Из четырех Hoxd генов, экспрессирующихся скоординированным образом во время развития аутопода (Hoxd10-Hoxd13), только Hoxd13,как было установлено, выполняет существенно важную функцию, поскольку его инактивация c помощью инсерционной стратегии генерирует сильные фенотипические отклонения пальцев (Dolle et al., 1993; Davis and Capecchi, 1996). Мутации потери функции или Hoxd12 или Hoxd11 лишь слегка затрагивают окончания конечностей (Davis and Capecchi, 1996; Kondo et al., 1996). Кроме того, присутствие во всех этих аллелях селекционной кассеты вместе с их промотором приводит к определенному функциональному заключению о трудности обнаружения, связанного с потенциальными взаимодействиями, напр., с Hoxd13. Однако комбинированная инактивация в цис-положении Hoxd13, Hoxd12 и Hoxd11 делает дистальные фенотипические отклонения более тяжелыми, чем только инактивация Hoxd13 (Zakany and Duboule, 1996), указывая тем самым на существенную функцию или Hoxd12, Hoxd11 или обоих на продукции пальцев. Это заключение были повторно исследовано на фенотипах мышей, лишенных всего кластера генов HoxD (Spitz et al., 2001), которые, как и ожидалось, слегка более тяжелые, чем у мышей без только Hoxd13 - Hoxd11.

Однако классические мутации потери функции в этих "задних" Hoxd генов (инсерционные мутации, напр.) генерируют фенотипические эффекты, отличающиеся от тех, которые были получены после полной делеции того же самого локуса (Kmita et al., 2002a). Этот кажущийся парадокс был объясненни тем фактом, что делеция генов из кластера HoxD иногда ведет к перезамещению регуляции и следовательно, к избыточной функции соседних генов. Напр., делеция локуса Hoxd13 вызывает сильную избыточную активацию экспрессии Hoxd12 в развивающихся пальцах, который способен почти полностью компенсировать потерю функции Hoxd13 (Kmita et al., 2002a). Напротив, сходная избыточная функция Hoxd11 оказывает повреждающий эффект на морфологию пальцев, поскольку она запускает добавочные хондрогенные конденсаты. Кроме того, делеция всего кластера HoxD также включает такие гены, участвующие в формообразовании более проксимальных частей конечностей и поэтому она может вмешиваться в раннюю фазу экспрессии генов Hoxd (Tarchini et al., 2006), с потенциалом последующего воздействия на морфологию пальцев вне какой-либо связи со специфическими функциями генов Hoxd13-Hoxd10.

Мы наблюдали такие делеции задних Hoxd генов, которые не сопровождались избыточностью функции какого-либо соседнего гена, в частности, Hoxd13, поскольку последний,как было установлено, во многих примерах вызывает доминантный негативный эффект на функции др. Hoxd генов ("posterior prevalence"; Duboule and Morata, 1994). Соотв. клетки, экспрессирующие строго Hoxd13 , как было установлено ранее, теряют функцию, напр., группы 11 Hox генов (van der Hoeven et al., 1996), даже в присутствии нормальных количеств транскриптов Hox группы 11.

С помощью различных делеционных линий мы оценивали в данном исследовании некоторые, ведущие к ранней избыточной функции Hoxd13. Механизм, вызывающий эти избыточные функции, однако твердо следует определенной ясно очерченной логике; напр., del(9-12) вызывает сильную избыточную функцию Hoxd13, тогда как делеция del(10-12) не оказывает эффекта. Можно сделать вывод, что нечто ассоциирует в точками разрывов вблизи Hoxd10, предупреждая Hoxd13 от преждевременной активации (see Fig. 1). Однако, избыточная функция Hoxd12 при обеих делециях del(9-11) и del(10-11), подтверждает,что в данном случае точка разрыва Hoxd10 не влияет на избыточность функции каким-либо образом. Также все точки разрывов, расположенные непосредственно ниже Hoxd12, по-видимому, влияют негативно на транскрипцию этого последнего гена, подтверждая, что последовательности. участвующие в этом процессе д. быть расположены далее к теломере в кластере генов.

