Глазная поверхностная эктодерма являются мультипотентным регионом эктодермы головы, который дает хрусталик, роговицу и эпителий конъюнктивы, а также слёзные железы и эпидермис глазных век. Мы исследовали механизм эктодермальной спецификации и детерминации в направлении судьбы роговичного эпителия (CE). Территория презумптивного CE может быть идентифицирована, хотя периферически она не ограничивается, когда отсоединяется хрусталиковый пузырек от эктодермы. У эмбрионов кур, это событие сопровождается двумя волнами миграции клеток нервного гребня в пространство между эктодермой и хрусталиком. Эти клетки впоследствии будут становиться эндотелием и стромальными фибробластами (Hay, 1980). Стадии развития переднего сегмента глаз у эмбрионов кур предоставлены на диаграмме, которая суммирует наши результаты (Fig. 6). Полностью сформированная роговица представлена тремя слоями: стратифицированным эпителием, экспрессирующим пару кератинов K3/K12 (O'Guin et al., 1987) , лежащим поверх стромы, состоящей из высоко упорядоченного коллагена, рыхло пронизанной фибробластами, и одиночного подлежащего слоя эндотелия. Роговица является прозрачной частью наружного покрова, характеризующейся экспрессией белков типа crystallin (rev. Jester, 2008), включая классические кристаллины хрусталиков (Ren et al., 2010). Более того, её развитие и постнатальное поддержание сходно с таковыми хрусталика, зависит от активности Pax6 (rev. Ashery-Padan and Gruss, 2001). Детерминация эпителия роговицы кур, как было установлено, автономна от её стромы в первую неделю развития (Zak and Linsenmayer, 1985), тогда как эксперименты одной из групп показали показали, что у млекопитающих судьба роговичного эпителия может быть изменена в эпидермис даже во взрослой ткани, если она сведена с эмбриональным дермисом (Ferraris et al., 2000), и что это зависит от подавления Pax6 в индуцированных волосяных плакодах (Pearton et al., 2005). Мы полагаем, что это различие в результатах у двух разных видов нуждается в дальнейшем исследовании, особенно в отношении роли экспрессии Pax6 в эпителии роговицы цыплят и того, как она реагирует на новые окружающие условия.

Индукция роговицы обычно рассматривается последней в серии индуктивных событий в развитии глаза, при этом хрусталиковый пузырек взаимодействует с лежащей поверх поверхностной эктодермой (rev. Moose et al., 2009; Graw, 2010). Однако отсутствует экспериментальное подтверждение этой гипотезы, которая базируется только на тесной ассоциации этих двух тканей (Amprino, 1949, rev. Hay, 1980). Сходным образом, почти сто лет считалось, что индукция хрусталика происходит в то время, когда оптический пузырек и хрусталиковая плакода приходят в контакт (Spemann, 1901). Это мнение впоследствии изменилось в свете новых доказательств. Во-первых, клетки, детерминированные, чтобы стать хрусталиком являются частью преплакодного домена в эктодерме нейрулы (rev. Streit, 2004; Bhattacharyya and Bronner-Fraser, 2004). Во-вторых, зрительный пузырек (OV) не является первичным индуктором, а скорее вносит вклад в финальную фазу формирования хрусталика (rev. Sullivan et al., 2004). Более того, исследования нокаута Bmp4 и Bmp7 у мышей и эксперименты по потере функции у эмбрионов кур показали, что передача сигналов bone morphogenetic protein (BMP) важна для формирования хрусталика (Dudley et al., 1995; Furuta and Hogan, 1998; Wawersik et al., 1999; Pandit et al., 2011). Несмотря на такие исследования у мышей и кур, возможные эффекты отсутствия хрусталика на развитие роговицы не были адекватно исследованы. Недавнее исследование показало, что хрусталиковый пузырёк может быть не обязателен для дифференцировки CE, принимая во внимание, что экспрессия keratin 12 (K12) остается неизменной у трансгенных мышей, у которых хрусталиковые волокна разрушены. Это было установлено с помощью экспрессии ослабленной версии дифтерийного токсина (Tox176), управляемого с помощью гибридного промотора, который активен в клетках волокон хрусталика (Zhang et al., 2007). Этот результат подтвердил, что хрусталиковая плакода скорее, чем хрусталиковый пузырёк, может быть критическим для спецификации CE. Когда экспрессия Tox176, управлялась с помощью модифицированного промотора Pax6, то хрусталиковая плакода постоянно удалялась и вместо роговицы формировалась кожа (Zhang et al., 2008b). Однако , последний результат делает возможным две интерпретации. Т.к. Pax6 необходим как для хрусталиковой плакоды, так и для формирования CE, и всё ещё необходим в этих двух структурах у взрослых, поэтому промотор Pax6 д. управлять экспрессией в обоих, поэтому: или предшественники хрусталика и CE убиваются, оставляя открытой возможность, что хрусталиковая плакода может быть необходима для формирования радужки, или что хрусталик и CE имеют одни и те же предшественники. Из этого следует, что судьбы роговичного эпителия и хрусталиковой плакоды связаны сложным образом.

