Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ПАЛЬЦЕВ

Роль неогенеина

Neogenin regulates sonic hedgehog pathway activity during digit patterning
Mingi Hong, Karen A. Schachter, Guoying Jiang, Robert S. Krauss
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 3, pages 627–637, March 2012

Background: Digit patterning integrates signaling by the Sonic Hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), и bone morphogenetic protein (BMP) pathways. GLI3, a component of the SHH pathway, is a major regulator of digit number и identity. Neogenin (encoded by Neo1) is a cell surface protein that serves to transduce signals from several ligands, including BMPs, in various developmental contexts. Although neogenin is implicated in BMP signaling, it has not been linked to SHH signaling и its role in digit patterning is unknown. Results: We report that Neo1 mutant mice have preaxial polydactyly with low penetrance. Expression of SHH target genes, but not BMP target genes, is altered in Neo1 mutant limb buds. Analysis of mice carrying mutations in both Neo1 и Gli3 reveals that, although neogenin plays a role in constraint of digit numbers, suppressing polydactyly, it is also required for the severe polydactyly caused by loss of GLI3. Furthermore, embryo fibroblasts from Neo1 mutant mice are sensitized to SHH pathway activation in vitro. Conclusions: Our findings indicate that neogenin regulates SHH signaling in the limb bud to achieve proper digit patterning. Developmental Dynamics 241:627–637, 2012. © 2012 Wiley Periodicals Inc.

