Установлено, что β1 интегриновые рецепторы регулируют множественные функции, обеспечивающие клеточную адгезию, миграцию, дифференцировку, рост и жизнеспособность (Giancotti and Ruoslahti, 1999; Liddington and Ginsberg, 2002; Wang et al., 1998). Мы получили доказательства критической роли β1 интегриновой субъединицы в экспансии in vivo панкреатических β-клеток вследствие их эндокринной спецификации. Наши результаты показали, что 'pro-proliferative' передача сигналов, передаваемых с помощью β1 интегринов в панкреатических β-клетках не зависит от 'pro-differentiative' сигналов, относящихся к рецепторам к др. типов клеток, подтвержая, альтернативные интегрины и рецепторы межклеточной адгезии, скорее всего, ответственны за обеспечение взаимодействия β-клеток с их внеклеточным окружением и с соседними клетками и за регуляцию поддержания их дифференцированного эндокринного фенотипа.

Сигнальные свойства интегриновых рецепторов диктуются прежде всего их состоянием активации в результате оккупации лигандами ECM и/или цис-трансактивации а результате взаимодействия рецепторами факторов роста, обладающими тирозин киназными функциями, скорее, чем их уровнями экспрессии (Fujita et al., 2013; Giancotti and Ruoslahti, 1999; Ju and Zhou, 2013; Liddington and Ginsberg, 2002; Margadant et al., 2011; McCall-Culbreath et al., 2008; Mitra et al., 2011; Wang et al., 1998). Не смотря на это, резонно сделать вывод, что уровни экспрессии β1 integrin, обнаруживаемые в разных панкреатических эпителиальных типах клеток, коррелируют с пролиферативной способностью, специфичной для типов клеток. Соотв., клетки протоков, экспрессирующие высокие уровни β1 integrin, обнаруживают высокую склонность отвечать на митогенные стимулы, чем клетки островков и ацинарные клетки (Beattie et al., 1999; De Lisle and Logsdon, 1990; Githens et al., 1994; Means et al., 2005; Rooman et al., 2000).Напротив, ацинарные клетки, которые, как было установлено, экспрессируют низкие уровни β1 неспособны подвергаться существенной пролиферации, несмотря на то, что они вступают в acinar-to-ductal трансдифференцировку (Fukuda et al., 2012; Kopp et al., 2012; Reichert et al., 2013). Островковые клетки, как было установлено, подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу, когда реплицируются (Kaido et al., 2010; Montgomery and Yebra, 2011), феномен, который приписывается многим типам эпителиальных клеток и который связан с существенным усилением активации β1 integrin (Lim and Thiery, 2012; Yeh et al., 2010). Это предоставляет возможный механизм, с помощью которого клетки, готовые к вступлению в клеточный цикл, могут увеличивать свою склонность к использованию этой интегриновой субъединицы отвечать на сигналы микросреды и активировать про-пролиферативные сигнальные каскады.

Вследствие их эндокринной спецификации и экспрессии инсулина панкреатические β-клетки вступают в регулируемую в пространсте и времени экспансию, которая стартует и становится очевидной на ст. ~E17.5, продолжает возрастать во время последней недели эмбриональной жизни, достигает плато во время первых 2 недель постнатальной жизни (Georgia and Bhushan, 2006; Georgia et al., 2006), и после этого постепенно снижается (Dhawan et al., 2009; Teta et al., 2005; Tschen et al., 2009). Базируясь на этой хорошо определенной временной линии развития массы островковых клеток и на становлении про-пролиферативной функции β1 integrin, описанной в др. эпителиях, наши находки, что RIP-Cre/β1KO мыши обладают достоверно уменьшенными количествами β-клеток, позволяет нам утверждать, что устранение β1 integrin в β-клетках может негативно влиять на их репликацию и/или жизнеспособность. Соотв., наш анализ RIP-Cre/β1KO в поджелудочной железе показал, что частота пролиферации β-клеток достоверно снижена уже на ст. E17.5, дефект, который становится даже более драматическим во время первой недели постнатальной жизни и у взрослых мышей. Этот дефект пролиферации ведет к тяжёлому снижению количества β-клеток в поджелудочной железе RIP-Cre/β1KO взрослых по сравнению с мышами дикого типа. Эти результаты чётко демонстрируют, что β1 integrin действует как критический позитивный регулятор экспансии β-клеток во время развития и постнатальной жизни.

