Эпидермис млекопитающих представлен многослойным эпителием [interfollicular epidermis (IFE)], который формирует защиту между телом и внешней средой и включает придаточные структуры. В то время как существуют множественные популяции стволовых клеток в волосяных фолликулах, поддержание IFE может быть приписано одиночной популяции клеток (Jaks et al., 2010). Длительные репарации ожоговых повреждений с помощью культивируемых IFE человека, это успешная терапия взрослыми стволовыми клетками и ясно обозначает, что IFE стволовые клетки могут поддерживаться и репродуцироваться в культуре (Green, 2008).
IFE человека имеет простую архитектуру. Стволовые клетки располагаются в базальном слое кератиноцитов, а терминальная дифференцировка осуществляется в супрабазальных слоях. Клональный рост являются функциональным маркером культивируемых IFE стволовых клеток человека (Barrandon and Green, 1987; De Luca et al., 2006) и используется для идентификации маркеров клеточной поверхности. Маркеры, которые концентрируются в клетках с высокой колонии-образующей способностью, включают β1 integrin рецепторы внеклеточного матрикса (ECM) (Jones and Watt, 1993; Jones et al., 1995; Zhu et al., 1999), Notch лиганд delta-like 1 (DLL1) (Lowell et al., 2000), трансмембранный протеогликан MCSP (NG2, CSPG4) (Legg et al., 2003) и LRIG1 (Jensen and Watt, 2006), трансмембранный белок, который негативно регулирует EGF рецепторы (EGFR) (Segatto et al., 2011).
Клетки, которые экспрессируют высокие уровни β1 integrins, MCSP, LRIG1 и DLL1, расположены в кластерах в базальном слое IFE , который имеет специфическую локализацию относительно топографии подлежащей базальной мембраны. Общее мечение выявил, что клетки внутри кластеров пролиферируют менее часто, чем соседние клетки и что начало дифференцировки происходит вне кластеров (Jensen et al., 1999).
Хотя исследования по иммунолокализации показали, что β1 integrins, MCSP, LRIG1 и DLL1 экспрессируются совместно в эпидермисе человека, ранее мы наблюдали, что еа уровне единичных клеток это не всегда имеет место (Jensen and Watt, 2006). Мы исследовали экспрессию генов в одиночных клетках с целью выявления стохастичности, отражающей транскрипционные шумы или отражающей ранее неизвестную функциональную гетерогенность в компартменте стволовых клеток (Chang et al., 2008; Kalmar et al., 2009; Oates, 2011).
Выяснение профиля глобальной экспрессии генов в одиночных клетках показало, что недифференцированные клетки распадаются на два кластера, один характеризуются экспрессией DLL1 и его партнера по связыванию syntenin. Кластер DLL1
+ обнаруживает повышенную экспрессию генов, ассоциированных с эндоцитозом, integrin-обеспечиваемой адгезией и передачей сигналов рецепторной тирозин киназы. Дифференциально экспрессируемые гены регулировали не независимо, поскольку избыточная экспрессия только DLL1 или вместе в LRIG1 приводила к усилению активности др. генов DLL1
+ кластера. Избыточная экспрессия DLL1 и LRIG1 ведет к усилению слипчивости с внеклеточным матриксом и к усилению caveolin-зависимого эндоцитоза EGFR. Дальнейшая характеризация CD46, одного из генов, активируемых в DLL1+ кластере, показала, что он является новым маркером клеточной поверхности эпидермальных стволовых клеток человека. Клетки с высокими эндогенными уровнями экспрессии
CD46 экспрессируют высокие уровни β1 integrin и DLL1 и обладают высокой адгезивностью и клоногенностью. Нокдаун CD46 снижает пролиферативный потенциал и β1 integrin-обеспечиваемую адгезию.
DISCUSSION
Растут доказательства, что контроль судьбы стволовых клеток связан как с детерминистическими, так и стохастическими процессами. Сложные регуляторные сети, определяющие стабильное, взаимозаменяемое 'attractor' состояние и стохастические флюктуации в генной экспрессии (транскрипционные шумы), определяют переходы между состояниями (MacArthur et al., 2008; Enver et al., 2009; Pina et al., 2012). Популяционные исследования, при которых клетки оцениваются как гомогенные на базе профилей проточной цитометрии, лишены разрешающей способности для выявления гетерогенности, возникающей в результате разных привлекающих (attractor) состояний и для выявления его функционального значения (Kalmar et al., 2009).
