных мышах по PRC1 белку M33, предоставляют некоторые доказательства в пользу функциональной связи между активностью PcG и инициальной активацией экспрессии Hox генов (Bel-Vialar et al.,2000). В частности, M33 мутантные эмбрионы облегчают доступ к элементам, чувствительным к RA, внутри кластера Hoxd, поскольку низкие дозы RA вызывают преждевременную активацию Hox генов и гомеотические трансформации в осевом скелете этих мутантов. Это согласуется с более лабильным репрессированным состоянием Hox кластеров в отсутствие M33 и подтверждает, что помимо его хорошо известной функции в эпигенетическом поддержании позиционных качественных особенностей (rev. Soshnikova, 2011), PcG белки могут также играть существенную роль в ранней репрессии Hox генов. Чёткие доказательства этому всё ещё отсутствуют и дожидаются дальнейших исследований.

Инактивация Mll, важного компонента trxG комплекса, показывает, что trxG белки также участвуют в регуляции Hox генов у мышей (Yu et al.,1995, 1998). Анализ экспрессии показал, что активация Hox как и следует инициируется у Mll-дефицитных эмбрионов. Однако, по ходу развития домены экспрессии специфических Hox генов постепенно теряются в параксиальной мезодерме, приводя к двунаправленным гомеотическим трансформациям осевого скелета (Yu et al., 1995, 1998). Следовательно, подобно PcG, trxG гены безусловно играют роль в фазе поддержания экспрессии Hox генов, но их участие в инициальной активации Hox генов менее ясно.

HOX GENE REGULATION BEYOND TRANSCRIPTION

Хотя большинство наших знаний относительно регуляции Hox генов сконцентрировано на механизмах, влияющих на транскрипцию генов, недавние исследования подтвердили существование функционально важных регуляторных процессов после транскрипции, влияющих на продукцию Hox белков во время эмбрионального развития.

Один из таких механизмов связан с активностью miRNAs, класса малых некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов, контролируя стабильность и/или эффективность трансляции специфических мРНК мишеней (rev. Filipowicz et al., 2008). Три высоко консервативных семейств miRNAs, miR-10, miR-196, и miR-615, продуцируются внутри Hox кластеров (Griffiths-Jones et al., 2008) и, как было установлено, нацелены на специфические Hox транскрипты (Mansfield et al., 2004; Yekta et al.,2004; Hornstein et al., 2005; Woltering и Durston, 2008). Интересно, что экспериментальные модификации уровней экспрессии miR-10 и miR-196 вызывают фенотипические отклонения, которые согласуются с аномальной экспрессией Hox генов (Woltering и Durston, 2008; McGlinn et al., 2009; He et al., 2011). Напр., когда miR-196 подвергается нокдауну у эмбрионов кур, то шейные позвонки приобретают торакальные характеристики (McGlinn et al., 2009). Более того, усиление или снижение активности этих miRNA во время развития рыбок данио вызывает трансформации в осевом скелете, затрагивающие шейную и торакальную области (He et al., 2011). Следовательно, miR-196, по-видимому, участвует в процессах формирования паттерна во время развития параксиальной мезодермы. Однако, регулирует ли miR-196 развитие скелета за счет модуляции продукции Hox белков, предстоит ещё определить. Интересно, что Hox кластером кодируемые miRNAs, по-видимому, нацелены преимущественно на передние Hox гены. На базе этого наблюдения было предположено (Yekta et al., 2008), что активность miRNA может помочь объяснить функциональное доминирование, которое задние гены Hox часто осуществляют по отношению к тем, что кодируются более 5' областями кластера (rev. Wellik 2007).