Этот вопрос всё ещё открыт: как и когда специфицируется судьба роговицы и впоследствии детерминируется? Др. словами, какие ступени участвуют в индукции роговичного эпителия и как они интегрируются с др. аспектами развития глаз? Здесь мы показали, что детерминация роговичного эпителия связана с формированием стромы и стабилизацией экспрессии Pax6, но что её спецификация происходит до появления хрусталиковой плакоды. Мы полагаем, что и CE и хрусталик возникают из общего пула предшественников и что финальное разделение между CE и хрусталиком происходит, когда периферическая глазная эктодерма не принимает более сигналов, ответственных за финальную фазу индукции хрусталика.

From eye ectodermal precursors at Hamburger and Hamilton (HH) stage 10 to committed corneal epithelium (CE) at embryonic day (E) 5. The Pax6 ectodermal cells which segregate from the Dlx5 nasal precursors at stage HH 8 (see Battachyyara et al., 2004) can be identified as ocular ectodermal precursors as they can give rise either to lens or corneal epithelium. During HH stage 14, the final lens bone morphogenetic protein (BMP) promoting event finishes. The commitment of CE starts by E5 and correlates with neural crest migration which forms the stroma and prevents Pax6 down-regulation. ce, corneal epithelium; end, endothelium; ivp, invaginating pit; le, lens; nr, neural retina; oc, optic cup; ov, optic vesicle; pr, pigmented retina; 1st, first stroma; st, stroma.

DISCUSSION

Эпителий роговицы и хрусталик возникают из эктодермы и обладают некоторыми др. важными характеристиками; они оба прозрачны и нуждаются в непрерывной экспрессии Pax6 даже у взрослых. Наши результаты в комбинации с др. работами демонстрируют, что спецификация хрусталика на ст. ранней гаструлы (rev. Streit, 2007), дает исчерпывающее объяснение развития роговичного эпителия от ранней спецификации к детерминации (commitment) (Fig. 6) и демонстрирует её онтогенетическое взаимоотношение с др. структурами глаз. Кроме того, мы также показали, что не только роговица, но и также инвагинация зрительного пузырька и развитие век у эмбрионов кур, не зависят морфогенеза хрусталика, как это имеет место в случае мышей (Zhang et al., 2008b; Swindell et al., 2008). Т.е. превращение зрительного пузырька в зрительный бокал происходит даже в отсутствие образования хрусталиковой плакоды, а веки формируются у эмбрионов кур, лишенных хрусталиков.

Commitment of Corneal Epithelium Correlates With Both the Loss of Its Capacity to Down-regulate Pax6 as Well as to the Formation of the Stroma in Chick, Similarly to Rabbit

