Эпителий кишечника характеризуется быстрым и непрерывным обновлением в течение всей жизни. Одним из главных игроков, участвующих в обновлении эпителия кишечника является канонический путь передачи сигналов Wnt. Экспериментальные манипуляции с передачей сигналов Wnt показали его влияние на пролиферацию эпителия в кишечнике (Korinek et al., 1998; Pinto et al., 2003; Kuhnert et al., 2004; Sansom et al., 2004; Andreu et al., 2005; Fevr et al., 2007). Напр., инактивация передачи сигналов Wnt с помощью трансгенной или аденовирусной экспрессии Dickkopf1 (Dkk1), секретироемого ингибитора Wnt, ведет к заметному подавлению пролиферации эпителия в кишечнике (Pinto et al., 2003; Kuhnert et al., 2004). Напротив, две независимые группы продемонстрировали, что потеря Apc ведет к быстрому и драматическому увеличению компартмента крипт, связанному с аномальной клеточной пролиферацией в тонком кишечнике (Sansom et al., 2004; Andreu et al., 2005). Итак, эти эксперименты предоставляют определенные доказательства важности передачи сигналов Wnt в контроле пролиферации эпителия кишечника.

Помимо контроля пролиферации клеток предположена роль передачи сигналов Wnt/β-catenin в поддержании стволовых клеток в кишечнике. Инактивация передачи сигналов Wnt за счет избыточной экспрессии Dkk1 или кондиционной делеции Ctnnb1 (гена, кодирующего β-catenin) ведет к потере кишечных крипт, показывая, что передача сигналов Wnt обязательна для поддержания стволовых клеток (Pinto et al., 2003; Kuhnert et al., 2004; Fevr et al., 2007). Фактически intestinal stem cell (ISC) маркер Lgr5 был первоначально идентифицирован как мишень для транскрипции β-catenin/Tcf (Barker et al., 2007), это находится в согласии с мнением, что ISCs обладают более высокой активностью канонической передачи сигналов Wnt. Накопление в ядрах β-catenin наблюдалось в основании крипт в клетках, которые потенциально включают ISCs (van de Wetering et al., 2002).

Количество ISCs тонко регулируется в кишечных криптах, чтобы гарантировать оборот ткани, но предупредить аномальный рост. ISCs обычно участвуют в процессе гомеостатического самообновления во взрослом кишечнике, но могут также быстро рекрутироваться для репарации ткани после повреждения. Косвенные доказательства участия передачи сигналов Wnt в умножении стволовых клеток получены в исследовании дефицита PTEN, увеличивающего частоту разделения и почкования крипт и количества клеток, экспрессирующих Musashi1, предполагаемый маркер ISC, посредством активации передачи сигналов Wnt (He et al., 2007). Однако лежащий в основе механизм, с помощью которого активация передачи сигналов Wnt может увеличивать количества ISCs, остается неясным, прямые доказательства, что усиление передачи сигналов Wnt достаточно для экспансии стволовых клеток в кишечнике взрослых, отсутствуют.

Разрушение канонической передачи сигналов Wnt обнаруживается в большинстве раков толстой кишки. Мутации в APC или CTNNB1 являются инициирующим событием в трансформации эпителиальных клеток колона, ведущим к постоянной активности передачи сигналов Wnt. Не смотря на присутствие активирующих мутаций для передачи сигналов Wnt, колоректальные раки обнаруживают клеточную гетерогенность в отношении накопления β-catenin в опухолевой массе. Иммуногистохимические исследования показали, что накопление в ядрах β-catenin, признак активности передачи сигналов Wnt, наблюдается в субнаборе опухолевых клеток толстой кишки (Brabletz et al., 2001; Jung et al., 2001; Fodde and Brabletz, 2007). Более того, недавнее исследование показало, что опухолевые клетки колона с высокой активностью передачи сигналов Wnt, обнаруживают признаки раковых стволовых клеток (Vermeulen et al., 2010), это подчеркивает необходимость в дальнейшем исследовании зависимого от дозы эффекта передачи сигналов Wnt на эпителиальные клетки кишечника.

Известно, что активация канонической передачи сигналов Wnt является доминирующей силой в поддержании гомеостаза кишечника, др. сигнальные каскады, такие как Notch, BMP и PI3 каскады, участвуют в контроле пролиферации эпителиальных клеток и обороте стволовых клеток (Scoville et al., 2008). Однако неясно, как эти сигнальные каскады интегрируют с передачей сигналов Wnt в кишечном эпителии, чтобы контролировать оборот стволовых клеток и регенерацию эпителия. Предполагается, что разные сигнальные каскады действуют иерархическим способом и регулируют др. др.