Теперь независимо от того как и где возникает преждевременная активация Hoxd13, она не поддерживается впоследствии. Это согласуется с наблюдением и с концепцией заднего превалирования, эта временная избыточная функциия транслируется в легкое укорочение длинных костей, преимущественно плечевых. Огромное большинство таких клеток, присутствующих в ранних зачатках конечностей у эмбрионов, начиная со ст. E9.5, в самом деле рассматривается, как детерминированное стать частью stylopod, т.e., проксимальных частей конечностей, из которых конденсируется и развивается плечо (see references in Tabin and Wolpert, 2007). Раннее пульсовое воздействие Hoxd13 может т.о., преимущественно затрагивать такие клетки и генерировать аномальный фенотип в отношении длины плеча. Соотв. при рождении радиальная и локтевая кости оказывались менее затронутыми, чем плечевая кость, лишь с незначительным, но достоверным уменьшением длины. Однако взрослые конечности обнаруживали сходное укорочение zeugopod, указывая тем самым, что рост и развитие костей конечностей может не следовать одной и той же динамике в разных частях конечностей. Было также показано, фенотипы костей при рождении могут не полностью отражать их состояние у взрослых. Поскольку не совсем ясно, как задние HOXD белки могут влиять на длину костей, их участие в формировании длинных костей посредством кортикальной оссификации хорошо изучено, также ка и их экспрессия в ростовой пластинке (Zakany and Duboule, 1996; Villavicencio-Lorini et al., 2010).

Интересно, что фенотипы, наблюдаемые при рождении, т.е. после аномальной транскрипции или Hoxd13 или Hoxd12 завершались, указывая на то, что негативный эффект этих белков не может быть скомпенсирован или скорректирован во время остальной части беременности. Точно также, если в результате чего-нибудь фенотипическое отклонение оказывалось усиленным у взрослых, по сравнению с новорожденными, скорее, чем ослабленным. Следовательно, короткий транскрипционный взрыв Hoxd13, происходящий на 9.5 день развития, будет влиять на клетки зачатка конечности способом, который будет поддерживаться в течение всего развития, вплоть до взрослой стадии. Одна из возможностей среди прочих заключается в том, что размер пула клеток, доступных для развития мезенхимных конденсатов, предшественников zeugopod, был редуцирован доминантно-негативным эффектом этого белка в противовес др. HOX белкам, необходимым для поддержания роста и возобновления пула. Во всяком случае, тот факт, что короткий взрыв эктопической экспрессии Hoxd13 может приводить к таким фенотипическим эффектам у взрослых, демонстрирует абсолютную необходимость в предупреждении его экспрессии в проксимальных частях развивающихся зачатков конечностей, по крайней мере, у тех тетрапод, у которых длинные zeugopod обнаруживают адаптивную ценность. С д. стороны, незначительная неправильная регуляция этого гена может быстро приводит к редукции zeugopod, морфологии, которая обнаруживается у многих тетрапод, напр., у тюленей.

Из всех трех делеций, использованных в данной работе, только del(10-12) не обнаруживала каких-либо следов преждевременной активации Hoxd13 в ранних зачатках конечностей. Соотв. размер плеча у взрослых был нормальным. Напротив, легкое укорочение наблюдалось для костей zeugopod (радиальной и локтевой), которые были очень близки к норме при рождении (98% от нормальной длины) и всё ещё достоверно короче у взрослых (96% от дикого типа). Это, скорее всего, обусловлено потерей функции и Hoxd10 и Hoxd11 в растущих конечностях. Функциональная инактивация каждого из генов в отдельности не вызывает какой-либо сильной редукции в размере радиальной и локтевой кости (Davis and Capecchi, 1994; Carpenter et al., 1997). Однако комбинированная инактивация Hoxd11 и Hoxa11 ведет к почти полной потере этих двух костей, указывая тем самым, что ключевой функциональный вклад вносит группа 11 Hox генов в построение zeugopod (Davis et al., 1995). Как и в большинстве др. проанализированных случаев эффекты, наблюдаемые в костях задних конечностях были сравнимы, хотя в целом и были менее выраженными.

