Сокращения сердца контролируются с помощью сердечной проводящей системы. Желудочковый компонент проводящей системы состоит из сложной сети специализированных кардиомиоцитов, контролирующих быстрое распространение электрической активности в желудочках (Anderson and Ho, 2003). Эта специализированная структура состоит из атриовентрикулярного узла (AVN), атриовентрикулярного или His пучка (AVB), правой и левой ветви пучка и сети периферических волокон Пуркинье. Недавнее исследование показало, что аномальная морфология ventricular conduction system (VCS) лежит в основе аритмий у человека и модельных мышей (Christoffels and Moorman, 2009; Haissaguerre et al., 2002). Несмотря на важность VCS как аритмогенного субстрата, его возникновение в ходе развития противоречиво из-за отсутствия уникальных маркеров всей VCS во время развития и у взрослых (Miquerol et al., 2011; Park and Fishman, 2011).

Ретроспективный клональный анализ с использованием nlaacZ репортерного гена является мощной техникой для реконструкции клеточных клонов во время органогенеза млекопитающих (Buckingham and Meilhac, 2011; Eloy-Trinquet et al., 2000; Miquerol and Kelly, 2009). Эта техника базируется на дефективном репортерном гене, nlaacZ, который может активизироваться вследствие низкочастотного события внутригенной рекомбинации (Bonnerot and Nicolas, 1993). Это редкое событие может возникнуть в любое время во время развития. Специфичная для сердца экспрессия nlaacZ под транскрипционным контролем α-cardiac actin локуса делает возможным анализ свойств клонального роста миокардиальных клеток в сердце мышей (Meilhac et al., 2003). Клональный анализ продемонстрировал, что миоциты желудочков происходят из двух кардиальных клонов, соответствующих двум популяциям клеток предшественников, первого и второго поля сердца, давая левый желудочек, включая левую половинку межжелудочковой перегородки и тракт оттока, правый желудочек и правую половину перегородки, соотв. (Franco et al., 2006; Meilhac et al., 2004).

Чтобы исследовать способ развития VCS млекопитающих, мы использовали nlaacZ ретроспективный клональный подход в комбинации с трансгенной VCS репортерной линией, Connexin40-GFP, которая позволяет безусловную идентификацию проводящих миоцитов при клеточном разрешении. В предыдущем исследовании мы проанализировали клонально независимые кластеры, каждый содержащий менее 1000 β-galactosidase-позитивных клеток в 3-недельных сердцах и установили, что VCS и соседние работающие кардиомиоциты млекопитающих развиваются из общих клеток предшественников, как и в сердце птиц (Gourdie et al., 1995; Miquerol et al., 2010). Более того, развитие VCS млекопитающих двухфазное, при этом ограниченный рост сопровождается клональным ограничением (Miquerol et al., 2010). Однако, вклад клеток, происходящих из первого и второго поля сердца в разные компоненты развивающейся VCS в основном неизвестен. Islet1 (Isl1), экспрессируется на высоком уровне и функционально важен для клеток предшественников второго поля сердца, он также экспрессируется в субпопуляциях задающих ритм клеток в сино-атриальном и атриовентрикулярном узлах, а анализ по генетическому отслеживанию tamoxifen-inducible Isl1-Cre выявил частичное участие этих клеток в AVN, указывая тем самым на генетическую гетерогенность среди предшественников AVN (Sun et al., 2007). Сходным образом, поскольку клональный анализ продемонстрировал, что работающие и проводящие кардиомиоциты имеют общих предшественников, то эти результаты не исключают участие др. клеточных клонов в VCS. В самом деле, анализ генетического отслеживания, базирующийся на экспрессии Cre под контролем гена Mesp1 идентифицировал популяцию клеток, не экспрессирующих Mesp1 вносящих частично вклад в VCS (Kitajima et al., 2006) и Wnt1-Cre-производные клетки , происходящие из нервного гребня, наблюдались на верхушке межжелудочковой перегородки, где дифференцируется AV пучок (Nakamura et al., 2006). Cre-based генетическое отслеживание, однако, в противоположность клональному анализу , предоставляет информацию о куммулятивном паттерне экспрессии Cre скорее, чем о судьбе специфических популяций клеток предшественников (Buckingham and Meilhac, 2011; Christoffels et al., 2009).