Используя новых β-catenin-индуцибельных модельных мышей, мы показали, что повышенные уровни активированного β-catenin индуцируют образование de novo крипт, но снижают пролиферацию эпителиальных клеток среди предшественников. Однако комбинированная избыточная экспрессия β-catenin и ингибирование Notch превращают эти медленно делящиеся клетки в пролиферирующие клетки. Эти результаты указывают, что передача сигналов β-catenin выполняет двойную роль по контролю регенерации кишечных клеток с помощью (1) обеспечения формирования крипт и (2) активации пролиферации клеток в кооперации с передачей сигналов Notch.

DISCUSSION

Предыдущие исследования с использованием кондиционных Apc нокаутных мышей продемонстрировали, что острая потеря гена Apc быстро увеличивает количества клеток предшественников в кишечных криптах (Sansom et al., 2004; Andreu et al., 2005), но это не приводит к разделению и ветвлению крипт, указывая тем самым, что активация Wnt благодаря потере Apc недостаточна, чтобы индуцировать образование крипт de novo. Мы показали, что высокие уровни активации β-catenin достаточны для формирования крипт de novo у взрослых мышей (Fig. 2). Наши наблюдения подтверждают, что активация β-catenin умножает количества ISCs, это согласуется с недавним исследованием на задней кишке дрозофилы (Takashima et al., 2008). Расхождение между предыдущими сообщениями и нашим исследованием, по-видимому, возникают из-за различий в уровнях активации Wnt. Фактически с помощью снижения уровней активированного β-catenin, мы также оказались неспособны индуцировать de novo формирование крипт, но вместо этого увеличивался в криптах компартмент пролиферирующих предшественников (Fig. 5A). Эти комбинированные находки строго подтверждают, что высокие уровни канонического Wnt эффектора β-catenin необходимы для экспансии ISC, тогда как низкие уровни активации могут индуцировать активную пролиферацию клеток предшественников. Это мнение согласуется с недавней находкой, которая продемонстрировала, что разные уровни передачи сигналов Wnt выполняют разные роли в потенциале самообновления и дифференцировки гематопоэтических стволовых клеток (Luis et al., 2011).

Мнение, что формирование de novo крипт и клеточная пролиферация контролируются разными уровнями активности β-catenin напоминает предыдущие наблюдения в нашей лаб. с туморогенезом в две стадии у ApcMin/+ мышей (Yamada et al., 2002; Oyama et al., 2008). В толстом кишечнике ApcMin/+ мышей мы обнаружили множество микроаденом, начиная с возраста 3-х недель, из которых только ограниченное количество прогрессировало в крупные опухоли. Хотя ранние микроаденомы уже обозначают частую потерю Apc и повышенную транскрипцию β-catenin/Tcf, крупные опухоли обнаруживают дальнейшее увеличение транскрипционной активности β-catenin/Tcf, это подтверждает, что передача сигналов β-catenin/Tcf необходима для развития крупных опухолей. Зависимый от дозы эффект активации Wnt на туморогенез в кишечнике был также отмечен у мышиных моделей с разными гипоморфными Apc мутантными аллелями, подтверждая потребность в высоких уровнях активации Wnt для туморогенеза в кишечнике (Gaspar and Fodde, 2004). Серия предыдущих исследований продемонстрировала, что эпигенетические модификации, ассоциированные с метилированием ДНК, участвуют в переходе от микроаденом к крупных опухолям у ApcMin/+ мышей (Yamada et al., 2005; Lin et al., 2006; Linhart et al., 2007). При колоректальном раке у человека, как было установлено, эпигенетическое замалчивание SFRPs, негативных модификаторов передачи сигналов Wnt, обнаруживается часто и такое инактивирование может ещё больше активировать каноническую передачу сигналов Wnt в линии рака клеток из колона с мутациями APC или CTNNB1 (Suzuki et al., 2004). Вполне возможно, что активация канонической передачи сигналов Wnt за счет генетических и эпигенетических альтераций позволяет стволовым клеткам толстой кишки расширять свою площадь, приводя к формированию крипт de novo, что в конечном результате приводит к опухолевому росту.