Гетеротипические мезенхимно/эпителиальные рекомбинации, осуществленные на эмбрионах кур показали, что развитие CE птиц автономно от подлежащей стромы в течение нескольких дней перед её финальной дифференцировкой (Zak and Linsenmayer, 1985), но что её судьба всё ещё лабильна на 3-й день инкубации (Coulombre and Coulombre, 1971). Здесь мы подтвердили и расширили эти результаты, показав, что детерминация CE эмбрионов кур коррелирует с непрерывной экспрессией Pax6 и формированием стромы со ст. E5. Это имеет место только после детерминации роговицы, которая на первый взгляд кажется отличной от той, что мы наблюдали ранее у млекопитающих. В самом деле, на ранних стадиях у кроликов, т.е. E12.5 (Chaloin-Dufau et al., 1990), которая соответствует развитию глаз у эмбрионов кур ст. E3, CE млекопитающих способна непосредственно потерять свою спецификацию и развиться в эпидермис, если ассоциирована с компетентной дермой (Ferraris et al., 1994). Эта способность связана с быстрой (нескольких часов) потерей экспрессии Pax6, как это было показано здесь на курах и подтверждено на кроликах (E. Collomb, unpublished data). Напротив, на поздних стадиях развития у кроликов, т.e., после формирования стромы роговицы на ст. E17 (Chaloin-Dufau et al., 1990), последовательность образования эпидермиса отличается и осуществляется посредством процесса трансдифференцировки. Детерминация CE кроликов, диссоциированной от её стромы на ст. E20 (E. Collomb, unpublished data), на E23 (Ferraris et al., 1994) или взрослых (Ferraris et al., 2000; Pearton et al., 2005) , способна давать эпидермис, но только косвенно и после длительного периода (3 недели) ассоциации с кожными придатками, формирующими дермис, при всех возрастах проходятся одни и те же ступени и временной график. Во всех случаях, подавление регуляции Pax6 является предварительным условием для развития нового эпидермиса. Это подавление происходит только на участках базального слоя эпителия, которые пролиферируют, чтобы дать волосяные pegs, тогда как экспрессия Pax6 сохраняется в межфолликулярном базальном слое, а также во всех верхних эпителиальных слоях клеток (Pearton et al., 2005). Новый эпидермис, происходящий из новых стволовых клеток волоса (Pearton et al., 2005), который возникает как следствие образования волосяного peg (Nowak et al., 2008; S. Cadau, unpublished data). Повторное вступление клеток роговичного эпителия в клеточный цикл нуждается в потере активности Pax6 (Li and Lu, 2005) и это может быть предварительным условием для потери ими детерминации. Мы полагаем, что это может быть индуцировано с помощью инструкций от эмбриональных дермы у млекопитающих, у которых формирование волосяных плакод осуществляется с помощью клеточных делений. Это находится в контрасте с птицами, у которых формирование плакод перьев осуществляется посредством перестройки клеток и элонгации скорее, чем клеточных делений (Dhouailly, 1977). Это отсутствие повторного вступления в клеточный цикл может объяснить неспособность старого CE эмбрионов кур подвергаться той же самой трансдифференцировке, что у старой CE кроликов. Итак, когда формируется строма роговицы, то у млекопитающих, как и у птиц экспрессия Pax6, по-видимому, стабилизируется в эпителии роговицы, с этой точки зрения она может рассматриваться как детерминированная.

Corneal Stroma Is Involved in Stabilizing Pax6 Expression

CE играет доминирующую роль в приобретении не дермальной судьбы стромы, как ранее было показано на эмбрионах мыши. Он контролирует экспрессию нескольких генов в мигрирующей глазной мезенхиме (Matt et al., 2005), которые репрессируют передачу сигналов Wnt в этой мезенхиме (Kumar and Duester, 2010), инициальный фактор, способствующий развитию кожи (Chang et al., 2004). В обратном случае мы продемонстрировали здесь, что эмбриональная роговичная или лимбальная строма эмбрионов кур, также как и кроликов (our unpublished results), неспособна индуцировать экспрессию Pax6 в раннем одиночном слое эмбрионального дорсального эпидермиса. Напротив, несколько исследований изучали потенциал стволовых клеток-как эмбриональных, так и эпидермальных тканеспецифических или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-чтобы управлять выбором судьбы роговицы после воздействия окружения в виде роговичной стромы (among others: Homma et al., 2004; Ahmad et al., 2007; Blazejewska et al., 2009; Shalom-Feuerstein et al., 2012). Интересно, что последние авт. недавно показали, что кондиционированная роговичными фибробластами среда вызывает снижение miR-450b-5p, которая участвует в поддержании плюрипотентного состояния путем репрессии Pax6. Следовательно, эффект стромы роговицы может быть предупрежден подавлением Pax6 после того, как он был подключен во время ст. ранней нейрулы в головной эктодерме с помощью сложных взаимодействий генетических путей (for a review: Lang, 2004).

Lens Vesicle Has a Limited Role in Corneal Endothelium Morphogenesis, Mesenchymal Cell Migration, and Eye Growth

Мы показали, что у кур и мышей (Zhang et al., 2007) хрусталиковый пузырёк не нужен для последней ступени дифференцировки CE, как показывает экспрессия специфичного для роговицы keratin 12, но он является критическим для морфогенеза эндотелия роговицы. Это согласуется с наблюдением, что при врожденной афакии (отсутствие хрусталиков) у человека CE формируется, но строма роговицы не ограничивается эндотелием (Valleix et al., 2006). Мы подтвердили, что хрусталиковый пузырек обладает ингибирующим эффектом на раннюю миграцию клеток нервного гребня перед ст. E5 (Lwigale and Bronner-Fraser, 2009). Мы также подтвердили, что хрусталиковый пузырек имеет первостепенное значение для роста глаза. Поскольку хрусталики являются первичным источником способствующих росту FGF (rev. Govindarajan et al. 2000; Robinson, 2006), то удаление хрусталикового пузырька, хрусталиковой ямки или предупреждение образования хрусталика ведет соотв. к формированию маленьких, микрофталмичных или к отсутствию глаз.

