Эпителиальный морфогенез представляет различные процессы, с помощью которых эпителий вносит вклад в формирование органов и формы тела. Эти сложные события играют центральную роль в развитии, регенерации и раковых опухолях. Мембраны эпителиальных клеток подразделены на апикальные базолатеральные домены и взаимно соединены с помощью соединений, которые связывают их др. с др. (Schock and Perrimon,2002). Становление и поддержание этой специфической архитектуры необходимо как для формирования сцепленных слоев клеток и обеспечивают барьерными свойствами эпителий.

Пространство между соседними эпителиальными клетками разделено на апикальный и базальный компартменты с помощью специализированных апикальных структур, наз. плотными соединениями (TJs; Cereijido et al.,2007). TJs состоят из множественных белковых комплексов, которые окружают клетки, и распространяются в липидный слой, чтобы сформировать сеть анастомозов между соседними клетками (Gupta and Ryan,2010). TJs образуют динамические барьеры, регулирующие токи между клетками небольших молекул и воды между эпителиальными клетками путем формирования размера и заряда избирательных пор (Furuse,2010). TJs могут быть модифицированы в ответ на внешнесредовые, физиологические и фармакологические сигналы, а альтерации их структуры ассоциируют с различными патологиями человека, включая аутоиммунные болезни, врожденную глухоту, почечные болезни, прогрессирование опухолей и аллергии (Cereijido et al.,2007).

Различные белки специфически располагаются в TJs, где они регулируют структуру актина, межклеточные адгезии и тканевую проницаемость (Anderson and Van Itallie,2010). Claudins это 4 раза пронизывающие мембрану белки, состоящие из структурного и функционального строительных блоков TJs (Angelow et al.,2008). Claudins предопределяют проницаемость малых молекул через TJs и широко экспрессируются в эмбриональном и взрослом эпителии. Экспрессия специфических комбинаций claudins в разных эпителиях подтверждает, что комбинаторный 'клаудиновый код' может предопределять размер и ионную специфичность TJs (Gupta and Ryan,2010).

Исследования, осуществленные на культивируемых клетках, показывают, что claudins участвуют в формировании TJ и что индивидуальные клаудины отличаются свой способностью формировать плотные соединения или барьеры протекаемости эпителия (Amasheh et al.,2002; Anderson and Van Itallie,2010). Мутации в некоторых CLAUDIN генах человека были ассоциированы с болезнями кожи, почек, ушей (Simon et al.,1999; Wilcox et al.,2001; De Benedetto et al.,2011). Сходным образом, аномальная экспрессия CLAUDIN описана при болезнях желудочно-кишечного тракта (Zeissig et al.,2007; Schulzke et al.,2009) и опухолях (Aung et al.,2006; Hewitt et al.,2006; Kulka et al.,2009; Nemeth et al.,2009) у человека.

Активность белков claudin также, по-видимому, необходима для собственно тканевого морфогенеза. Напр., у эмбрионов Xenopus избыточная экспрессия Xcla (гомолога CLAUDIN 4 человека), как было установлено, нарушает петлеобразование сердечной трубки (Brizuela et al.,2001), Тогда как блокирование функции как claudin 4 Ю так и claudin 6 в трофэктодерме мышей ведет к коллапсу бластоциста (Moriwaki et al.,2007). Сходным образом, образование просвета в нейроэпителии (Zhang et al.,2010) или в эпителии кишки (Bagnat et al.,2007) эмбрионов рыбок данио, как было установлено, нуждается в экспрессии claudin 5a и claudin 15, соотв.

Реорганизация цитоскелета, поляризация клеток и сборка межклеточных соединительных комплексов (включая TJs) являются процессами интимно участвующими в формировании трубчатых структур в разных органах, в том числе и поджелудочной железе (Hick et al.,2009; Kesavan et al.,2009). У эмбрионов мыши морфогенез поджелудочной железы инициируется примерно на день эмбриогенеза (E) 9.5-10.5 с появления двух эпителиальных рудиментов в энтодерме области передней кишки (Guney and Gannon,2009). Вскоре после этого группы панкреатических клеток приобретают апикобазальную полярность и формируют микропросветы; эти структуры затем размножаются, сливаются и собираются в трубчатые комплексы (Hick et al.,2009; Kesavan et al.,2009). Результатом этого процесса является появление сложной сети протоков, соединенные с ацинарными клетками (продуцирующих переваривающие ферменты), собирающих секретируемые зимогены и транспортирующих эти продукты в двенадцатиперстную кишку (Grapin-Botton,2005). Помимо протоков и ацинарных клеток зрелая поджелудочная железа также содержит многочисленные островки, которые продуцируют гормоны, необходимые для поддержания гомеостаза глюкозы (Slack,1995).

