Мы использовали комбинацию фото-превращения KikGR с количественным анализом паттернов 3D миграции клеток, чтобы проанализировать миграцию одиночных клеток во время морфогенеза ветвления. Этот подход выявил регион-специфические паттерны миграции с различиями в скорости, траекториях и морфологии клеток; эти паттерны могут альтернативно зависеть от зависимых от интегринов вза имодействий с базальной мембраной, немышечным миозином II или E-cadherin, в зависимости от конкретного места. Этот подход к исследованию 3D подвижности одиночных клеток с использованием анализа количественного слежения может быть использовано и в др. развивающихся системах, чтобы идентифицировать количественные потребности в специфических молекулах для морфогенеза ветвления органов.

Наши выводы сравнения паттернов миграции индививдуальных клеток в разных регионах слюнных желез во время морфогенеза ветвления следующие: (a) маркер фото-конверсии KikGR позволяет отслеживать морфологию и подвижность индивидуальных клеток в эксплантированном органе, подвергающемуся морфогенезу в отсутствие необходимости в вирусной инфекции; (b) даже с помощью статичных изображений показано, что эпителиальные клетки непосредственно соседствующие с базальной мембраной слюннрых желез, подвергаются морфогенезу ветвления, они довольно организованы в полу-столбчатый паттерн по сравнению с клетками внутри концевых зачатков, эти внешние клетки зачатка подвергаются быстрым, экстенсивным изменениям в форме и положении; (c) подвижность наружных клеток зачатка наивысшая из всех эпителиальных клеток в этих развивающихся железах в отношении скорости: наружная часть зачатка > внутренняя часть зачатка > протоки; (d) даже если они обладают наивысшей подвижностью, то наружные клетки стремятся оставаться в тесной близи к базальной мембране; (e) разрушение integrin-обеспечиваемых клеточных взаимодействий с базальной мембраной нарушает подвижность этих наружных клеток зачатка, которые становятся более округлыми и менее организованными в терминах параллельного расположения; (f) 3D миграция наружных клеток зачатка также зависит от активности myosin II, это противоречит описанным находкам для клеток на 2D поверхностях регулярных культур; (g) миграция наружных клеток зачатка не затрагивается существенно нарушениями функции E-cadherin; и (h) миграция внутренних клеток зачатка достоверно увеличивается при ингибировании E-cadherin, указывая, что она обратным образом зависит от этой молекуля межклеточной адгезии, которая в действительности действует, чтобы ограничить скорость миграции внутренних клеток зачатка.

В эмбриональных слюнных железах наружные эпителиальные клетки зачатка, соседствующие базальной мембраной, как известно, морфологически отличны, при этом различия касаются и окончательно дифференцированных судеб клеток по сравнению с внутренними клетками зачатка (Walker et al., 2008). Наружные, периферические клетки более цилиндрические, чем клетки внутри, и они обнаруживают более организованные межклеточные соединения, содержащие молекулу межклеточной адгезии E-cadherin. В частности, наружные клетки зачатка экспрессируют B1 антиген, маркер характерный для более зрелых ацинусов, и они становятся ацинусами скорее, чем протоками по ходу развития; напротив внутренние клетки зачатка предназначены, чтобы стать вторичными протоками (Walker et al., 2008).

Даже если наружные клетки зачатка выгляюят более организованными на уровне ткани, наши исследование выявило неожиданно, что существенно более подвижны, чем внутренние клетки зачатка и протоков и они также значительно более плеоморфны. Эти клетки на периферии зачатка часто контактируют с базальной мембраной, мигрируя вдоль неё или касаясь, покидая и возвращаясь. Ингибирование интегринов, как полагают, обеспечивает взаимодействия клеток с базальной мембраной, снижая их скорость миграции, так что внутренние клетки зачатка при этом теряют свою характерную quasi-columnar организацию. В заметном контрасте скорость подвижности внутренних клеток зачатка, оставалась незатронутой при ингибировании того же самого интегрина, это согласуется с минимальными количествами белков внеклеточного матрикса в этом регионе развивающихся слюнных желез. Эти находки обнаруживают центральную роль взаимодеействий между эпителиальными клетками и базальнрой мембраной в формировании паттерна подвижности клеток слюнных желез. Мы полагаем, что высокий уровень подвижности и пластичности клеточной формы является обязательным условием для последующей ступени проникновения клеток в кончики концевых зачатков, чтобы сформировать расщепление. Наше исследование также подтвердило важность этих взаимодействий интегрина для углубления расщепления и формирования зачатка, это вызывало последующую длокальную экспрессию Btbd7, разделение клеток, чтобы сформировать пробел, и постепенное углубление расщепа (Onodera et al., 2010).