Здесь мы расширили наш клональный анализ VCS, сфокусировавшись на небольшом количестве редких nlaacZ сердец, содержащих высоко информативные крупные клоны из более 1000 клеток. Статистический анализ подтвердил, что меченные клетки в таких сердцах возникают в результате рекомбинации на ранних стадиях развития, это делает возможной оценку вклада клеток предшественников в разные компоненты VCS. Наши результаты выявили двойной вклад клеток, происходящих из двух кардиальных клонов в развивающуюся VCS. PF в левом желудочке, включая LBB, происходит из одного клона, а PF сеть в правом желудочке из др. клона, тогда как оба клона вносят вклад в RBB, AVB и AVN. Наши находки подтверждаются анализом специфичных для сердца трансгенов, а также исследованиями по генетическому отслеживанию, которые совместно подтверждают, что вся VCS происходит исключительно из клеток общего миогенного предшественника, дающих также работающие миоциты в первом и втором поле сердца. Более того, данные ретроспективного анализа nlaacZ системы и Cre-генетического отслеживания выявляют существование клональных границ внутри центральной проводящей системы, подтверждая раннюю сегрегацию разных компонентов VCS.

DISCUSSION

Evidence for Two VCS Lineages Suggests Dual Contributions of the First and Second Heart Fields to the Ventricular Conduction System

В данном исследовании мы использовали ретроспективный клональный анализ и генетическое отслеживание вместе с анализом регионализованного трансгена, чтобы установить, что VCS, маркированная с помощью экспрессии Cx40-GFP трансгена, формируется из двух клеточных клонов. Используя ретроспективный nlaacZ анализ, мы охарактеризовали редкие сердца с множественными крупными кластерами меченных клеток, включая VCS. Ряд сердец в множественными крупными β-galactosidase-позитивными кластерами значительно крупнее, чем ожидалось, если бы они возникали с результате множественных независимых рекомбинационных событий. Более того, низкий показатель этих сердец идентичен тем сердцам с множественными диспергированными кластерами, полученными в предыдущем исследовании на 8.5 день эмбриогенеза, подтверждая заключение, что они возникли в результате раннего рекомбинационного события во время фазы дисперсии клеток кардиальных предшественников (Meilhac et al., 2003). Приведенные выше аргументы подтверждают, что меченные клетки в сердцах с множественными крупными кластерами клонально родственны. Это заключение согласуется с наблюдением, что крупные кластеры распространяются на всю толщину стенки желудочка (от эпикарда до эндокарда), подобно клонам, полученным с помощью ретровирусной инфекции сердец кур на ранних стадиях развития (Mikawa et al., 1992).

Присутствие Cx40-GFP-позитивных клеток в β-galactosidase-позитивных клонах подтверждает, что проводящие миоциты дифференцируются из того же самого пула предшественников, что и работающий миокард. Сердца, содержащие множественные крупные клоны, были классифицированы с учетом распределения β-galactosidase-позитивных клеток в разных компартментах VCS. Мы наблюдали, что два региона LBB и RPF, взаимоисключающие др. др. и поэтому, скорее всего, происходят из двух независимых клонов. Используя тот же самый ретроспективный клональный подход, Meilhac et al. (2004) показали, что сердечная трубка формируется двумя клонами, которые сегрегируют рано из общего родоначальника. В этом предыдущем анализе левый желудочек и презумптивный OFT E8.5 эмбрионального сердца, как было установлено, происходят исключительно из первого и второго клона, соотв. По ходу кардиального морфогенеза эмбриональный LV вносит вклад в левую сторону окончательной IVS, как было предположено Aanhaanen et al. (2009), используя генетическое отслеживание Tbx2-Cre, а OFT частично в RV, как показывает генетическое Tbx1-Cre отслеживание (Brown et al., 2004; Huynh et al., 2007). Эти результаты подтвердили, что левый и правый клоны, обнаруживаемые в VCS соответствуют двум миокардиальным клонам, которые были обнаружены на более ранних стадиях (Meilhac et al., 2003). Во время эмбрионального развития первый и второй клон соответствуют двум популяциям клеток предшественников, которые вносят вклад в сердце, первое поле сердца first heart field (FHF) дает первичную кардиальную трубку и левый желудочек, а клетки предшественники второго поля сердца (SHF) дают OFT и правый желудочек (Buckingham et al., 2005; Kelly, 2012). Правая/левая граница существует между двумя VCS клонами, подтверждая двойной вклад первого и второго поля сердца в развивающуюся VCS. Это заключение подкреплено нашими nlacZ трансгенными скрещиваниями и анализом генетического отслеживания, что LPF и LBB обладают общим для левого желудочка профилем экспрессии трансгена, а RPF с правым желудочком профилем экспрессии трансгена.