Lens Pit or Lens Placode Are Not Required for Corneal Epithelium Specification

Хирургическое удаление хрусталиковой ямки, а также периферической эктодермы, покрывающей зрительный пузырек на HH ст. 14, приводит к возобновлению хрусталика в 70% случаев. Определенная ст. развития, повреждаемая во время HH ст. 14 может объяснить вариабельность результатов. Возможным объяснением является то, что в один особенный момент во время HH14, все потенциальные хрусталиковые клетки содержатся в объеме удаляемых клеток, или, скорее всего, что финальное событие, способствующее хрусталику, произошло. В самом деле, в 30% случаев, лишенные хрусталиков микрофталмичные глаза всё ещё формировали роговицы, может указывать на то, что остались некоторые "глазные эктодермальные предшественники".

Поскольку наше хирургическое удаление плакодной эктодермы на HH ст. 13 всегда приводило к возрождению хрусталика, то мы решили окончательно предупредить "события, способствующие хрусталиковой плакоде", обсужденные Sullivan et al., (2004). У эмбрионов кур хрусталиковые плакоды не образуются, если OV устранен (Kamachi et al., 1998), но в противоположность мышам, которые экспрессируют Bmp4 в OV (rev. Lang, 2004; Sullivan et al., 2004; Reza and Yasuda, 2004), Bmp4 экспрессируется только в преплакодной эктодерме (Trousse et al., 2001). Интересно, что распределение BMP рецепторов обнаруживается не только в преплакодной эктодерме, но и также в OV , по-видимому, одинаково у кур и мышей (among others: Furuta and Hogan, 1998; Trousse et al., 2001; Belecky-Adams et al., 2002). Более того, культура клеток эктодермальных предшественников глаз эмбрионов кур показала, что генерация клеток хрусталиков нуждается в непрерывном воздействии BMP (Sjodal et al., 2007; Pandit et al., 2011). Gremlin, как известно, соединяется с и ингибирует действие BMPs (among others: Hsu et al., 1998) и, кроме того, он специфически соединяется с белком предшественником BMP4 внутри клеток, это предупреждают продукцию зрелого BMP4 белка, и поэтому он действует как высоко эффективный внутриклеточный антагонист BMP4 (Sun et al., 2006). При избыточной экспрессии Gremlin в глазной поверхностной эктодерме мы ожидали предупреждение продукции BMP4 с помощью глазной эктодермы. Детальному анализу функции BMP путем изучения экспрессии глазного эктодермального гена, однако, мешала высокая летальность от манипуляций. Большинство погибших эмбрионов, однако, лишено хрусталиков, даже если присутствовали др. структуры глаз, а те, что доживали до ст. E14/E15 обнаруживали глаза лишенные хрусталиков с дифференцированным эпителием роговицы, экспрессирующим K12. Т.о., даже если формирование хрусталиковой плакоды предупреждено, формирование эпителия роговицы не останавливалось.

Corneal Epithelium Precursors Are Specified Early, Concurrently With Those of the Lens and Thus Constitute a Pool of Eye Ectodermal Precursors

Наши результаты находятся в согласии с предыдущими находками, показавшими, что потенциал образования хрусталика не ограничен эктодермой, обращенной к зрительному пузырьку, т.к. более широкая область эктодермы головы кур, экспрессирующая Pax6, способна к формированию хрусталика (Barabanov and Fedtsova, 1982; Bailey et al., 2006). Миграция клеток нервного гребня, которые экспрессируют Gremlin и Noggin (Bardot et al., 2001; Tzahor et al., 2003), как известно, ингибирует формирование хрусталиковой плакоды вне области глаза (Bailey et al., 2006). Их прибытие на периферию хрусталика может, т.о., вносить вклад в стабилизацию судьбы эпителия роговицы в этой эктодермальной области. Сходным образом, вследствие удаления хрусталика у головастиков Xenopus, роговичный эпителий реформируется в новый хрусталик (first described by Freeman [1963], обзор Henry and Tsonis [2010]), и для этого необходима передача сигналов BMP (Day and Beck, 2011).