Детальный фенотипический анализ β-клеток у RIP-Cre/β1KO мышей показал, что несмотря на дефекты клеточной адгезии с fibronectin и коллагеном типа IV, они сохраняют все существенные характеристики эндокринной дифференцировки, нормальную архитектурную организацию внутри кластеров островков и стимулируемую глюкозой секреторную функцию. Соотв., мы установили, что паттерн экспрессии транскрипционных факторов PDX1, PAX6, NKX6.1 и MAFA, по-видимому, неотличим от такового в β-клетках дикого типа. Интересно, что содержание инсулина в β-клетках от RIP-Cre/β1KO fsitq увеличивается трехкратно, подтверждая. что поддержание эндокринной дифференцировки может регулироваться с помощью альтернативных механизмов межклеточных и/или клетка-матрикс взаимодействий. Так, мы установили, что экспрессия канонических cadherins Cdh1 и Cdh2 (E-cadherin и N-cadherin), которые являются главными рецепторами адгезии, ответственными за межклеточную агрегацию клеток островков (Rouiller et al., 1991; Dahl et al., 1996), не изменена в β-клетках от RIP-Cre/β1KO, это подтверждает, что их функция, способствующая дифференцировке, сохраняется в отсутствие β1 integrin.

Предыдущие работы предполагали, что laminins, продуцируемые эндотелиальными клетками, играют важную роль в регуляции экспрессии гена инсулина и что блокада β1 integrin laminin рецепторов в β-клетках вмешивается в секрецию инсулина (Bosco et al., 2000; Nikolova et al., 2006; Parnaud et al., 2006). В отличие от этих более ранних исследованиё in vitro, мы установили, что генетическое устранение β1 integrin в β-cells in vivo не влияет на их продукцию инсулина или секрецию его в ответ на глюкозу. Эти результаты подтверждают, что в отсутствие β1 integrin, β-клетки могут активировать альтернативные механизмы распознавания ECM, которые поддерживают их эндокринный фенотип и функцию. Следовательно, наши находки могут быть объяснены тем фактом, что клетки панкреатических островков экспрессируют не только β1, но и также ?3, ?4 and ?5 интегрины (Cirulli et al., 2000; Kaido et al., 2004a; Kaido et al., 2004b; Kaido et al., 2006; Kaido et al., 2010; Riopel et al., 2011; Saleem et al., 2009; Yebra et al., 2011; Yebra et al., 2003). Эти интегрины могут обеспечивать альтернативные механизмы клетка-матрикс распознавания и могут вносить вклад и трансдуцировать сигналы, способствующие дифференцировке, делающие возможным развитие и функциональное созревание β-клеток. В подтверждение возможной компенсаторной функции этих альтернативных интегринов имеются доказательства, что β3 и β5 integrins (т.e. αvβ3 and αvβ5) обеспечивают ряд функций, в пределах от стационарной клеточной адгезии до подвижности и инвазии, а также клеточной пролиферации и дифференцировки, в зависимости от клеточного контекста. Кроме того, было продемонстрировано, что β1, β3 и β5 интегрины характеризуются реципрокными регуляторными перекрестными взаимодействиями на транскрипционном, трансляционном и пост-трансляционном уровнях, так что значительные β3 и/или β5 компенсаторные функции могут проявляться, когда β1 или блокирован или генетически устранен, приводя в результате к поддержанию или усилению програм клеточной дифференцировки (Brunetta et al., 2012; Guan et al., 2001; Hirsch et al., 1998; Jeanes et al., 2012; Retta et al., 1998). Дальнейшим подтверждением компенсаторной функции с помощью альтернативных интегринов является β4 субъединица, партнер α6 чтобы сформировать α6β4 laminin 5 рецептор, подтверждающая многообразие сигнальных путей в зависимости от клеточного контекста и комплекта др. адгезивных рецепторов (Dowling et al., 1996; Giancotti and Ruoslahti, 1999; Giancotti et al., 1992; Niessen et al., 1996; Sonnenberg et al., 1991; van der Neut et al., 1999; van der Neut et al., 1996; Xia et al., 1996; Yebra et al., 2003). Наш геномный массив Illumina показал, что β-клетки от RIP-Cre/β1KO мышей обнаруживают достоверное усиление активности компонентов ECM, таких как vitronectin (Vtn) и laminin 5 β-chain (Lamb3), которые выступают в качестве лигандов для αvβ3 and α6β4, соотв. Среди др. генов, усиливающих свою активность в β-клетках в результате делеции β1 integrin, находятся и те, которые кодируют netrin 1 и netrin 4 (Ntn1 и Ntn4), два белка, которые обладают существенной гомологией с ламининами, и которые, как было установлено, экспрессируются в развивающейся поджелудочной железе в разных клеточных компартментах, где они поддерживают клеточную адгезию, миграцию и эндокринную дифференцировку (Cirulli and Yebra, 2007; Yebra et al., 2011; Yebra et al., 2003). Исходя из доказательств, демонстрирующих, что netrins могут также вносить вклад в передачу сигналов, которые поддерживают жизнеспособность β-клеток (Yang et al., 2011), вполне возможно. что устранение β1 integrin может запускать контр-регуляторные механизмы, которые защищают β-клетки от апоптоза.

