Результаты данного исследования показали, что общий объем мочевого пузыря увеличивается во время развития, процент уротелия остается постоянным, тогда как процент lamina propria снижается в ответ на прогрессивную дифференцировку гладкой мышцы detrusor из периферической мезенхимы. Развитие гладкой мышцы detrusor инициируется в своде мочевого пузыря и прогрессивно распространяется в направлении шейки мочевого пузыря, при этом ведущий край дифференцировки расширяется на правую заднюю поверхность мочевого пузыря. Хотя значение этого наблюдения ещё предстоит определить, интересно, что это происходит бок о бок с правой пупочной артерией. Морфометрический анализ также показывает, что на ст. E13 мочевой пузырь самок обнаруживает больше гладких мышц, чем таковой у самцов, подтверждая, что могут существовать зависимые от пола различия в раннем развитии мочевого пузыря. Это первое сообщение, представляющее это наблюдение и предоставляющее доказательств, что развитие мочевого пузыря прогрессирует в определенном краниально-каудальном паттерне с потенциальными пол-специфическими различиями в развитии гладких мышц.

Гладкие мышцы detrusor оказываются полностью сформированными приблизительно на ст. E15, после чего они утолщаются, создавая определенную восьмигранную морфологию в позднем эмбриогенезе. Дифференцированные гладкомышечные клетки внутри эмбрионального мочевого пузыря появляются в виде независимых мышечных пучков, которые легко перемешиваются, когда они прогрессивно дифференцируются в стенку мочевого пузыря. Во время этих ранних стадий развития классически определяемые в зрелом мочевом пузыре как внутренние продольные, средние циркулярные и наружные продольные ещё не обнаруживаются. Это наблюдение находятся в резком контрасте с развитием желудочно-кишечных гладких мышц, где наблюдается сильно срежиссированная и последовательная дифференцировка отдельных слоёв гладких мышц во время эмбриогенеза (McHugh,1995,1996).

Первоначальное появление самостоятельных слоёв гладких мышц происходит во время постнатального развития мочевого пузыря, указывая тем самым, что существенное ремоделирование дифференцировки гладких мышц происходит после рождения. Наше исследование легко идентифицировало внутренний продольный и срединный циркулярный слой гладких мышц в постнатальный период и у взрослых животных, хотя отдельный наружный продольный слой обнаружить нелегко. Это наблюдение согласуется с предыдущим исследованием, которое показало, что наружный продольный слой гладких мышц неполный и обнаруживатся преимущественно вдоль передней и задней стенки мочевого пузыря (Hutch,1972). Сильно перемешанная и перекрывающаяся морфология гладких мышц detrusor, наблюдаемая в нашем исследовании, была идентичной с той, что описана Hutch (1972), и, по-видимому, хорошо приспособлена, чтобы продуцировать скоординированные радиальные сокращения, необходимые для мочеиспускания.

Классическое гистологическое описание развивающегося мочевого пузыря часто описывает развитие гладких мышц detrusor как прямое продолжение дифференцировки гладких мышц мочеточников в урогенитальный синус (Copenhaver et al.,1978). Наше исследование четко продемонстрировало, что дифференцировки гладких мышц мочевого пузыря инициируется независимо в своде мочевого пузыря около ст. E13, т.е. задолго до появления гладкомышечных клеток в дистальных частях мочеточников на ст. E15. Это наблюдение согласуется с недавним молекулярным исследованием, которое четко продемонстрировало, чт о дифференцировка гладких мышц мочеточников и мочевого пузыря независимые онтогенетические события, модулируемые разными молекулярными путями (Airik et al.,2006,2010; Airik and Kispert,2007).

mgb^-/- мыши обладают трансгеном индуцированной мутацией, которая приводит к дефекту развития гладких мышц detrusor (Singh et al.,2007). Морфометрический анализ подтвердил, что первичный дефект, обнаруживаемый в mgb^-/- мочевом пузыре, заключается в драматическом уменьшении дифференцировки гладких мышц, наблюдаемом в ходе всего развития. Интересно, что формирование временного и пространственного паттерна гладких мышц mgb^-/- detrusor выглядит довольно нормальным даже перед лицом драматического уменьшения объема гладких мышц. Наблюдаемое увеличение и/или сохранение процента lamina propria, присутствующей в mgb^-/- мочевом пузыре подтверждает, что необходимые мезенхимные предшественники присутствуют, но неспособны собственно инициировать и поддерживать дифференцировку гладких мышц. Более ранние исследования подтверждают эту гипотезу и показывают, что на ст. E15 mgb^-/- мочевой пузырь обладает высокими уровнями апоптоза в мезенхимном компартменте, этот факт может объяснить прогрессивную потерю гладкомышечных клеток и уменьшение общего объема мочевого пузыря у этих животных (Singh et al.,2007). Эти результаты согласуются с предыдущими данными, показавшими, что формирование паттерна короткой оси нормально в mgb^-/- мочевом пузыре (Singh et al.,2007,2008).