Помимо miRNAs, недавно было показано, что клеточные уровни рибосомальных белков могут служить средством контроля продукции Hox белков. В частности, мыши, гетерозиготные по инактивирующей мутации в рибосомальном белке L28 (RPL28) обнаруживают гомеотические трансформации в своем осевом скелете, напоминающие фенотипы Hox мутантов (Kondrashov et al., 2011). Интересно, что снижение уровней Rpl38 оказывает негативные эффекты на эффективность трансляции специфических субнаборов Hox транскриптов, не оказывая в целом влияния на компетентность клеток к трансляции. Пока неясно, что делает затрагиваемые транскрипты особенно чувствительными к дефициту Rpl38. Также неизвестно, представляет ли это исключительный механизм регуляции Hox генов или это только первый пример более распространенного механизма тонкой настройки уровней белков на трансляционном уровне.

Итак, возможно, что пространственная и временная регуляция продукции Hox белков использует многие уровни регуляции, гарантирующие соотв. распределение Hox активностей во время эмбрионального развития.

INTRINSIC FUNCTIONAL PROPERTIES OF HOX PROTEINS

Функциональная специфичность Hox генов у позвоночных не может быть объяснена исключительно на базе их дифференциальных паттернов экспрессии. Некоторые сообщения показали, что разные Hox гены дают отличающиеся морфологические отклонения, при исследовании при одних и тех же экспериментальных условий. Напр., трансгенная экспрессия Hoxb6, Hoxb9, Hoxa10, или Hoxa11, используя один и тот же энхансер, всегда приводит к разным альтерациям в осевом скелете эмбрионов (Carapu?o et al.,2005; Vinagre et al., 2010; Guerreiro et al., 2012). Удивительно, генетические исследования выявили высокую степень функциональной консервации среди членов одной и той же PG (Horan et al., 1995; Manley и Capecchi, 1997; Wellik и Capecchi, 2003; McIntyre et al., 2007). Было это четко продемонстрировано с помощью анализа компаундных мутантов по Hox PGs 9, 10 и 11. Полностью проявившийся нулевой фенотип наблюдался только после полного удаления всех членов PGs, присутствие одиночного аллеля любого из членов паралогов достаточно для достоверного устранения мутантного фенотипа (Wellik и Capecchi, 2003; McIntyre et al., 2007). Хотя такая функциональная специфичность должна зависеть от временной и пространственной активации каждого из рассматриваемых генов, соотв. фенотипы, возникающие в результате инактивации и преждевременной активации разных групп паралогов (Wellik и Capecchi, 2003; Carapu?o et al., 2005), подтверждают существование функциональных сигнатур в Hox белках. Важно, что функциональная избыточность среди членов может отличаться в зависимости от групп паралогов. HoxPG8 гены можно привести в пример, т.к. скелетные фенотипы компаундных paralog мутантов не могут быть объяснены их функциональной избыточностью (van den Akker et al., 2001) и отличающиеся фенотипы были получены после трансгенной активации Hoxb8 или Hoxc8 на одной и той же эмбриональной территории (Pollock et al.,1995).

Молекулярные сигнатуры, отмечающие функциональную специфичность Hox белков позвоночных всё ещё в основном неизвестны, но некоторые сообщения начинают проливать свет на этот вопрос. Hox гены кодируют транскрипционные факторы, которые избирательно регулируют транскрипцию нижестоящих генов. Следовательно, выяснение механизмов, контролирующих дифференциальную избирательность соотв. промоторов и энхансеров, а также тех, что регулируют активацию или репрессию этих элементов, важно для понимания того, как активность Hox генов превращается в специфические паттерн формирующие и морфогенетические процессы.

Lessons From Hox Domains и Motifs

Homeodomain

HD это регион Hox белков, которые привлекает наиболее пристальное внимание. Структурно он уложен в три α-спирали, которому предшествует гибкое N-терминальное плечо. Третья спираль (спираль распознавания) и N-терминальное плечо участвуют в специфических контактах с ДНК (Kissinger et al., 1990; Billeter et al., 1993). Систематический анализ ДНК связывающих свойств разных HDs показал, что остатки третьей спирали отвечают за специфичность связывания ДНК и служит для определения подклассов HDs, представленных в разных семействах белков (Noyes et al., 2008). HDs в Hox белках в основном попадают в одну и ту же подгруппу HDs и , следовательно, ДНК связывающие свойства большинства Hox белков очень сходны, это делает концептуально неясным, как HD могут обеспечивать функциональную специфичность. Тем не менее, ранние функциональные исследования на Drosophila показали, что HD может, в самом деле, наделять отличающимися функциональными свойствами in vivo индивидуальные Hox белки (Lin и McGinnis, 1992; Zeng et al., 1993).