Недавние исследования начали раскрывать, какой вклад вносят определенные белки (напр., Cdc42) в становление апикобазальной полярности в раннем панкреатическом эпителии (Kesavan et al.,2009). Однако роль, которую выполняют индивидуальные клаудины во время морфогенеза поджелудочной железы, практически неизвестна. Данное исследование анализирует экспрессию транскриптов и белков клаудинов во время развития поджелудочной железы мыши. Кроме того, исследованы потенциальные изменения в экспрессии белков клаудинов во время инициальной стадии неопластической трансформации поджелудочной железы.

RESULTS AND DISCUSSION

Мы пришли к выводу, что экспрессия claudin 1 предшествует экспрессии ZO-1 и образованию TJs в предшественниках развивающейся поджелудочной железы. Эти результаты показали, что функция claudin 1 может быть необходима для становления TJs, образования микропросветов или того и другого в раннем панкреатическом эпителии. Наша находка, что claudin-1 повторно экспрессируется после рождения и локализуется специфически в TJs клеток протоков и ацинусов поджелудочной железы, также указывает на то, что этот белок д. вносить вклад в становление околоклеточной проницаемости этих клеток. Экспрессия CLAUDIN 1 также была обнаружена как в ацинарных, так и протоковых клетках взрослой поджелудочной железы человека (Tsukahara et al.,2005; Borka et al.,2007).

Результаты иммуноокрашивания не выявили экспрессии белка claudin 2 в панкреатическом эпителии между ст. E10.5 и E15.5 (data not shown). Однако claudin 2 обильно экспрессируется в эпителии почек на ст. E15.5 (data not shown). Но мы обнаружили белок claudin 2 в развивающихся протоках на ст. E18.5 (Fig. 3A,B) и в просвете панкреатического эпителия протоков на ст. P5 (Fig. 3C,D). Конфокальная микроскопия показала совместную экспрессию белков claudin 2 и ZO-1 в TJs эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы на ст. E18.5 (Fig. 3B) и P5 (Fig. 3D). Относительно поздняя экспрессия claudin 2 исключает его потенциальную роль в формировании микропросветов, но он участвует в некоторых аспектах физиологии панкреатических протоков крыс (Rahner et al.,2001) и взрослых людей (Aung et al.,2006; Borka et al.,2007).

Транскрипты Cldn3 обнаруживаются в поджелудочной железе ст. E11.5, E15.5, и P7 (Fig. 1; Table 1). Белки claudin 3 экспрессируются во всех эпителиальных мембранах (Fig. 4A,B). Подобно claudin 1, claudin 3 перераспределяется и локализуется совместно с ZO-1 (особенно в формирующихся TJs), в просвете поджелудочной железы E12.5 (Fig. 4C). В отличие от claudin 1, белки claudin 3 сохраняют сильную экспрессию в просвете тубулярных структур поджелудочной железы на ст. E15.5 (Fig. 4D). Эти результаты согласуются с сообщением Kesavan et al. (2009), обнаружившими экспрессию белка claudin 3 в TJs во время ремоделирования трубчатой сети поджелудочной железы на ст. E15.5. Результаты конфокальной микроскопии подтверждают обширную совместную локализацию claudin 3 и ZO-1 в TJs панкреатического эпителия на ст. E15.5 (Fig. 4D) и E18.5 (Fig. 4E).

Экспрессия claudin 3 ранее описывалась в ацинарных и протоковых клетках взрослой поджелудочной железы крыс (Rahner et al.,2001) и в тех же клетках и островках поджелудочной железы человека (Borka et al.,2007; Comper et al.,2009). Мы обнаружили экспрессию белка claudin 3 в TJs эпителия протоков (Fig. 4F,G) и в ацинарных клетках (Fig. 4F,H) , но не в клетках островков (data not shown) у мышей на ст. P5. Следовательно, в постнатальной поджелудочной железе экспрессия claudin 3 ограничивается эпителием протоков и ацинарными клетками, хотя остается возможность. что клетки островков начинают экспрессию claudin 3 в этом органе мышей после P5.