Развитие зрелого и функционального мочевого тракта нуждается в точном временном и пространственном изменении порядка расположения мочевого пузыря, мочеточников и почек (Batourina et al.,2005; Mendelsohn,2009; Viana et al.,2007). Ключевая ступень в соединении верхнего и нижнего мочевого тракта происходит во время перестановки развивающихся мочеточников из Вольфовых протоков на заднюю поверхность урогенитального синуса. Этот процесс начинается приблизительно на ст. E11 у мышей и приводит в конечном итоге к образованию треугольника мочевого пузыря, треугольного региона стенки мочевого пузыря, который располагается между парными внутренними отверстиями мочеточников и внутренним отверстием мочеиспускательного канала. Морфометрический анализ показал, что вся треугольная область мочевого пузыря и периметр увеличиваются с определенными линейными скоростями во время развития. Оба параметра обнаруживают двухфазную реакцию во время развития с точкой изгиба, возникающей на ст. E16, когда у мышей начинается продукция и хранение мочи. Этот момент перемены также коррелирует с изменениями внутренней геометрии треугольника, наблюдаемой во время развития, демонстрируя тем самым. что функционирование мочевого пузыря играет ключевую роль в созревании внутреннего треугольника. Эти наблюдения согласуются с недавним исследованием и подтверждают, что временное и пространственное развитие треугольника мочевого пузыря может быть моделировано с помощью функциональных (т.e., растяжений и выделений мочевого пузыря), а также анатомических параметров (Batourina et al.,2005; Hains et al.,2008; Mackie et al.,1975; Mackie and Stephens,1975; Mendelsohn,2009; Oswald et al.,2004; Poladia et al.,2006; Radmayr et al.,2009; Schwentner et al.,2005; Viana et al.,2007).

Развитие VUR, как полагают, происходит с помощью нескольких механизмов, включая неправильное позиционирование мочеточников, альтерации длины внутривезикулярного туннеля и/или дисфункция нефизиологического сфинктера между мочеточником и пузырем (Hains et al.,2008; Mackie et al.,1975; Mackie and Stephens,1975; Mendelsohn,2009; Murawski and Gupta,2008; Murawski et al.,2011; Oswald et al.,2003,2004; Poladia et al.,2006; Radmayr et al.,2009; Schwentner et al.,2005,2006; Viana et al.,2007; Yu et al.,2004). Исследования подтвердили, что существует генетическая основа развития VUR и надавно были описаны несколько модельных животных (Atiyeh et al.,1992; Cohen and Kreiborg,1993; Grieshammer et al.,2004; Guarino et al.,2005; Hains et al.,2009; Jiang et al.,2004; Lu et al.,2007; Mendelsohn,2009; Murawski and Gupta,2008; Murawski et al.,2011; Nishimura et al.,1999; Passos-Bueno et al., 1999; Seyedzadeh et al.,2008; Yu et al.,2004). Мыши Fgfr2Mes^-/- были получены с помощью кондиционной делеции Fgfr2 в метанефрической мезенхиме развивающихся почек и они обнаруживают увеличенную длину общих почечных канальцев с краниальным смещением зачатков мочеточников, приводящим к развитию постнатального VUR (Hains et al.,2008,2009; Poladia et al.,2006). Морфометрический анализ показал, что правый, refluxing мочеточник Fgfr2Mes^-/- мышей расположен ниже, чем в контроле, что создает непосредственную структурную основу для нашего наблюдения, что отклонение от нормальной внутренней геометрии треугольника мочевого пузыря является наиболее убедительным параметром для идентификации Fgfr2Mes^-/- мочевого пузыря на ст. E15 и присутствия обратного заброса (reflux) на ст. P1 у Fgfr2Mes^-/- мышей. Сходные дефекты образования зачатков мочеточников наблюдались у некоторых др. модельных мышей с VUR, включая Pax2 1Neu± и Hoxb7/Ret± мышей (Yu et al.,2004; Murawski and Gupta,2008; Murawski et al.,2011). Однако эти животные обладали также укороченной длиной внутривезикулярного туннеля, ассоциированной с refluxing мочеточником, наблюдение, которое не было отмечено при нашем анализе Fgfr2Mes^-/- мышей. Хотя эти различия могут быть результатом различных методологических подходов по измерению длины внутривезикулярнго туннеля, это может быть, скорее всего, обусловлено вариабельностью и сложностью фенотипов, ассоциированных с развитием VUR у этих отличающихся животных моделей. Когда эти наблюдения были связаны с фактом, что инсерция мочеточников и внутренняя геометрия треугольника выглядят нормальными у одиночных non-refluxing Fgfr2Mes^-/- мышей, то они строго подтвердили, что первичным дефектом, ответственным за развитие VUR у Fgfr2Mes^-/- мышей является неправильная инсерция мочеточников в развивающий мочевой пузырь, приводя к изменению внутренней геометрии треугольника и последующей функции. Это заключение согласуется с оригинальной гипотезой Mackie and Stephens' развития VUR, которая предполагает, что отклонения в позиционировании зачатков мочеточников во время развития ведет к аномальным местам инсерции мочеточников в мочевой пузырь, внося вклад в последующее развитие VUR (Mackie et al.,1975; Mackie and Stephens,1975).

In summary, 3-D morphometric analysis of bladder development provided a wealth of novel information regarding normal and abnormal urinary tract development, permitting a variety of downstream permutations to be performed without data re-acquisition. This approach demonstrated that normal detrusor smooth muscle development initiates in the bladder dome and sequentially progresses down the posterior bladder wall, with distinct smooth muscle layers becoming evident during postnatal development. 3-D morphometric analysis easily quantified and confirmed that the primary defect associated with mgb^-/- mice is a decrease in the differentiation of detrusor smooth muscle throughout development. In addition, multivariate analysis indicated that significant deviations in the geometry of the internal bladder trigone correlated best with the development of VUR in Fgfr2Mes^-/- mice. In conclusion, this study validates the use of a 3-D morphometric approach to quantify the morphological features associated with bladder development, and establishes a valuable research tool for future studies designed to characterize the complex events associated with both normal and abnormal urogenital development.