Рисунки к статье

Развитие зачатков конечностей позвоночных это сложный процесс, использующий интеграцию множественных сигнальных путей из пространственно-временных сетей обратной связи (Tickle,2006; Zeller et al.,2009). Sonic hedgehog (SHH) играет критическую роль в формировании паттерна передне-задней оси развивающегося зачатка конечности, специфицируя количества и качественные особенности пальцев (палец 1 является самым передним, а палец 5 самым задним у мышей; Tickle,2006; Zeller et al.,2009). SHH продуцируется с помощью зоны поляризующей активности (ZPA), группы мезенхимных клеток на заднем крае зачатка конечности и диффундирует кпереди в виде градиента. Генетический и клональный анализ на мышах и курах привел к модели, согласно которой палец 1 образуется независимо от SHH, палец 2 и часть пальца 3 специфицируются паракринным способом за счет низких концентраций SHH, продуцируемого с помощью ZPA, и часть палаьца 3 и пальцы 4 и 5, происходят из производных клеток самой ZPA, в зависимости от аутокринной передачи сигналов SHH (Harfe et al.,2004; Scherz et al.,2007). Помимо ранней роли в спецификации качественных осбенностей пальцев SHH в дальнейшем оказывается необходим для клеток предшественников пальцев, чтобы они пролиферировали в хрящевые конденсаты (Towers et al.,2008; Zhu et al.,2008). Рост зачатков конечностей вдоль проксимо-дистальной оси зависит от передачи сигналов fibroblast growth factor (FGF) апикальым эктодермальным гребнем (AER) на дистальном кончике зачатка конечности (Tickle,2006; Zeller et al.,2009). Петли позитивной обратной связи, которые интегрируют передачу сигналов FGF из AER, передачу сигналов SHH из ZPA, и передачу сигналов bone morphogenetic protein (BMP) в мезенхиме и AER координируютразвитие множественных осей конечностей (Tickle,2006; Zeller et al.,2009).
SHH активирует сигнальную трансдукцию благодаря связыванию его со своим первичным трансмембранным рецептором PTCH1, устраняющего ингибирование сигнальной функции второго трансмембранного белка, Smoothened (SMO; for reviews, see Jiang и Hui,2008; Varjosalo и Taipale,2008). Передача сигналов с помощью SMO запускает каскад, который приводит к экспрессии генов мишеней посредством семейства транскрипционных факторов GLI. В отсутствие лиганда GLI3 (и в меньшей степени GLI2) подвергаются протеолитическому преобразованию, чтобы давать укороченный белок, который действует как репрессор пути генов мишеней. Передача сигналов SHH пути приводит к супрессии протеолиза GLI и действует GLI2 полной длины (и в меньшей степени GLI3), чтобы активировать путь генов мишеней. Среди мишеней находятся и сами Gli1 и Ptch1. Передача сигналов SHH регулируется также с помощью белков клеточной поверхности CDO, BOC и GAS1, которые выполняют перекрывающиеся функции как ко-рецепторы с PTCH1 и, по-видимому, сенсибилизируя клетки в онтогенетическом поле к данному уровню лиганда (Kang et al.,2007; Allen et al.,2011; Bae et al.,2011; Izzi et al.,2011; Zhang et al.,2011).
Регуляция процессинга GLI3 является критическим аспектом функции SHH в формировании паттерна пальцев. Высокие уровни репрессора GLI3 присутствуют в переднем регионе зачатка конечности, который не дает пальцев, и низкие уровни присутствуют в заднем регионе, из которого развиваются пальцы (Tickle,2006; Zeller et al.,2009). Мыши, лишенные GLI3 обнаруживают полидактилию, имеея от 6 до 8 пальцев на конечность, которые лишены четких качественных особенностей. Более того, Gli3;Shh двойные мутанты имеют тот же самый фенотип пальцев, что и мутанты Gli3, демонстрируя тем самым, что основная часть действия SHH в развитии конечностей связана с ингибированием формирования GLI3 репрессора и что сам по себе SHH не нужен для возникновения полидактилии, связанной с потерей GLI3 (Litingtung et al.,2002; te Welscher et al.,2002).
Преаксиальная полидактилия (дополнительный большой палец на передней стороне) является частой врожденной аномалией в популяции человека, возникающей ~1 на 2000 родов (Hill,2007). Мутации в нескольких отличающихся генах у мыши ведут к преаксиальной полидактилии и общим свойством таких мутантов является образование эктопического, переднего сигнального центра SHH, который приводит к экспрессии обычно ограниченных задней частью генов и к генерации добавочных пальцев (Hill,2007). Среди генов, чьи мутации вызывают преаксиальную полидактилию, находятся Gli3 (Extra-toes), Alx4 (Strong's luxoid [lst]) и Bmp4 (Hui и Joyner,1993; Dunn et al.,1997; Qu et al.,1997).
Neogenin является трансмембранным белком клеточной поверхности с 4 Ig доменами и 6 доменами fibronectin type III (FnIII) в своей внеклеточной области и участвует в различных физиологических процессах. Neogenin служит в качестве первичного рецептора для netrins и repulsive guidance molecules (RGMs), чтобы регулировать ведение аксонов и др. процессы во время развития ЦНС (De Vries и Cooper,2008). Neogenin также связывает BMPs и RGMs, чтобы регулировать передачу сигналов BMP рецептора в развитии эндохондральных костей и метаболизме железа (Lee et al.,2010; Zhou et al.,2010; Hagihara et al.,2011). Наконец, передача сигналов netrin-neogenin способствует скелетному миогенезу, при котором neogenin, по-видимому, работает как часть комплекса с мультифункциональным ко-рецептором, CDO (сам Ig/FnIII белок и SHH ко-рецептор; Kang et al.,2004; Bae et al.,2009). Neogenin, следовательно, выполняет множественные онтогенетические роли зависимым от контекста образом. Здесь мы описали др. функцию neogenin, в формировании паттерна конечности и пальцев. Показано, что neogenin регулирует формирование паттерна конечностей и пальцев посредством взаимодействий с путем SHH.