Claudin 5 основной компонент TJs в эндотелиальных клетках и функционирует, чтобы создать собственно гемато-энцефалический барьер (Nitta et al.,2003). Анализ qRT-PCR выявил низкую экспрессию транскриптов Cldn5 на ст. E11.5, E15.5 и P7 в поджелудочной железе (Fig. 1; Table 1). Однако, результаты иммунофлюоресценции идентифицировали экспрессию белка claudin-5 исключительно в эндотелиальных клетках, но не в эпителиальных клетках поджелудочной железы между E13.5 и E15.5 (data not shown). Напротив, экспрессия белка claudin 5 обнаружена в клетках протоков (Fig. 5A) и ацинарных клетках (Fig. 5B) поджелудочной железы на ст. E18.5 и P5. В этих тканях белки claudin 5 локализуются почти исключительно в TJs, где идентифицированы и ZO-1 (Fig. 5A,B). Это согласуется с сообщением, что claudin 5 экспрессируется в ацинусах крыс (Rahner et al.,2001) и клетках протоков и ацинусов человека (Comper et al.,2009). Эндотелиальные клетки, ассоциированные с постнатальной поджелудочной железой также экспрессируют высокие уровни claudin 5 (data not shown). Мы полагаем, что claudin 5 и claudin 2 обладают одинаковым временным паттерном экспрессии в поджелудочной железе, поскольку эти два белка начинают обнаруживаться в этом органе перед рождением. Однако, их распределение в панкреатической ткани несколько отлично, т.к. claudin 2 экспрессируется исключительно в эпителиальных клетках протоков, тогда как claudin 5 экспрессируется как в протоках, так и клетках ацинусов.

Экспрессия claudin 7 в эмбриональной панкреатической ткани млекопитающих не описана. Мы установили, что экспрессия транскриптов Cldn7 в поджелудочной железе обнаруживается на ст. E11.5, E15.5 и P7 (Fig. 1; Table 1). Экспрессия белка claudin 7 обнаруживается во всей мембране панкреатического эпителия на ст. E10.5 (Fig. 6A) как в боковых мембранах, так и TJs (напр., в ZO-1⁺ структурах) на ст. E12.5 (Fig. 6B) и E15.5 (Fig. 6C). Белки claudin 7 также широко распределены в большинстве панкреатического эпителия на ст. E18.5 (data not shown).

Высокий уровень экспрессии claudin 7 сохраняется в боковых мембранах как клеток проток, так и ацинусов (Fig. 6E) на ст. P5. В этих тканях claudin 7 также колокализуется с ZO-1 в TJs эпителиальных клеток протоков, тогда как его ассоциация с ZO-1в ацинарных TJs ограничена (Fig. 6D,E). Низкая, но обнаружимая экспрессия claudin 7 также отмечается в боковых мембранах и возможно TJs клеток островков (Fig. 6F) i на ст. P5 в поджелудочной железе.

Итак, мы установили, что существенная пропорция белков claudin 7 распределяется вдоль боковых мембран эпителиальных клеток поджелудочной железы, что согласуется с предыдущими исследованиями эпителия молочных желез и бронхов у млекопитающих (Coyne et al.,2003; Blackman et al.,2005). В дополнение к его потенциальному вкладу в функцию TJ, claudin 7 может выполнять дополнительные роли в боковых мембранах, поскольку эти белки, как было установлено, ассоциируют с белками клеточной адгезии в культивируемой панкреатической аденокарциноме и колоректальной опухоли (Kuhn et al.,2007).

Итак, выявлен динамический паттерн экспрессии некоторых членов семейства белков claudin во время органогенеза поджелудочной железы мышей (Table 2). Одна группа claudins (1, 3 и 7) широко экспрессируется во всем неполяризованном панкреатическом эпителии, но становится ограниченной TJs (вместе с ZO-1), когда начинают формироваться микропросветы в этой ткани. Эксперименты с потерей функции должны показать, нужна ли экспрессия claudin 1, -3 и -7 в предшественниках поджелудочной железы для образования TJ в этом органе.