Использование подхода одиночных клеток позволило нам установить, что DLL1 является ключевым дискриминатором между двумя популяциями недифференцированных базальных кератиноцитов, которые отличаются по адгезии и пролиферации. Два кластера имеют разные транскрипционные профили, указывая, что различия между клетками в экспрессии генов не могут быть приписаны исключительно случайным стохастическим флюктуациям. Мы идентифицировали CD46 в качестве нового маркера клеточной поверхности эпидермальных стволовых клеток человека. Эти находки подчеркивают пригодность стратегий высокого разрешения для изучения маркеров стволовых клеток и исследования функции стволовых клеток. Клеточная гетерогенность внутри пролиферативного компартмента мышиных хвостовых IFE была недавно продемонстрирована (Mascre et al., 2012) и было бы интересным установить, отличаются или нет эти клетки по экспрессии CD46 или какому-либо иному маркеру, активируемому в D+ кластере человека.
Хотя два состояния, определяемые экспрессией DLL1 могут быть прирожденными, мы полагаем, что они закрепляются за счет зависимости от того, как клетки взаимодействуют с внешней средой, напр., посредством адгезии с ECM и зависимого от caveolin эндоцитоза. Это согласуется с недавними экспериментами, в которых мы открыли сеть генетических взаимодействий с участием различных модификаторов хроматина, которые воздействуют на отличающиеся, но функционально связанные наборы генов, включая integrin ECM рецепторы (Mulder et al., 2012).
IPA анализ предсказывает, что D+ кластер д. обладать измененной обусловленной интегрином адгезией и повышенным обеспечиваемым caveolin эндоцитозом, и это было подтверждено с помощью избыточной экспрессии delta и LRIG1. DLL1 избыточная экспрессия приводит к повышенной экспрессии β1 integrins и генов, ассоциированных с передачей сигналов рецепторной тирозин киназы и эндоцитозом. Маркер, обеспечивающий различия между двумя кластерами, это syntenin, который не только взаимодействует с цитоплазматическим доменом DLL1, но и также с β1 integrins и MCSP, двумя дальнейшими маркерами стволовых клеток (Beekman and Coffer, 2008). Имеются четкие параллели со стволовыми клетками кишечника Drosophila, где Delta также является маркером стволовых клеток (Ohlstein and Spradling, 2007).
Помимо CD46, также CAV1 и CAV2 были активированы в D+ кластере и обнаруживали экспрессию в эпидермальном базальном слое. Избыточная экспрессия DLL1 ведет к усилению зависимого от caveolin эндоцитоза EGFR в EGF-стимулированных клетках. Эти находки особенно интересны в свете др. исследований, подтверждающих связь между caveolins и стволовыми клетками. Экспрессия CAV1 регулирует размер компартмента стволовых клеток в молочных железах взрослых мышей (Mercier et al., 2009), а Cav1-/- мыши обнаруживают гиперчувствительность к канцерогенами вызываемым эпидермальным опухолям (Capozza et al., 2003). Caveolin липидные платформы в плазматической мембране облегчают общение между разными сигнальными рецепторами (Razani et al., 2002) и участвуют в координации и взаимосвязи β1 integrin, Notch1 и путей передачи сигналов рецепторной тирозин киназы (Campos et al., 2006). Caveolin-поддерживающий домен сам по себе является местом швартовки (docking) для сигнальных компонентов пролиферативных и способствующих выживанию путей (Mercier et al., 2009). Всё это подтверждает, что активация кавеолинов в эпидермальных стволовых клетках может играть роль в регуляции пролиферативных сигнальных путей.
Поразительным наблюдением стало то, что избыточная экспрессия delta и LRIG1 ведет к повышенной экспрессии ITGB1 и др. генов в D+ кластере. Хотя лежащий в основе механизм ещё предстоит выяснить, интересно отметить, что он может отражать измененную чувствительность к сигналам микроокружения. Напр., имеются доказательства, что межклеточная адгезия позитивно регулирует экспрессию SOX7, одного из генов в D+ (Bauwens et al., 2011), а ранее мы продемонстрировали, что DLL1 способствует межклеточной адгезии (Lowell et al., 2000; Lowell and Watt, 2001; Estrach et al., 2007). Хотя нокдаун CD46 не снижает экспрессии DLL1, он ведет к снижению уровней мРНК и белка β1 integrin. CD46high стволовые клетки обнаруживают повышенные уровни DLL1 и β1 integrins и обладают повышенными адгезией и пролиферативным потенциалом. Слипчивость с эпидермальной базальной мембраной может влиять на реакцию на др. внеклеточные сигналы ниш, включая факторы роста. Т.о., внутренние и внешние регуляторы эпидермальных стволовых клеток не являются независимыми, а тесно взаимосвязаны.