DISCUSSION


Формирование паттерна конечностей и пальцев управляется взаимодействиями между путями SHH, BMP и FGF (Tickle,2006; Zeller et al.,2009). Мутации в специфических компонентах или регуляторах этих путей ведут дефектам формирования паттерна, таким как полидактилия. Здесь мы установили роль Neo1 в формировании паттерна конечностей и пальцев и в качестве генетического модификатора Gli3, который кодирует компонент пути SHH и является критическим регулятором количества и качественных особенностей пальцев.
Neogenin является многофункциональным рецептором клеточной поверхности. Он обладает крупным эктодеменом, одиночным трансмембранным регионом и длинным цитоплазматическим хвостом. Он служит в качестве первичного рецептора для netrins и RGMs в развитии ЦНС, а соединение этих лигандов с эктодоменом neogenin приводит к ассоциации цитоплазматического хвоста с сигнальными белками и последующей сигнальной трансдукции (De Vries и Cooper,2008). RGMs также действуют как BMP ко-рецепторы и как neogenin так и RGMs соединяются непосредственно с BMPs (Corradini et al.,2009; Hagihara et al.,2011). Более того, neogenin способствует передаче сигналов BMP во время хондрогенеза костей конечностей (Zhou et al.,2010). Мы установили, что ~15% мышей, гомозиготных по мутации gene-trap в Neo1, имеют преаксиальную полидактилию правой задней конечности. Bmp4+/- имели очень похожий фенотип, включая как специфичность для правой задней конечности, так и низкую пенетратность (Dunn et al.,1997). Единственная логичная возможность, следовательно, заключается в том, что neogenin способствует передаче сигналов посредством BMPs, и что Bmp4+/- и Neo1Gt/Gt мыши имеют эквивалентные сигнальные дефекты, приводящие к почти идентичным фенотипам в формировании паттерна пальцев. Однако, Neo1Gt/Gt не обнаруживают обычных альтераций в экспрессии двух мишеней для BMP, Msx1 и Msx2, или самого Bmp4 во время развития зачатка конечности. Более того, генетические взаимодействия Gli3 с Bmp4 в противоположность Neo1 были отличными. Dunn et al. показали, что удаление одной копии Bmp4 из Gli3+/Xt-J мышей увеличвает количество полидактилий как передних, так и задних конечностей (Dunn et al.,1997), тогда как удаление обеих копий Neo1 из Gli3+/Xt-J мышей усиливает полидактилию задних конечностей, но строго супрессирует полидактилию в передних конечностях. Итак, эти результаты не согласуются с мнением, что neogenin оказывает свои эффекты на формирование паттерна пальцев просто способствуя активности BMP.
Причина специфичности полидактилии для правой задней конечности у Neo1Gt/Gt неясна. Предпочтительнось правой по сравнению с левой конечностью (как в передних, так и задних конечностях) наблюдается при различных дефектах формирования паттерна пальцев, вызываемых мутациями или тератогенами (Layton и Hallesay,1965; Dunn et al.,1997; Eggenschwiler et al.,1997; Zakany et al.,2004), но механическая информация о причине этого феномена отсутствует. Единственная возможность заключается в том, что сущестуют незначительные отличия во времени или силе передачи сигналов между правой и левой конечностями, что делает правые конечности более чувствительными к пертурбациям, чем левые конечности, но это только спекуляция и мы не наблюдали воспроизводимых право-левосторонних отличий в экспрессии анализируемых здесь генов.
Анализ двойных мутантов Gli3;Neo1 показал, что Neo1 является сложным модификатором функции Gli3 в развитии как autopod, так и zeugopod. Тот факт, что гомозиготные мутации только Neo1 вызывают преаксиальную полидактилию и усиливают преаксиальную полидактилию задних конечностей у Gli3+/Xt-J мышей, показывает, что neogenin обычно дествует, чтобы ораничивать количество пальцев. Однако преаксиальная полидактилия передних конечностей супрессирована у Gli3+/Xt-J; Neo1Gt/Gt мышей; более того, двойные гомозигоные (Gli3Xt-J/Xt-J;Neo1Gt/Gt) мутанты обнаруживают строгую супрессию избыточной полидактилии, наблюдаемой у Gli3Xt-J/Xt-J мышей во всех конечностях. Следовательно, neogenin также необходим для полидактилии, ассоциированной с отсутствием Gli3. Кроме того, Gli3Xt-J/Xt-J;Neo1Gt/Gt мыши лишены радиальной и тибиальной костей (передних элементов zeugopod), тогда как Gli3Xt-J/Xt-J мыши имеют нормальную радиальную кость и рудиментарную тибию. Эти находки удивительно сходны с теми, которые обнаруживаются при Alx4. Alx4-/- мыши имеют преаксиальную