The Acquisition of a Conductive or Working Myocardial Phenotype Occurs After the Addition of Second Heart Field Progenitor Cells to the Cardiac Tube

VCS состоит из центральных элементов, включая AVN, AVB, BBs и периферической сети из RPF и LPF (Cheng et al., 1999; Christoffels and Moorman, 2009; Miquerol et al., 2011). В нашем ретроспективном nlaacZ клональном анализе присутствие сердец с клонами, захватывающими центральные и периферические регионы, подтверждает, что оба компонента VCS происходят из общих предшественников. Отсутствие клонов с центральными и периферическими элементами при ретроспективном клональном анализе, проведенном на птицах, может быть объяснено различиями во времени мечения клеток, которое происходит раньше в кардиальной трубке при ретровирусной инфекции эмбрионов кур по сравнению с мечением во время ранней дисперсионной фазы роста для крупных nlacZ клонов (Gourdie et al., 2000; Meilhac et al., 2003). Более того, ряд сердец с крупными кластерами в центральной или периферической VCS был сходным, несмотря на различия в размере этих компартментов, указывая тем самым, что общие предшественники могут вносить одинаковый вклад во все компоненты VCS. Однако, поскольку периферическая проводящая система, происходит из левого или правого клона в зависимости от желудочка, то мы наблюдали, что AVN, AVB и RBB происходят из предшественников как правого, так и левого клонов VCS. Более того, анализ трансгена nlacZ показал, что AVN, AVB и RBB состоят из клеток, экспрессирующих трансгенную транскрипционную программу каждого желудочка, подтверждая клеточные вклады из первого и второго полей сердца. Во время развития сердца границы экспрессии трансгена nlacZ совпадают с границей между FHF и SHF, расположенной на уровне межжелудочковой перегородки и внутреннего изгиба, где развивается центральная проводящая система (Moorman et al., 1998). Итак, эти данные позволяют предполагать, что не существует различий между центральной и периферической VCS или работающим миокардом в общих клетках предшественниках, которые дают раннюю сердечную трубку и подтверждают, что судьба проводящих клеток предопределяется после добавления SHF к ранней сердечной трубке. Эти данные согласуются с таковыми на моделях птиц, где центральный и периферические компоненты VCS , как полагают, развиваются независимо в результате индукции и рекрутирования соседних миоцитов и последующего соединения их вместе, чтобы сформировать зрелую структуру (Cheng et al., 1999).

The Central Conduction System Segregates Early From the Surrounding Myocardium Independently of a Dual Contribution From Right and Left VCS Lineages

Наш ретроспективный анализ nlaacZ демонстрирует существование границы между AVB и расположенными ниже миоцитами межжелудочковой перегородки, подтверждая раннее разделение между проводящими клетками в центральной VCS и работающими миоцитами IVS. Это раннее разделение согласуется в моделью первичного кольца, согласно которой пул ранних предшественников центральной проводящей системы идентифицируется на межжелудочковом отверстии с помощью иммунологических подходов на ст. E10.5, после того как клетки второго поля сердца вносят свой вклад в сердце (Wessels et al., 1992). Кроме того, наши данные ретроспективного анализа согласуются с существованием границы в AVN между нижними клетками узла, которые экспрессируют Cx40-GFP и теми, что негативны по Cx40-GFP, подтверждая раннюю сегрегацию между клетками, формирующими AVB и AVN. Эта граница в AVN также обнаруживается при использовании анализа генетического отслеживания с помощью Mef2C-AHF-Cre и Mlc1v-24 трансгенной экспрессии, подтверждая предыдущие эксперименты по генетическому прослеживанию, показавшими, что AVN образуется из производных AVC, тогда как AVB и клетки нижней части узла формируются из производных желудочков (Aanhaanen et al., 2010). Раннее расхождение клеток нижней части узла от окружающей ткани AVN подтверждается находками, что существуют два периода пролиферации проводящих клеток в AVN у эмбрионов кур (Cheng et al., 1999). Эти данные показывают, что центральная VCS отделяется рано после добавления клеток SHF, что совпадает с возникновением зрелой ECG, которая может быть записана со ст. E9.5 (de Jong et al., 1992). Более того, спецификация проводящего фенотипа может быть результатом существования сигналов позиционной информации во время развития. Такие сигналы были установлены для периферических волокон Пуркинье у эмбрионов кур, которые индуцируются с помощью Endothelin (Gourdie et al., 1998) и для центральной проводящей системы в ответ на Neuregulin в эмбрионах мышей (Rentschler et al., 2002).