Zhao и Potter (2001, 2002) исследовали, может ли HD специфицировать Hox функции у позвоночных. Hoxa11 HD был замешен на таковой из Hoxa4, Hoxa10 или Hoxd13, используя knock-in стратегию. Пространный анализ мышей, несущих HD-swapped аллели, показал разнообразные фенотипические альтерации, в целом указывающие, что HD, в самом деле, имеет отношение к функциональной специфичности Hox у позвоночных. Однако, эта специфичность, по-видимому, ограничена определенными тканями и, что удивительно, не обнаруживается дефектов в осевом скелете таких HD-swapped мутантов, подтверждая, что свойства формирования осевого паттерна Hox белков могут располагаться вне HD. Сходный вывод получен в трансгенных экспериментах с использованием химерных Hox белков (Sreenath et al., 1996). Hoxa4 и Hoxc8 демонстрируют отличающиеся функциональные свойства, т.к. они супрессируют или индуцируют рост рёбер в шейной области трансгенных мышей, если оба экспрессируются под контролем Hoxa4 промотора. Когда была проанализирована активность химерного Hoxa4 белка, содержащего Hoxc8 HD, то соотв. трансгенные мыши обладали Hoxa4 фенотипом, хотя и с слегка более слабым проявлением (Sreenath et al., 1996). Следовательно, хотя доступные данные всё ещё ограничены, очевидно, что функциональная специфичность Hox в формировании паттерна осевого скелета в основном зависит от последовательностей вне HD.

Hexapeptide

Генетические и молекулярные исследования на Drosophila привели к идентификации дополнительного консервативного мотива, играющего фундаментальную роль в некоторых аспектах как активности Hox генов, так и функциональной специфичности. Этот мотив, наз. hexapeptide (HX), располагается N-терминальнее по отношению к HD, которго он отделен последовательностью, известной как линкерная область (Fig. 2A). Интересно, что длина линкерной области является специфичной для паралогов свойством Hox белков, это привело к предположению, что он также может играть роль в специфичности Hox (rev. der Rieden et al., 2004). Однако, пока нет экспериментальных доказательств, что линкерный регион вносит вклад в функциональную специфичность Hox белков позвоночных. Figure 2.

HX содержит стержневую последовательность (YPWM), в центре которой остаток триптофана, который является критическим для его функции. У Drosophila, активность HX оказалась в основном связана с его взаимодействиями с Exd, который увеличивает специфичность и сродство связывания Hox белков с их ДНК последовательностями мишенями (rev. Laurent et al., 2008; Mann et al., 2009). Этот мотив всегда присутствует в Hox белках пз от PGs 1 до 8, подтверждая, что он β выполнять важную роль в функции Hox белков позвоночных. Сходным образом, с тем, что описано у Drosophila, HX Hox белков позвоночных, по-видимому, предоставляет поверхность для взаимодействия с Exd гомологами позвоночных, Pbx белками (rev. Moens и Selleri, 2006). Биохимические исследования взаимодействий Hox/Pbx у позвоночных показали, что они следуют тому же самому правилу, который характерен для их аналогов у Drosophila, включая потребность в законсервированном триптофане в Hox HX (Neuteboom et al., 1995). Следовательно, димеризация с Pbx белками может быть важным детерминантом функциональной специфичности Hox белков позвоночных (Fig. 2B).