полидактилию (выраженную сильнее, чем у Neo1Gt/Gt мышей), но двойные Gli3Xt-J/Xt-J;Alx4-/- гомозиготные мутанты обнаруживают супрессию полидактилии и потери передних элементов zeugopod (Panman et al.,2005). Alx4 экспрессируется в переднем аспекте зачатка конечностей (Qu et al.,1997), но его экспрессия не изменяется заметно у Neo1Gt/Gt мышей. Поскольку Neo1 экспрессируется в мезенхиме всего зачатка конечности, то связь с Alx4 не очевидна. Почему удаление Neo1 (или Alx4) из Gli3Xt-J/Xt-J мышей вызывает такие фенотипы, неясно. Единственная возможность, что они возникают в результате аномального усиления передачи сигналов SHH выше и позже, чем в отсутствие какого-либо GLI3 репрессора. Хотя потеря GLI3 репрессора может рассматриваться как путь максимального нарушения регуляции активности в контексте формирования паттерна зачатков конечностей, нам не известны предыдущие исследования, в которых позитивная передача сигналов SHH преднамеренно активировалась далее в зачатке конечности в отсутствии GLI3 (напр., у кондиционных Gli3-/-; Ptch1-/- или Gli3-/-;Sufu-/- мышей).
В соответствии с мнением, что neogenin негативно регулирует активность пути SHH в зачатке конечности, Neo1Gt/Gt мыши имеют эктопическую экспрессию в передней части мишеней для SHH, Gli1 и Ptch1, в правой задней конечности с частотами, сходными с теми, что и обнаружение преаксивальной полидактилии. Такие центры передачи эктопических сигналов SHH обычно обнаруживаются у мышей с преаксиальной полидактилией, включая мышей Bmp4+/- (Dunn et al.,1997; Hill,2007). Однако первичные MEFs, изолированные из Neo1Gt/Gt эмбрионов, были также сенсибилизированы к пути передачи сигналов SHH in vitro, это указывает на непосредственную роль neogenin в передаче сигналов SHH. Neo1Gt/Gt MEFs индуцируют экспрессию Gli1 в значительно большей степени, чем Neo1+/+ MEFs , когда подвергаются действию рекомбинантного SHH лиганда или агониста SMO, SAG. Потеря neogenin в MEFs была однако недостаточной, чтобы активировать активность пути SHH в отсутствии SHH лиганда или SAG. Итак, эти результаты подтверждают, что neogenin действует как негативный регулятор лигандом инициированного пути передачи сигналов SHH в зачатке конечности. Тот факт, что Neo1Gt/Gt MEFs сенсибилизировались как SHH, так и SAG, указывает на то, что neogenin проявляет свои эффекты на уровне SMO или ниже SMO. Neogenin соединяется с CDO и BOC, которые являются ко-регуляторами SHH. Одной из интригующих идей является то, что когда neogenin ассоциирует с CDO и BOC, то он предупреждает или уменьшает их участие в восприятии сигналов SHH. Однако ели бы это было так, то следовало ожидать, что Neo1Gt/Gt MEFs будут сенсибилизированы к SHH, но не к активации пути на уровне SMO (напр., с помощью SAG), пока же эти клетки были сенсибилизированы к SAG, также. Ранее мы установили, что помимо соединения с SHH, CDO и BOC могут также влиять на путь передачи сигналов SHH in vitro в нижестоящей точке, на уровне GLI факторов (Zhang et al.,2006), но механизм неясен, и где и когда такая активность может происхдить in vivo, неизвестно. Следует упомянуть, что полидактилия, наблюдаемая у Gli3Xt-J/Xt-J мышей не зависит от Shh (Litingtung et al.,2002; te Welscher et al.,2002), и не доказано. что полидактилия, вызываемая потерей neogenin нуждается в эктопической экспрессии Shh. Более того, эффекты на передачу сигналов SHH могут быть менее прямыми, чем в предположенном выше механизме.
Гены, которые кодируют некоторые компоненты пути SHH, являются транскрипционными мишенями этого пути также, включая Ptch1, Hhip1, Gli1, Cdo, Boc и Gas1, создавая сложную сеть обратных связей (Kang et al.,2007; Dessaud et al.,2008). Недавно сообщалось, что Neo1 является непосредственной мишенью передачи сигналов SHH/GLI в культивируемых клетках и во время развития рыбок данио (Milla et al.,2012). Следовательно, Neo1 может принадлежать к этой группе факторов, которые являются как регуляторами, так и мишенями пути Hedgehog и и могут быть компонентами сети обратных связей.
Итак, мы показали, что многофункциональный рецептор neogenin является регулятором формирования паттерна конечностей и пальцев, скорее всего, как модификатор функцими SHH и GLI3. Эти находки вместе с др. исследованиями роли неогенина в передаче сигналов netrin, RGM и BMP показывают, что этот рецептор чрезвычайно многосторонний в своем действии во время развития.