Мы также установили, что по ходу органогенеза некоторые claudins оказываются предназначены для специфических типов клеток в поджелудочной железе. Напр., в постнатальной поджелудочной железе claudin 2 ограничивается эпителиальными клетками протоков, тогда как claudin 1, -3 и -5 экспрессируются как в клетках протоков, так и ацинусов. С др. стороны, клетки островков постнатальной поджелудочной железы экспрессируют claudin-7, но не not claudin 1, -2, -3 или -5. Интересно, что claudin 7 не только локализуется в TJs, но и также обильно экспрессируется во всех периферических эпителиальных клетках поджелудочной железы. Итак, специфический паттерн экспрессии claudin подтверждает, что эти белки могут быть важным компонентом морфогенетического процесса во время развития поджелудочной железы.

Restricted Expression of Claudin Proteins in Pancreatic Duct Epithelium Undergoing Neoplastic Transformation

Pancreatic intraepithelial neoplasias (PanINs или mPanINs у мышей) является микроскопически папиллярным или плоским, неинвазивным внрутриэпителиальным новообразованием, возникающим в маленьких панкреатических протоках (Hruban et al.,2001). Эти эпителиальные единицы, представляют собой дискретные стадии раннего развития панкреатических опухолей, которые подвергаются серии гистологических изменений, которые классифицируют их на три степени: PanIN-1A/B, PanIN-2 или PanIN-3 (Hruban et al.,2001). PanINs прогрессируют от небольших к высоким степеням повреждений, т.к. клетки теряют свою полярность и обнаруживают атипические ядра. Увеличение геномной нестабильности обусловлено онкогенными мутациями и потерей функции опухолевых супрессоров, это ещё больше усиливает потенциал этих новообразований в панкреатические опухоли (Hezel et al.,2006).

Варьирующая экспрессия некоторых белков CLAUDIN описана в эпителиальных клетках PanINs или выборках панкреатических аденокарцином (PDA) человеческого происхождения (Nichols et al.,2004; Hewitt et al.,2006; Borka et al.,2007). Эти результаты согласуются с мнением, что прогрессирование раковых опухолей сопровождается разрушением плотных соединений и подтверждает, что как уровни, так и паттерны экспрессии claudin имеют диагностическое значение (Morin,2005).

Находки, что claudin 1, -2, -3, -5 и -7 имеют различающиеся паттерны экспрессии в эпителии развивающейся поджелудочной железы побудили нас исследовать экспрессия этих белков в сходной ткани, которая подвергается неопластической трансформации. Мышиные модели Pdx1Cre;LSL-KrasG12D и Ptf1aCre;LSL-KrasG12D, которые экспрессировали онкогенную форму Kras (KrasG12D) по всей поджелудочной железе и соотв. вызывали повреждения, воспроизводящие весь спектр от PanIN до инвазивного рака (Hingorani et al.,2003). Мы проанализировали также экспрессию claudin-18 в поджелудочной железе Pdx1Cre;LSL-KrasG12D и Ptf1aCre;LSL-KrasG12D мышей, поскольку этот белок был недавно идентифицирован как новый маркер PanINs и инфильтрирующей PDA как человека, так и мыши (Karanjawala et al.,2008; Sanada et al.,2010; Ray et al.,2011).

Claudin expression in PanIN-1A, PanIN-1B, and PanIN-2 lesions.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выявило многочисленные PanIN-1A повреждения в поджелудочной железе как Pdx1Cre;LSL-KrasG12D, так и Ptf1aCre;LSL-KrasG12D мышей, которым было приблизительно 1 год. Эти новообразования имели плоский, цилиндрический эпителий с базально расположенными ядрами и обильной цитоплазмой (Fig. 7A). H&E окрашивание выявило также mPanIN-1B повреждения, которые характеризовались папиллярной или псевдостратифицированной архитектурой (Fig. 7H), и немного mPanIN-2 повреждений, как с папиллярной цитоархитектурой, так и с признаками ядерной атипии, включая потерю полярности уплотнение ядер (Fig. 7O), в Pdx1Cre;LSL-KrasG12D и Ptf1aCre;LSL-KrasG12D поджелудочной железе.

Figure 7. Variable expression of claudin proteins in pancreatic epithelia undergoing neoplastic transformation. From: Dynamic distribution of claudin proteins in pancreatic epithelia undergoing morphogenesis or neoplastic transformation.