Анализ Pbx мутантных мышей подтвердил, что эти белки, в самом деле, могут играть роль в активности Hox генов. Pbx1 мутантные мыши обнаруживают альтерации осевого скелета, которые могут быть интерпретированы как комбинации Hox мутантных фенотипов (Selleri et al., 2001). Дальнейший анализ, включая инактивацию компаундов из членов семейства Pbx, показал присутствие значительной функциональной перекрываемости среди членов семейства в разных тканях. Интересно, что Pbx1/Pbx2 двойные мутанты содержат сильные дефекты в осевом скелете, включая уменьшенные размеры рёбер, подтверждая, что Pbx белки могут быть необходимы для свойств, способствующих образованию ребер, Hox белков (Capellini et al., 2008), хотя эта возможность пока не исследована. Необходимо отметить, однако, что у эмбрионов позвоночных взаимоотношения между Pbx и Hox генами могут не ограничиваться прямыми взаимодействиями белков, как это имеет место в зачатках конечностей, где гены Pbx, по-видимому, необходимы для активации экспрессии Hox генов (Capellini et al.,2006).

Хотя некоторые уродства, наблюдаемые у Pbx мутантов могут быть объяснены альтерациями в активности Hox генов, сложность Pbx мутантных фенотипов не позволяет четко дифференцировать между Hox-зависимой и Hox-независимой функциями Pbx генов. Чтобы решить эту проблему, были получены мутантные мыши, чтобы продуцировать специфические Hox белки, содержащие нефункциональный HX. Мыши, несущие мутации в Hoxb8 HX обнаруживали гомеотические трансформации, затрагивающие грудную клетку (Medina-Martinez и Ramirez-Solis, 2003). Эти дефекты напоминают те, что обнаруживаются в верхней части торакальной грудной клетки у Hoxb8 нулевых мышей (van den Akker et al., 1999), подтверждая, что Hoxb8 нуждается в связывании Pbx кофакторов для своей нормальной функции. Однако, эти мыши также обнаруживают фенотипические характеристики в своем осевом скелете, напоминающие некоторые характерные признаки мутаций потери функции в Hoxa7, Hoxb7 и Hoxb9, при отсутствии каких-либо очевидных эффектов на их экспрессию (Medina-Martinez и Ramirez-Solis, 2003). Это указывает на то, что взаимодействие с Pbx может быть необходимо для тонкой настройки связывающих свойств Hoxb8, что способствует регуляции его физиологических мишеней и предупреждению взаимодействий с сайтами ДНК мишеней др.близко родственных Hox белков. Законность этой гипотезы in vivo необходимо тестировать непосредственно. Сходный генетический подход показал, что нормальная активность Hoxa1 в заднем мозге и нервном гребне нуждается в интактном HX (Remacle et al., 2004). Принимая во внимание фенотипы, описанные для Hoxb8, важно понять, приобретает ли лишенный HX Hoxa1 белок также доминантные негативные функции на активность др. Hox белков.

Генетические и молекулярные исследования на Drosophila показали, что Exd/Hox комплекс часто связан с дополнительным партнером, Hth, чтобы сформировать функциональный тримерный комплекс на специфических ДНК мишенях (Ryoo et al., 1999; Ebner et al., 2005). У позвоночных имеется несколько Hth гомологов, Meis и Prep белки, которые способны также формировать не геротримерные комплексы с Hox и Pbx белками (Berthelsen et al., 1998; Jacobs et al., 1999; Schnabel et al., 2000), подтверждая потенциальную роль Meis/Prep кофакторов в модуляции функции Hox белков позвоночных. Недавно было также показано, что Meis белки могут способствовать независимым от HX взаимодействиям между большим количеством мушиных и мышиных Hox белков и Exd/Pbx (Hudry et al., 2012). Эти исследования также подтвердили, что присутствие Meis Hox/Pbx взаимодействий не всегда сопровождает классические механизмы и необходимо дальнейшее подтверждение идеи, что Meis кофакторы могут вносить вклад в специфичность функции. Случается ли это на самом деле, всё ещё предмет споров в основном из-за мутантных фенотипов Meis1 или Prep1, которые не обладают большинством общих фенотипических признаков с Hox мутантными мышами (Hisa et al., 2004; Ferretti et al.,2006). Несмотря на это всё ещё возможно, что функции Meis1/Prep1 перекрываются избыточной активностью др. членов этого семейства.