Помимо регуляционных механизмов адгезии клетка-матрикс (Hynes, 2002; Vuori, 1998), β1 integrins, как было установлено, играют важную роль в сборке и гомеостазе базальных мембран (Ruoslahti, 1996), которые являются тонкими белковыми слоями, представленными сетеобразной макромолекулярной организацией компонентов ECM, с которыми слипаются клетки и используют в качестве сигнальных платформ во время развития и постнатальной жизни (Cheng et al., 1997; Martin and Timpl, 1987; Yurchenco and Wadsworth, 2004). Экспериментальные доказательства показали, что делеция β1 интегринов негативно влияет на сборку и функцию базальных мембран, которые в свою очередь могут изменять прикрепление клеток, клеточный фенотип и функцию (Aumailley et al., 2000; Sasaki et al., 1998). Неожиданно, мы установили, что устранение β1 integrins в β-клетках не оказывает влияния на целостность и ультраструктурный вид базальных мембран, которые обнаруживаются на сторонах между эндотелиальными клетками и β-клетками. Некоторые конкурентные механизмы могут быть привлечены для объяснения этих находок. Напр., β-клетки от RIP-Cre/β1KO мышей экспрессируют и усиливают активность ряда базовых компонентов мембран, такие как laminin 5 β-chain (Lamb3), netrin 1 и netrin 4 (Ntn1 and Ntn4), и добавочные ECM белки (напр. Vtn) (Fig. 7). Исходя из реципрокной способности laminins и netrins к самосборке в сети, похожие на базальные мембраны (Cheng et al., 1997; Yurchenco and Wadsworth, 2004), вполне возможно, что в отсутствие β1 integrin-обеспечиваемого механизма сборки базальных мембран, наблюдаемое усиление активности Lamb3 цепи и netrins в наших RIP-Cre/β1KO β-клетках, может быть обусловлено компенсаторными механизмами, восстанавливающими архитектуру базальных мембран. Дальнейшим подтверждением этой возможности является наблюдение, что RIP-Cre/β1KO β-клетки также обнаруживают повышенные уровни транскрипции изоформ коллагена Col6a1, Col7a1 и Col8a1, которые, как известно, участвуют в сборке и архитектурной целостности базальных мембран (Gelse et al., 2003; van der Rest and Garrone, 1991). Альтернативно, возможно, что сборка компонентов ECM в функциональные базальные мембраны обеспечивается с помощью альтернативных интегриновых субъединиц, экспрессирующихся в β-клетках, напр., β3, β5 или β4)? или с помощью не интегриновых рецепторов ECM, таких как DDR1 и DDR2 (Vogel et al., 1997), которые, как было установлено, существенно усиливаются в β-клетках RIP-Cre/β1KO мышей. Наконец, эндотелиальные клетки, экспрессирующие высокие уровни интегриновых рецепторов β1, в дополнение к β3, β5 и β4, как известно, также вносят вклад в биосинтез и сборку базальных мембран и могут помочь в смягчении возможных дефектов, вызываемых делецией β1 integrin в соседних β-клетках. Итак, наши наблюдения демонстрируют динамическую адаптацию β-клеток к потере функции β1 integrin, чтобы продуцировать базальные мембраны и островки (Otonkoski et al., 2008; Virtanen et al., 2008), показывая, что биосинтез функциональных базальных мембран внутри кластеров островков обеспечивается не только эндотелиальными клетками, как это предполагалось ранее (Nikolova et al., 2006), но и также β-клетками (Fig. 7).