Ряд сигнаьных каскадов участвует в поддержании гомеостаза в кишечнике (Scoville et al., 2008), но остается неясным, как путь передачи сигналов Wnt соединен с др. сигнальными каскадами в кишечнике, чтобы контролировать гомеостаз. Мы установили, что каноническая передача сигналов Wnt играет важную роль в формировании крипт de novo в толстой кишке и что высокий уровень активации β-catenin является критическим для активации Notch. Наша находка, что ингибирование Notch предупреждает разделение и ветвление крипт в β-catenin-индуцированной толстой кишке указывает на необходимость в активации Notch при β-catenin-индуцированном формировании крипт de novo (Fig. 4G; supplementary material Fig. S8A). Интересно, что активация β-catenin быстро вызывает активацию транскрипции Notch лигандов Jag1 и Jag2, и Notch рецепторов Notch1 и Notch2 (Fig. 4B, Fig. 5B), тем самым открывается возможность непосредственной связи между этими двумя путями. Вместе с предыдущими находками, что β-catenin индуцирует транскрипцию Jag1, приводя к активации Notch в линии раковых клеток колона человека (Rodilla et al., 2009), становится очень возможным, что повышенная экспрессия Notch лигандов с помощью β-catenin индукции, вызывает активацию Notch в эпителии толстой кишки. Более того, недавнее исследование продемонстрировало, что Notch1 и Notch2 рецепторы экспрессируются специфически в ISCs (Fre et al., 2011; Sato et al., 2011). Повышенная экспрессия Notch рецепторов д. играть роль в индукции ISC-подобных клеток с помощью индукции β-catenin (Fig. 4B). Заслуживает также внимания, что постоянная активность Notch не вызывает явных эффектов на локализацию в ядрах β-catenin (Fre et al., 2005). Эти находки демонстрируют иерархические взаимоотношения между сигнальными путями Wnt и Notch в кишечном эпителии. Такая иерархия могла бы объяснить, почему генетические альтерации в раке толстой кишки часто обнаруживаются в сигнальном пути Wnt, но не в Notch сигнальном пути.

Непригодность большинства современных терапевтических подходов к лечению рака ведет к гипотезе, что воздействия, нацеленные на злокачественную пролиферацию не затрагивает медленно делящиеся раковые стволовые клетки. Здесь высоки уровни активации Wnt индуцировали формирование крипт de novo и заставляли клетки крипт приобретать свойства медленного деления. Интересно, что наше наблюдение индуцированных с помощью β-catenin свойства медленного деления, согласуется с предыдущими сообщениями по колоректальным опухолям человека. Колоректальные раки человека обнаруживают гетерогенность внутриклеточного распределения β-catenin, а опухолевые клетки с накоплением в ядрах обнаруживают низкие уровни клеточной пролиферации (Brabletz et al., 2001; Fodde and Brabletz, 2007). Мы также установили, что опухоли толстой кишки у ApcMin/+ мышей состоят из гетерогенных клеток, обладающих разными уровнями накопления β-catenin и экспрессии нижестоящих генов (Fig. 6A), а опухолевые клетки с ядерным содержанием β-catenin делятся более мдленно, чем окружающие опухолевые клетки, подтверждая, что такие клетки сходны с клетками на дне крипт нормальной толстой кишки. Поэтому мы предположили, что иерархический контроль пролиферации клеток в эпителии крипт колона сохраняется до некоторой степени в новообразованиях колона. Соотв. мы нашли, что опухолевые клетки с ядерным β-catenin сопровождаются высокой передачей сигналов Notch (Fig. 6D), как это описано для клеток основания крипт (Kayahara et al., 2003). Интересно отметить, что γ-secretase ингибитор, превращает медленно делящиеся клетки в активно пролиферирующие клетки (Fig. 4C-G; supplementary material Fig. S7A). Предыдущее исследование показало, что Notch ингибиторы превращают недифференцированные, пролиферирующие клетки в молчащие клетки колоректальных новообразований (van Es et al., 2005), указывая, что Notch ингибитор может быть терапевтическим средством при колоректальных раках. Расхождения в эффектах Notch ингибитора может быть объяснено различиями в состояниях затронутых клеток между пролиферирующими клетками предшественников и ISC-подобными клетками. Хотя предыдущие исследования обнаружили эффекты на переход пролиферирующих клеток в окончательно дифференцированные молчащие клетки, наши данные подтверждают, что Notch ингибитор может способствовать переходу медленно делящихся ISC-подобных клеток в клетки предшественники в колоне. Принимая во внимание химиорезистентность медленно делящихся раковых стволовых клеток, то результаты также подтверждают, что Notch ингибиторы в комбинации с химиотерапевтическими агентами и/или иррадиацией могут быть эффективными для лечения медленно делящихся раковых стволовых клеток в колоне.

Итак, хотя пролиферирующие клетки предшественники в криптах колона физиологически экспрессируют высокие уровни β-catenin/Tcf транскриптов, дальнейшая активация канонической передачи сигналов Wnt ведет к формированию крипт de novo, это согласуется с относительно медленно делящимися клетками взрослого колона, что сопровождается активацией передачи сигналов Notch с трансактивацией Notch лигандов и рецепторов. Однако воздействие Notch/γ-secretase ингибитора превращает такие медленно делящиеся клетки в пролиферирующие клетки, хотя мы не можем исключить возможность, что некоторые из наблюдаемых фенотипов являются результатом супер физиологической экспрессии β-catenin, получаемой в нашей трансгенной системе. Эти находки подтверждают, что передача сигналов Wnt и Notch действуют синергично и иерархически, чтобы контролировать дифференцировку и пролиферацию эпителия крипт колона in vivo.