Divergent hexapeptide

Hox белки из PGs 9 - 13 не содержат канонического HX мотива. Однако, HoxPG9 и HoxPG10 белки имеют законсервированный для этих групп паралогов мотив по соседству с HD с некоторым структурным и функциональным сходством с HX (Fig. 2A). В частности, эти мотивы содержат консервативный триптофан, расположенный N-терминальне на 8 остатков от HD, который, согласно кристаллической структуре HoxA9-Pbx1, у3частвует во взаимодействиях Hox белка с Pbx1 (LaRonde-LeBlanc и Wolberger, 2003). Биохимический анализ показал, что мышиные Hoxb9 и Hoxa10 белки соединяются с ДНК совместно с Pbx1, давая паттерны, напоминающие те, что описаны для передних Hox белков (Shen et al., 1997). Интересно, что структурный анализ показал свойства HoxA9 связывать ДНК не меняются в присутствии Pbx1 в качестве кофактора (LaRonde-LeBlanc и Wolberger, 2003), поэтому вопрос, до какой степени может Pbx1 участвовать в функциональной тонкой настройке HoxPG9 (и может HoxPG10) белка по соединению со своими ДНК мишенями, как это предполагается для HX-содержащих Hox белков.

Функциональный анализ у трансгенных эмбрионов выявил, что дивергентный HX (NWLTAKS) в Hoxa10 необходим, но не достаточен, для активности Hoxa10, вызывающей образование рёбер (Guerreiro et al., 2012). Однако, неясно до какой степени активность NWLTAKS необходима для взаимодействия с Pbx белками. В частности, физиологическая ДНК мишень для Hoxa10, участвующая в функции репрессии ребер (Vinagre et al., 2010) не содержит Pbx1 связывающего мотива и Hoxa10/Pbx1 неспособен взаимодействовать in vitro, когда испытывается на этой ДНК мишени (Guerreiro et al.,2012).

Независимо от возможного участия Pbx1, кажется, что активность NWLTAKS нуждается в присутствии своего консервативного треонина и серина, поскольку когда они замещаются остатками аланина (NWLAAKA), то возникающий в результате Hoxa10 белок теряет активность по репрессии ребер у трансгенных мышей (Guerreiro et al., 2012). Этот результат подтверждает роль фосфорилирования в этом процессе. Контроль активности Hox генов с помощью фосфорилирования ранее был описан в дпр. биологическом контексте. У позвоночных активность HoxA9 и HoxA10 в гематопоэтической системе, как было установлено, регулируется с помощью фосфорилирования (Eklund et al., 2000, 2002; Vijapurkar et al., 2004). В обоих случаях фосфорилирование происходит по аминокислотам внутри HD и приводит сильной редукции способности белков связывать ДНК. Интересно, что Hoxa10 белок, несущий мутантный NWLAAKA мотив, также снижает свойство связывания ДНК, что зависит от фосфорилирования тех же самых остатков HD, которые контролируют активность Hoxa10 в миелоидных клетках (Guerreiro et al., 2012). Это подтверждает, что активность NWLTAKS частично обеспечивается посредством взаимодействий с белковым HD, что модулирует состояние фосфорилирования специфических остатков внутри HD. Однако, роль NWLTAKS для свойств по репрессии ребер Hoxa10 не ограничивается этим взаимодействием, поскольку блокирование фосфорилирования в HD ведет к очень сдержанному восстановлению свойств по репрессии ребер NWLAAKA-содержащего Hoxa10 белка (Fig. 2C) (Guerreiro et al., 2012).