Разнообразные эффекты этих делеций на морфологию пальцев служат примером уменьшения размеров как метакарпальной кости пальца II, так и первой фаланги (P1) пальца II (Table 1), которые повреждены у всех трех Hoxd11, Hoxd12, и Hoxd13 "обычных" мутантных мышей (Dolle et al., 1993; Davis and Capecchi, 1996). В этом случае, потенциальная избыточность функции Hoxd13 не должна вмешиваться, т.к. autopod , по крайней мере, частично тем самым местом, де этот ген обычно экспрессируется. Кроме того, изменчивость транскриптов Hoxd13 в некоторых из этих делеций едва заметно, если была вообще (Montavon et al., 2008). Сравнение между делециями del(10-12) и del(11-12) показало, что Hoxd10 , скорее всего, играет роль в присутствии Hoxd13 поскольку его эффект на на длину костей был при этом достоверно ухудшался. Сходным образом, сравнение между del(9-11) и del(9-12) подтвердило, что Hoxd12, в самом деле, участвует в росте пястных костей (на 10% короче, когда отсутствует Hoxd12). Поскольку Hoxd11, как было установлено, также влияет на развитие пальцев (Davis and Capecchi, 1994), то напрашивается вывод, что все четыре Hoxd гена повторно экспрессируются во время развития аутопода, участвуя в формировании финального паттерна.

Однако, как упоминалось выше, Hoxd10 не обнаруживает сопоставимого фенотипа, когда все остальные гены остаются функциональными (Carpenter et al., 1997), а потеря функции Hoxd12 вызывает минорные дефекты в пальцах II и V (Davis and Capecchi, 1996; Kondo et al., 1996). Это может быть обусловлено компенсаторным эффектом соседних генов, связанное с регуляторными re-allocations (Kmita et al., 2002a; Montavon et al., 2008). В этом случае, Hoxd10 и Hoxd12, в дополнение к Hoxd11, должны, в самом деле, обладать существенной функцией во время развития пальцев. Альтернативно, эти функциональные потребности могут быть выявлены только тогда, когда используются в искусственном, опосредованном физиологически, контексте. Др. словами, тот факт, что в наших мутантных условиях делеции как Hoxd11, так и Hoxd12 в цис-положении вызывают аномальные фенотипы пальцев даже в присутствии Hoxd13, не обязательно означает, что инактивация обоих генов в цис-положении (напр., путем внесения стоп кодона) будет давать тот же самый фенотип. Пока эти результаты дополняют те, что получаются, когда Hoxd13 делетирован вместе с соседними генами (e.g., Zakany and Duboule, 1996) это означает, что, скорее всего, все Hoxd12, Hoxd11 и Hoxd10 гены экспрессируются совместно в дистальных частях зачатка во время развития пальцев, участвуя в финальной морфологии, чтобы дополнить выдающуюся функцию Hoxd13.

Hoxd9, с др. стороны, который является последним геном серии, экспрессируемой во время развития пальцев, по-видимому, не играет роли в этом. Скорее всего, подобно дю. генам группы 9 Hox, он организует более проксимальные структуры, включая часть поля конечности (Xu and Wellik, 2011). Сравнение пар делеций с или без Hoxd9, таких как del(9-12) с del(10-12), или del(9-11) с del(10-11), не выявило каких-либо достоверных модификаций морфологии пальцев, что согласуется с отсутствием родственного фенотипа у мышей, мутантных по этому гену, даже при комбинации с аллелем Hoxa9 (Fromental-Ramain et al., 1996a). Это не удивительно, учитывая очень небольшое количество мРНК Hoxd9, обнаруживаемое во время развития пальцев, если сравнивать с мРНК Hoxd13, Hoxd12 или Hoxd11 (Montavon et al., 2008).