The Ventricular Conduction System is Entirely Derived From Myogenic Progenitors

Наш ретроспективный анализ клонов строго подтверждает существование двух основных клонов VCS, происходящих из клеток предшественников FHF и SHF. Предыдущий анализ Cre генетического отслеживания подтвердил, что Wnt1-Cre-производные клетки колонизируют AV регион (Jiang et al., 2000; de Lange et al., 2004) и участвуют в формировании верхушки межжелудочковой перегородки, где развиваются AVB и веточки этого пучка (de Lange et al., 2004; Jiang et al., 2000). Используя Cx40-GFP VCS репортерную линию, мы продемонстрировали, что Wnt1-Cre генетически меченные клетки кардиального нервного гребня не дают Cx40-позитивных клеток в AVB или веточках пучка. В противоположность Cx40-GFP, Tbx3 экспрессируется в небольшой фракции Wnt1-Cre-происходящих клеток, это может быть приписано более широкой экспрессии Tbx3 в кардиальном развитии (Hoogaars et al., 2004; Mesbah et al., 2008). Итак. эти результаты подчеркивают важность осуществления совместного иммуноокрашивания с безусловными VCS маркерами, чтобы идентифицировать клеточные характеристики скорее, чем базироваться исключительно на гистологических характеристиках. Строгое совпадение между клетками кардиального нервного гребня и проводящими клетками в AVB может указывать на коммуникации между этими клетками и в самом деле было показано, что клетки, происходящие из нервного гребня, играют роль в созревании AVB на вершине IVS (St-Amand et al., 2006). Устранение клеток нервного гребня у птиц ведет к дефектам компакции AVB и неспособности формировать электрическое проведение от верхушки к основанию (Gurjarpadhye et al., 2007).

Мы также исследовали вклад клеток предшественников, экспрессирующих Mesp1 в VCS. Используя Mesp1-Cre линию, мы наблюдали популяцию клеток, не меченных с помощью Mesp1-Cre, которые могут давать как Cx40-GFP-позитивные, так и работающие кардиомиоциты. В соответствии с предыдущими данными (Kitajima et al., 2006), мы показали, что клетки, не экспрессирующие Mesp-1-Cre, дают только фракцию VCS. Однако мы также установили не экспрессирующие Mesp1-Cre клетки в непроводящих кардиомиоцитах, это открывает возможность, что кластеры клеток, не экспрессирующие Mesp1-Cre внутри сердца могут возникать из-за неполной активности Cre в популяции клеток мезодермальных предшественников. Вместе с нашим анализом ретроспективных клонов эти результаты подтверждают, что проводящие и работающие миоциты происходят из одного и того же пула предшественников и подтверждают, что два задокументированных здесь клона, скорее всего, являются единственным источником клеток, дающих VCS.

Итак, эти результаты информируют о последовательности событий, которые происходят во время развития VCS. Наши результаты подтверждают общее происхождение проводящих и работающих миоцитов и выявляют два VCS клона, которые соответствуют первому и второму кардиальному клонам. Периферическая проводящая система (включая LBB) развивается из левого или правого миокарда желудочков, происходящих, как известно, из клеток предшественников FHF или SHF, соотв. Напротив, компоненты центральной проводящей системы, включая AVN, AVB, RBB, происходят из смешанных популяций предшественников FHF и SHF, которые сегрегируют рано от соседнего работающего миокарда.