Фосфорилирование, как было установлено, влияет на активность Hox у эмбрионов Drosophila (Jaffe et al., 1997; Berry и Gehring, 2000; Taghli-Lamallem et al.,2008), демонстрируя, что эта модификация может быть довольно распространенным регуляторным механизмом активности Hox белков. У мух наиболее изученным случаем является случай с сайтом фосфорилирования с помощью casein kinase II на C-терминальном конце Antp, которое, как было установлено, необходимо для субнабора белковых функций во время развития Drosophila (Jaffe et al., 1997). Интерсно, что этот мотив филогенетически консервативен у ортологов Hox белков (HoxPG6) позвоночных, подтверждая, что он может иметь функциональное значение для функции HoxPG6 белка.

Other relevant regions и motifs of Hox proteins

В дополнение к консервативным доменам и мотивам Hox белки содержат дополнительные последовательности варьирующих размеров как N-терминальнее, так и C-терминальнее HD. Имеется немного законсервированных регионов Hox белков, что делает их наиболее вероятно кандидатами, вносящими существенный вклад в функциональную специфичность белков. Проведено несколько исследований с использование in vitro систем, описавшими существование мотивов активации и репрессии вне HD, способных регулировать транскрипционную активность репортерных систем (Rambaldi et al., 1994; Zappavigna et al., 1994; Schnabel и Abate-Shen, 1996; Zhao et al., 1996; Vigan? et al., 1998). Однако, функциональное значение этих и др. регионов белков в регуляции физиологических процессов исследовали редко. Тем не менее было показано, что N- и C-терминальные регионы Hox белков являются ключевыми детерминантами функциональных результатов взаимодействий белков с данным регуляторным элементом у эмбрионов. Напр., в бранхиальных дугах и лицевой мезенхиме C-терминальный регион HoxPG2 белков необходим для репрессии экспрессии Six2, тогда как в нефрогенной мезенхиме HoxPG11 белки активируют Six2 с того же самого энхансера, необходимого для комбинированной активности его N- и C-терминальных регионов (Yallowitz et al., 2009). Равноценная дихотомия наблюдалась для активности Hoxb6 и Hoxa10 в регуляции развития ребер. Активность обоих Hox белков, по-видимому, включает взаимодействия с одним и тем же энхансером в гипаксиальном регуляторном регионе гена Myf5 (Vinagre et al., 2010). Однако, функциональные результаты обоих взаимодействий противоположны, при этом Hoxb6 активирует, а Hoxa10 замалчивает активность энхансера. Обнаружение, что N-терминальная часть Hoxa10 существенна для его функции в репрессии ребер (Guerreiro et al., 2012) указывает, что этот регион белка д. содержать функциональную сигнатуру, управляющую Hoxa10-специфическими эффектами на белковые взаимодействия с энхансером. Верно ли это и для Hoxb6 нуждается в экспериментальном подтверждении.

Проявления нарушений, вызываемых мутациями в N-терминальном регионе Hox белков также указывают на их важность в регуляции функции Hox. В частности, уродства конечностей и гениталий возникают за счет экспансии poly-alanine мотива, расположенного в N-терминальных регионах HoxA13 и HoxD13 (Goodman et al., 1997; Utsch et al., 2002).

Идентификация функционально важных областей внутри N- и C-терминальных регионов Hox белков осложняется типичным отсутствием распознаваемых мотивов белков и действительным отсутствием структурной информации об эт их регионах, особенно N-терминальных регионов. В некоторых случаях помогают идентификации соотв. домены, когда два вида содержат функционально отличающиеся версии того же самого Hox белка. Напр., случай идентификации активности, репрессирующей образование ног, в C-терминальном конце Drosophila Ubx, который лишен белка от Artemia (Galant и Carroll, 2002; Ronshaugen et al.,2002). Однако, такие эксперименты довольно редки. Альтернативным подходом является использование преимуществ сильного перекрывания среди членов PG и поиск специфичных для групп сигнатур в последовательностях. Этот подход был использован для HoxPG10 белков и привел к идентификации NWLTAKS мотива в качестве функционального компонента Hoxa10 активности по репрессии ребер (Guerreiro et al., 2012). Др. регионы также были описаны, как общие для всех HoxPG10 белков, которые оказались настоящими кандидатами на участие в общераспространенной активности этой группы паралогов (Guerreiro et al., 2012), хотя прямого доказательства функционального веса большинства из этих регионов всё ещё отсутствуют.