Иммуногистохимия выявила широкую экспрессию белков claudin 2 (Fig. 7C) и claudin 18 (Fig. 7G) в mPanIN-1A новообразованиях, хотя белки claudin 18 обнаруживают наиболее выраженное распределение в этих повреждениях по сравнению с белками claudin 2. Интересно, что claudin 18 не выявляется в частях PanIN-1A эпителия с нормальной морфологией протоков (arrow in Fig. 7G). PanIN-1A повреждения у людей также обильно экспрессируют как CLAUDIN 2 (Supp. Fig. S2A,C) так и CLAUDIN 18 (Supp. Fig. S2B,D) белки. Экспрессия claudin-18 в эпителиальных клетках ранних PanINs оценивается как уникальный, реальный маркер ранней неопластической трансформации в панкреатической ткани мышей и человека (Karanjawala et al.,2008; Sanada et al.,2010; Ray et al.,2011).

Эпителий mPanIN-1A также обнаруживает иммунореактивность claudin 5 (Fig. 7E) и claudin 7 (Fig. 7F), хотя эти белки и не распределены столь пространно как claudin 2 и claudin 18. Лишь немногие эпителиальные клетки в новообразованиях mPanIN-1A экспрессируют claudin 1 (Fig. 7B) и claudin 3 (Fig. 7D). Следовательно, устанавливаются характерные паттерны экспрессии белков claudin во время ранней неопластической трансформации в поджелудочной железе, отличном от такового в нормальной поджелудочной железе.

Подавление claudin 1, -2, -3 и -7, по-видимому, сопровождает переход от PanIN-1A к PanIN-1B.

Нами открыта обширная экспрессия claudin 18 по всему эпителию mPanIN-2 (Fig. 7U). Были также выявлены белки claudin 5 в новообразованиях mPanIN-2, однако только в областях, где атипия ядер не очень выражена (Fig. 7S, arrowhead). Некоторые области повреждений mPanIN-2 обнаруживают также иммунореактивность claudin 2 (Fig. 7Q, arrowhead), но только в эпителиальных клетках, которые сохранили свою полярность. Напротив, все повреждения mPanIN-2 полностью лишены или почти лишены claudin 1 (Fig. 7P), -3 (Fig. 7R) и -7 (Fig. 7T). Следовательно, изменение репертуара белков claudin важн для прогрессирования новообразований в поджелудочной железе.

В эпителии mPanIN-1A claudin 3 широко ко-локализуется с TJs протоковых и ацинарных клеток (Fig. 4G,H). С др. стороны, подобно постнатальной поджелудочной железе (Fig. 5) claudin 5 значительно распределен в TJs эпителия mPanIN-1A (Fig. 8D).

В данном исследовании выявлена экспрессия claudin-7 как в TJs, так и боковых мембранах панкреатических клеток на постнатальных стадиях (Fig. 6). Сходная субклеточная локализация claudin 7 наблюдается в частях эпителия PanIN-1A с нормальным проявлением (yellow and white arrows in Fig. 8E). Напротив, в областях PanIN-1A с обильной цитоплазмой claudin 7 не обнаруживается в TJs (arrowhead in Fig. 8E) и слабо экспрессируется в боковых мембранах клеток (Fig. 8E). Наконец, мы обнаружили субклеточную локализацию claudin 18 в эпителии mPanIN-1A, этот елок обнаруживал наиболее обильное субклеточное распределение в TJs (white arrows in Fig. 8F) и в боковых мембранах (yellow arrows in Fig. 8F).

Итак, мы установили, что обилие и субклеточное распределение специфических claudin белков различается в нормальном и трансформированном эпителии поджелудочной железы. Возникает возможность, что изменения в околоклеточной проницаемости сопровождают формирование новообразований PanIN.

CONCLUSION

This study uncovered a remarkable plasticity in the expression and distribution of claudin proteins in pancreatic epithelia undergoing morphogenesis or neoplastic transformation. In the mature mammalian kidney, claudin proteins have different expression patterns along the epithelium of each nephronic segment, and experimental evidence indicates that this differential expression provides the renal epithelium with unique paracellular permeability properties (Angelow et al.,2008). Our developmental results thus suggest that allocating different claudin proteins to epithelial TJs could be important to confer specific permeability properties to acinar, ductal or islet cells. Loss-of-function or gain-of-function studies in mice will be needed to underscore the role of individual claudins or combinations of these proteins in TJ assembly and function in pancreatic epithelia. Likewise, our results also support investigating the potential role of claudin function during pancreatic neoplastic transformation.