Поддержание клеточной дифференцировки постоянно сбалансировано с помощью механизмов, регулирующих пролиферацию. Это достигается путем взаимодействия между позитивными и негативными регуляторами клеточного цикла, которые контролируются с помощью клеточно-автономных и не автономных механизмов экспрессии генов (Georgia and Bhushan, 2006; Georgia et al., 2006; Miller et al., 2007). Интегрины предоставляют пример мультимодальных рецепторов, которые в зависимости от их αβ гетеродимерной композиции, могут функционировать как высоко специализированные трансдукторы внеклеточных сигналов, способных активировать сигнальные пути снаружи-внутрь, влияя в конечном счете на принятие клеточных решений. Наши эксперименты четко демонстрируют, как устранение β1 integrin в β-клетках может драматически изменить их способность отвечать на ростовые стимулы, предоставляемые ECMs и ростовыми факторами in vivo и in vitro. Т.о., наш анализ показал, что в то время как позитивные регуляторы клеточного цикла подавляются, гены, которые предупреждают или мешают репликации клеток и тем самым способствуют дифференцировке, усиливают свою активность (Fig. 7). Усиление активности генов, способствующих аресту клеточного цикла, может быть объяснено с помощью механизмов дерепрессии, запускаемых в результате устранения β1 integrin, тогда как усиление активности генов, поддерживающих ход клеточного цикла, может отражать попытку преодолеть дефект пролиферации, вызываемый потерей передачи сигналов β1 integrin. Соотв., потеря передачи сигналов β1 integrin поддерживается с помощью наблюдаемого подавления некоторых циклинов или cyclin kinases, а также активности MAPK, которые, как известно, являются нижестоящими эффекторами передачи сигналов β1 integrin (Chiang et al., 2011; D'Amico et al., 2000; El Azreq et al., 2012; Saleem et al., 2009; Velling et al., 2004). Также интересно подавление Ovol2 и Tuba1. Подавление Ovol2, как было установлено, мешает активности c-MYC и NOTCH1, вызывая тем самым арест клеточного цикла в G1/G0 фазе (Wells et al., 2009). Сходным образом, блокада α-tubulin, как известно, ингибирует накопление cyclin B и активацию ERK2, приводя к аресту в интерфазе (Vee et al., 2001). ERK и AKTиз непосредственно регулируются с помощью интегринов (Saleem et al., 2009; Velling et al., 2004), а их активность, как было установлено, регулирует пролиферацию и жизнеспособность клеток (Chambard et al., 2007; Lawlor and Alessi, 2001). Следовательно, снижение активации путей ERK и AKT может негативно повлиять на регуляцию транскрипции cyclin D1. Исходя из доказательств, что c-MYC, NOTCH1 и ERK2 регулируются с помощью активации β1 integrin, наши результаты подтверждают, что Ovol2 и Tuba1 могут действовать как новые эффекторы использования β1 integrin в экспансии островковых β-клеток.

Collectively, our studies demonstrate that, in the absence of β1 integrins, pancreatic β-cells fail to activate the signaling machinery that would otherwise lead to their expansion during development and in postnatal life. Although loss of β1 integrin-mediated outside-in signaling renders β-cells unresponsive to the extracellular cues that would normally elicit their expansion for the establishment of a normal baseline β-cell mass, this defect does not affect the state of differentiation nor the secretory function of this endocrine cell population