More Pieces to the Hox Puzzle: Other Potential Hox Cofactors

Широкое разнообразие функций, выполняемых Hox белками указывает на то. что спектр их взаимодействий, скорее всего, намного шире, чем классические Hox/Pbx/Meis комплексы. Возможно, что современные попытки выявить природные мишени для Hox белков всё ещё открывают некоторые физиологические Hox-регулируемые энхансеры, чьи последовательности предоставляют информацию о характеристиках дополнительных Hox кофакторов.

Как упоминалось выше, Hoxa10 и Hoxb6 регулируют развитие ребер, контролируя активность дистального энхансера гена Myf5 (Vinagre et al.,2010). Этот энхансер, известный как H1 (Buchberger et al., 2007), регулируется также с помощью Pax3 и Six1/4 (Bajard et al., 2006; Giordani et al., 2007). Сайты связывания Pax и Hox перекрываются внутри этого энхансера, подтверждая возможное функциональное взаимодействие между Pax3 и Hox белками. Недавний биохим. анализ показал, что Hoxb6, но не Hoxa10, в самом деле соединяется кооперативно с Pax3 на H1 энхансере in vitro (Guerreiro et al., 2013), показывая, что Pax3 может быть важным кофактором для обеспечения функциональной специфичности белкам HoxPG6 (Guerreiro et al., 2013). Интерсно, что взаимодействия между Hox и Pax белками были также описаны для др. членов этого семейства в разных биологических контекстах, у мышей и Drosophila (Gong et al., 2007; Plaza et al.,2008), указывая тем самым, что Pax белки могут быть более распространенным кофактором Hox белков, чем это считалось. Довольно удивительно, активность Hoxb6, способствующая образовании ребер, по-видимому, не зависит от его способности соединяться с ДНК (Guerreiro et al.,2013) и может поэтому обеспечиваться посредством его взаимодействия с Pax3 (Fig. 2D). Сходная функциональная независимость от связывания ДНК уже была описана для др. Hox белков позвоночных (Zappavigna et al., 1994; Williams et al., 2005a, 2005b). Напр., исследования культивируемых клеток показали, что мутантные HoxPG13 белки неспособны связывать ДНК, сохраняя способность модулировать транскрипцию посредством взаимодействий с кофакторами (Williams et al., 2005a, 2005b). Необходимы дополнительные исследования для установления этого необычного способа действия Hox и для определения, действительно ли он может составлять дополнительный механизм, обеспечивающий функциональную специфичность Hox белков.

Анализ др. функционального регулирующего Hox энхансера привел к идентификации Deformed Epidermal Autoregulatory Factor-1 (Deaf-1) в качестве потенциального кофактора Drosophila Hox белка Dfd в контроле Dfd-чувствительных элементов (Gross и McGinnis, 1996). Интересно, что фенотипические аномалии, обнаруживаемые у Deaf-1 мутантных мышей включают трансформации шейных сегментов в грудную клетку, которые могут быть результатом аномальной активности Hox генов (Hahm et al., 2004). Возможно также, что Deaf-1 действует как партнер для Hox белка, хотя всё ещё неясно, взаимодействуют ли физически эти белки др. с др. Возможно, взаимодействие Hox/Deaf-1 нуждается в сигналах от дополнительных факторов. В частности, Deaf-1 был идентифицирован как партнер Lmo4 (Sugihara et al., 1998). LIM-only (LMO) белки являются транскрипционными факторами, которые, по-видимому, участвуют в сборке мультибелковых комплексов благодаря предоставлению мест стыковки для др. факторов (rev. Rabbitts, 1998). Находка, что целенаправленная делеция Lmo4 у мышей вызывает дефекты скелета в грудной клетке и шейных позвонках, сходных с теми, что наблюдаются у Deaf-1 мышей, подтверждает, что Lmo4 и Deaf-1 могут оба быть частью мультибелкового комплекса, регулирующего активность Hox белков во время формирования паттерна осевого скелета. Однако, пока это не было подтверждено.