Наши находки, касающиеся важности взаимодействий клеток с базальными мембранами, согласуются с предыдущими исследованиями, показавшими вважность компонентов базальных мембран, таких как коллагены (которые, как полагают, включают collagen IV базальных мембран помимо collagens I или III, ассоциированных с мезенхимо), proteoglycans, laminin, и fibronectin в морфогенезе ветвления слюнных желез (Grobstein and Cohen, 1965; Bernfield et al., 1972; Kadoya et al., 1998; Sakai et al., 2003). Нарушения клеточных взаимодей с базальной мембраной c помощью антител против интегринов изменяет морфологию, скорость миграции и паттерн локализации E-cadherin в наружных клетках зачатка на паттетн, характерный для внутренних клеток зачатка. Поэтому мы полагаем, что критическим вкладчиком в ранее описанную характерную морфологию и маркеры наружных, периферических клеток зачатков (Walker et al., 2008; Onodera et al.,2010) является динамичное интегрином обусловленное взаимодействие iэтих клеток с базальной мембраной. Это взаимодействие интегринов также играет ключевую роль в поддержании высокой скорости и зависимого от базальной мембраны миграции эпителиальных клеток и общего процесса морфогенеза ветвления.

Роль немышечного миозина II, которую мы наблюдали при быстрой миграции наружных клеток зачатка в 3D наблюдениях в клеткакх развивающегося органа, отличается от клеточной миграии в матричном субстрате in vitro на субстратах тканревой культтуры. В 2D клеточной культуре ингибирование myosin II c помощью blebbistatin или c помощью устранения гена или нокдауна обычно приводило к повышенной активностью выпячиваний ламеллиподий и ускоренной миграцией фбробластов и эпителиальных клеток из морфогене тической ткани (Even-Ram et al., 2007; Vicente-Manzanares et al., 2007; Pasapera et al., 2010; Plosa et al., 2012), тогда как миграция клеток была ингибировна внутри развивающихся желез в данном исследовании, а также в исследованияях миграции клеток в 3D in vitro в системе клеточных культур (Nakayama et al., 2005; Wilkinson et al., 2005; Doyle et al., 2009; Derycke et al., 2011; Petrie et al., 2012). Т.о., миозин II, по-видимому, играет роль в качестве тормоза скорости миграции в условиях 2D , способстсуя формированию адгезии между клетками и матриксом. Напротив, он необходим длля эффективной миграции наружных эпителиальных клеток в 3D. Хотя ингибирование изоформ миозина II c помощью blebbistatin может первоначально увеличивать количество расщеплений и веточек в развивающихся слюнных железах и легких (Daley et al., 2009; Plosa et al., 2012), в конечном счете он ингибирует углубление ращелин и ветваление. Кроме того, ингибирование 3D эпителиальной миграции, как было установлено,в данной работе, потеря контрактильности ингибирует процесс сборки фибронектинового матрикса, как известно, необходимого для начала морфогенеза ветвления слюнных желез (Sakai et al., 2003; Daley et al., 2009).

Важно отметитьб, что имеется, по крайней мере, два разеных способа миграции 3D, выявленных в данном исследованияи: клеточная миграция, ассоциироованная с базальной мембраной и клеточная миграция внутри зачатка, для которой необходим минимум матричных белков. Как обсуждалось выше, integrins и myosin II необходимы для эффективной миграции наружных клеток зачатка. Внутренние клетки зачатка мигрируют более медленно и, ч то интересно, их миграция не зависит ни от интегорина,ни от миозина II , отвечающих за быструю миграцию наружных клеток зачатка. Более того, миграция наружных клеток зачатка и морфогенез ветвления минимально затрагиваются инргибированием E-cadherin , по крайней мере, 20 ч, тогда как подвижность внутренних клеток зачатка значительно оболее чувствительна. Важно, однако, что чувствительность испорльзует 60% на ускорение миграции, показывая, что скорость внутренних эпителиальных клеток зачатка дбействительно сдержэивается c помощью E-cadherin взщаимодеййствий. Эти E-cadherin адгезивные взаимодействия могут обычнор действовать на удержание внутренних клеток зачатка в центре зачатка, снижая их перемешивание с наружными клетками зачатка. Это вносит вклад в сегрегацию клеточных типов, помогая поддеранию различий в судьбах, i.e., протоковые в противовес ацинарным клеткам (Walker et al., 2008).

Итак, отслеживание миграции индивидуальных клеток в разных местах органа с морфогенезом ветвления выявило регион-специфические скорости миграции и различия в зависимости от молекулярных ускорителей или ингибиторов миграции. Ключевая концепция, идентифицированная в этом исследовании, это центральная роль взаимодействий эпителиальных клеток и безальной мембраны для быстрой миграции наружных эпителиальных клеток зачатка; они вносят основной вклад в определенную динамическую морфологию клеток и миграцию клеток по сравнению с внутренними клетками. Кроме того, роль myosin II и E-cadherin отличается в этих двух регионах зачатка, что согласуется с концепцией регион-специфических отличий взаимодейстуий клеток с матриксом, подвижности клеток и судеб клеток внутри эпителлиальных концевых зачатков, вносящих вклад в разные аспекты морфогенеза ветвления.