Необходимо отметить, что у Xenopus роговица не полностью дифференцирована вплоть до окончания процесса метаморфоза, подтверждая, что возобновление хрусталика из эпителия роговицы, по-видимому, предупреждается у взрослых и старых головастиков за счет образования стромы (Reeve and Wild, 1981). У эмбрионов кур ранние эксперименты показали, что удаление плакодной эктодермы ранее HH ст. 13 (Hyer et al., 2003) ведет к невозможности образования хрусталика. Это находится в контрасте с тем, что наблюдалось в наших экспериментах, где наблюдалось образование новых хрусталиков. Мы полагаем, что группа Hyer удаляла не только эктодермальные клетки, четко детерминированные стать хрусталиком, но и также почти все из клеток, предназначенных давать роговичный эпителий. Удаление, осуществленное более крупно, чем у нас, почти половину головной эктодермы и плюс токсический эффект Nile blue, могут предупредить возобновление хрусталиковой плакоды. Более того, в большинстве их экспериментов (Hyer et al., 2003), рана оставалась открытой в ходе эксперимента.

В наших экспериментах, напротив, заживление раны происходило в 100% случаев, начиная непосредственно с момента эксцизии и завершалось в течение 6 ч. Принимая во внимание эти временные рамки, становится ясно, что эктодермальные клетки, запечатывающие рану приходят в результате миграции, а не пролиферации, т.к. на HH ст., близкой к 13, клетки эмбрионов кур пролиферируют со средней скоростью удвоения 12 ч (McMaster and Modak, 1977). Эта миграция позволяет эктодермальным клеткам доставлять к соседнему зрительному пузырьку во время, чтобы потенциально воспринимать любые оставшиеся сигналы, способствующие хрусталику, которые усиливают, среди прочих, экспрессию L-Maf , который необходим для выбора судьбы плакодных клеток (rev. Reza and Yasuda, 2004). Если нам удавалось удалить все клетки, предназначенные стать хрусталиком во время нашего удаления плакодной эктодермы, то это д. означать, что эти оставшиеся клетки, первоначально предназначенные стать роговичными эпителиальными клетками, могут обладать способностью давать как хрусталик, так и роговицу. Новый хрусталик т.о., не "регенерирует" в классическом смысле, а скорее происходит перераспределение оставшихся клеток пула предшественников, которые обычно вносят вклад в хрусталик и роговичный эпителий.

Conclusion (Fig. 6)

Мы полагаем, что большинство клеток, экспрессирующих Pax6, которые, как было установлено, сегрегируют от обонятельных предшественников на HH ст. 8 (Bhattachyyara et al., 2004), формируют общий пул клеток, которые, как полагаем, являются "глазными эктодермальными предшественниками", которые дают или хрусталик или роговичный эпителий, в зависимости от присутствия или отсутствия финального BMP сигнала, который способствует формированию хрусталиковой плакоды. Потеря передачи сигналов BMP при индукции формирования хрусталикового пузырька в комбинации с миграцией клеток нервного гребня, экспрессирующих ингибиторы BMP (Bardot et al., 2001; Tzahor et al., 2003), и продукцией ретиноевой кислоты (Matt et al., 2005), которая, как известно, мешает передаче сигналов BMP (Shenga et al., 2010), это может вносить вклад в стабилизацию судьбы роговичного эпителия. Наши результаты подтверждают предыдущую "refracton hypothesis" (Piatigorsky, 2001), которая утверждает, что сходные генетические программы могут быть ответственны за развитие хрусталика и роговичного эпителия. Фактически, CE обладает той же самой программой с хрусталиковой эктодермой вплоть до почти конца: спецификация CE является по-существу предпоследней степенью спецификации хрусталика. Наконец, мы показали, что после становления ранней спецификации в качестве глазных эктодермальных предшественников и сохранения этого состояния после формирования хрусталиковой плакоды, роговичный эпителий наконец-то детерминируется на стадии образования стромы, т.к. детерминируется за счет сохранения своей прирожденной передачи сигналов Pax6.

The Corneal Epithelium and Lens Develop Independently From a Common Pool of Precursors Elodie Collomb, Ying Yang, Sarah Foriel, Sebastien Cadau, David J. Pearton, Danielle Dhouailly Developmental Dynamics Volume 242, Issue 5, pages 401–413, May 2013

The Corneal Epithelium and Lens Develop Independently From a Common Pool of Precursors
Elodie Collomb, Ying Yang, Sarah Foriel, Sebastien Cadau, David J. Pearton, Danielle Dhouailly
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 5, pages 401–413, May 2013