CONCLUDING REMARKS

Over the past decades, significant advances have been made in our understanding of how the activity of the different Hox genes generate precise species-specific patterns in the axial skeleton. However, several important questions remain unanswered. In particular, the mechanistic и molecular control of the precise timing of Hox gene activation at early embryonic stages is only starting to be understood. In this review, we have discussed experimental evidence that support the notion that this control is essential for the establishment of AP positional information и subsequent specification of different vertebral identities. In addition, several studies suggest that changes in the timing of Hox activation may be a key driving force in the evolutionary diversification of the vertebrate body plan, which further reinforces the functional relevance of such a control и the need to understand it. It has been suggested that the temporal collinear activation of Hox genes could have been a major evolutionary constraint maintaining the clustered organization of Hox genes in the genome of organisms that develop through progressive addition of embryonic tissue to caudal regions (Monteiro и Ferrier, 2006). In fact, taking into account its synchronization with morphogenetic movements during gastrulation и the somitogenesis clock in these organisms, temporal control of Hox gene activation could prevent posterior Hox genes from being expressed too early in the embryo, in cells fated to produce more anterior vertebral structures, which would be crucial for correct embryonic development и AP patterning.

In recent years, a potential functional role for the chromatin in the regulation of the temporal activation of Hox genes in epiblast cells has been uncovered. In particular, several studies have revealed a significant correlation between specific histone modifications, nuclear organization и timing of Hox gene activation. At present, this evidence is exciting but merely correlative, и future experiments should evaluate и further dissect the functional contribution of these experimental observations for the Hox clock и ultimately to the patterning of the axial skeleton.

As for the Hox proteins, very little is known about the details of their activity as transcription factors controlling specific regulatory programs. The Hox paradox, illustrated by the high in vivo functional specificity of Hox proteins, compared with their very similar ДНК binding affinities in vitro, is only partially resolved. It is commonly thought that interactions with cofactors contribute to Hox specificity of action. So far, the known Hox cofactors fall short to provide a comprehensive explanation for the diversity of patterns produced by the different Hox proteins, often in the same tissues. Clearly, future investigations aiming at identifying additional Hox partners и analyzing the way they interact with и modulate Hox function will lead to a better understanding of the crucial roles played by Hox genes in the development и evolution of the axial skeleton. In addition, considering the high functional redundancy observed among PG members, it is possible that the identification и characterization of HoxPG-specific motifs will help to understand the mechanisms that provide functional specificity to Hox proteins. These signatures are likely to be involved in interactions with other molecules, including those controlling specific post-translational modifications potentially contributing to the control of Hox specific functions.

In the past years, we have witnessed substantial increase in the ways gene activity can be regulated. In this review, we have discussed the impact that miRNAs or quantitative parameters in the synthesis of ribosomal proteins have on fine tuning the production of Hox gene products. Many other non classical forms of gene regulation will surely be found to also play relevant roles in Hox-mediated patterning processes. It is possible that as we gain deeper knowledge about the full complexity of the mechanisms controlling Hox gene expression и activity, many of the still nonanswered questions и open debates about how the combined activity of the different Hox genes is translated into precisely built morphological structures will be finally solved.

Controlling Hox gene expression and activity to build the vertebrate axial skeleton Ana Casaca, Ana Cristina Santos, Moises Mallo Developmental Dynamics 243:24–36, 2014.

Controlling Hox gene expression and activity to build the vertebrate axial skeleton
Ana Casaca, Ana Cristina Santos, Moises Mallo
Developmental Dynamics 243:24–36, 2014.