Extraembryonic endoderm development

Зрелые бластоцисты мыши (4.5 days post-coitum (dpc)) представлены тремя различными типами клеток: трофэктодермой, которая дает трофобласт и внеэмбриональную эктодерму (ExEc), плюрипотентные клетки эпибласта и примитивную или внеэмбриональную энтодерму (ExEn), эпителиальный слой клеток на поверхности эпибласта. Примитивная энтодерма даёт: (i) висцеральную энтодерму (VE), которая окружает эпибласт и ExEc; и (ii) париетальную энтодерму (PE), которая взаимодействует со слоем гигантских клеток трофобласта. PE клетки мигрируют вдоль внутренней поверхности трофэктодермы и вместе с гигантскими клетками трофобласта формирует париетальный желточный мешок (Hogan et al. 1980). PE, также как VE, обеспечивают обмен питательных веществ и отходов в развивающемся эмбрионе. Первоначально VE покрывает только эпибласт, но по мере увеличения в размере ExEc VE быстро расширяется, чтобы покрывать ExEc. VE, лежащая поверх эпибласта, становится молекулярно и морфологически отличной от VE , находящейся в контакте с ExEc приблизительно на 5.0 dpc, представляя embryonic VE (emVE) и extraembryonic VE (exVE), соотв. Клетки из exVE я. цилиндрическими или кубовидными, тогда как клетки emVE уплощены и имеют более эпителиальную форму (Takito & Al-Awqati 2004).

Приблизительно на 5.5 dpc группа клеток на дистальном кончике эпибласта дифференцируется в морфологически отличающийся субнабор emVE, в distal visceral endoderm (DVE) (Rivera-Perez et al. 2003; Srinivas et al. 2004). Это отмечает образование первой оси тела, дистально-проксимальной оси. В течение 4-5 ч (между 5.75 и 6.0 dpc) DVE мигрирует проксимально в виде непрерывного эпителиального слоя в проспективный передний полюс эмбриона. Лежащий в основе механизм этой миграции ещё полностью не охарактеризован и предполагается как активная миграция, так и различия в скорости пролиферации передней в противовес задней части эпибласта (Srinivas et al. 2004; Migeotte et al. 2010; Stuckey et al. 2011; Trichas et al. 2011). Одностороннее перемещение DVE изменяет дистально-проксимальную ось в передне-заднюю ось эмбриона и DVE теперь называется anterior visceral endoderm (AVE).

VE и её производные играют критические роли в организации и дифференцировке эпибласта. VE является первым местом гематопоэза (Toles et al. 1989; McGrath & Palis 2005) и индуцирует благодаря экспрессии Indian hedgehog и vascular endothelial growth factor образование кровяных островков и эндотелиальных клеток (Dyer et al. 2001; Byrd et al. 2002; Damert et al. 2002). Кроме того, проксимальная часть VE, как было установлено, участвует в дифференцировке ранних примордиальных зародышевых клеток (de Sousa Lopes et al. 2004, 2007). Наконец, микрохирургическое удаление AVE приводит к укорочению передних нейральных структур (Thomas & Beddington 1996) , а продуцируемые ею сигналы BMP2 , как было установлено, участвуют в позиционировании сердца и инвагинации передней кишки (Madabhushi & Lacy 2011).

Интересно, что клональное разграничение между эмбриональной и ExEn тканью было маркировано, исходя из предположения, что VE, которая окружает эпибласт, смещается с помощью дефинитивной энтодермы. Недавно было установлено, что клетки из VE персистируют внутри слоя дефинитивной энтодермы эмбриона и вносят вклад в раннюю кишечную трубку. Это указывает на то, что различие между внеэмбриональной и эмбриональной тканью не столь строгое, как полагали, и клоны, которые ранее рассматривались как исключительно эмбриональные содержат внеэмбриональные вклады (Kwon et al. 2008). Возникает вопрос, существуют ли внутри дефинитивной энтодермы и потенциально происходящих из неё тканей, молекулярные и функциональные различия между ExEn- и клетками, происходящими из эпибласта, которые могут быть изучены в культуре in vitro, и клетками, представляющими ExEn.

Derivation, properties and applications of ExEn-derived stem cells

Стволовые клетки могут быть производными каждого из примитивных клонов в эмбрионе млекопитающих (Fig. 1). ES клетки из внутренней клеточной массы (ICM) или раннего эпибласта, trophoblast stem (TS) клетки из слоя трофэктодермы и XEN стволовые клетки из примитивной энтодермы (или ExEn). Очень важно, что каждая из этих систем стволовых клеток способна к бесконечному самообновлению в культуре и будучи повторно внесена в эмбрион мыши будет давать клонально ограниченный вклад в химерный эмбрион в соответствии с её клональным происхождением (Beddington & Robertson 1989; Tanaka et al. 1998; Kunath et al. 2005). Интересно, что in vivo XEN клетки могут вносить вклад только в PE, редко в VE (Kunath et al. 2005; Kruithof-de Julio et al. 2011). Figure 1, 2.

Первоначально линии parietal endoderm cell (PEC) были выделены Fowler et al. (1990). In vitro исследования показали, что эти клетки имеют характеристики PE, очень сильно напоминающий базальной мембраны матрикс мембраны Reichert's. Однако их потенциал вклада в создание химер не был оценен (Fowler et al. 1990). PECs морфологически напоминают более недавно изолированные XEN клетки (Kunath et al. 2005; rev. Rossant 2007) , они округлы и ломки или звездатые или похожие на эпителиальные клетки. Несколько методов выделения было предложено для получения XEN клеток, которые ведут к тому, что получаются все клетки со сходными морфологическими характеристиками; однако их реакция на ростовые факторы, по-видимому, зависит от процесса происхождения. В этой связи было важным убедиться, что примитивная энтодерма уже обладает гетерогенной экспрессией некоторых маркеров DVE/AVE, таких как Cer1 и Lefty1 (Takaoka et al. 2006, 2011; Torres-Padilla et al. 2007). Более того, передача сигналов Nodal/Activin может дифференциально восприниматься внутри примитивной энтодермы (Granier et al. 2011). Это д. подразумевать, что во время созревания сигнальных путей клетки примитивной энтодермы чувствительны даже к минимальным изменениям в интенсивности передачи сигналов. Интересно, что предшественники примитивной энтодермы, экспрессирующие Oct4, обладают более значительной онтогенетической пластичностью, чем Oct4-экспрессирующие предшественники эпибласта на той же стадии (Grabarek et al. 2012), это д. отражать in vitro гетерогенную природу XEN клеток.

Тщательный анализ микромассивов XEN клеток, осуществленный несколькими группами обнаружил их согласие в отношении экспрессии маркеров примитивной энтодермы SOX7, GATA4, GATA6 и VE маркеров hHEX и DKK1. Более того, XEN клетки характеризуются отсутствием экспрессии AFP, а также отсутствием маркеров дефинитивной энтодермы (Kunath et al. 2005; Brown et al. 2010b; Kruithof-de Julio et al. 2011). Учитывая их воспроизводимое происхождение из ExEn м профиль их экспрессии, сходный с этой внеэмбриональной тканью, XEN клетки могут служить мощным инструментом для изучения индуктивных эффектов, приписываемых AVE. Brown et al. (2010a,b) осуществили тщательный анализ массивов трех клеточных линий, которые сходны с сердце-индуцирующей AVE: две эмбриональные производные карциномы (END2 и PYS2) и XEN клетки. Путем сравнения профилей генной экспрессии они идентифицировали дискретный набор генов, которые д. поддерживать миокардиальную дифференцировку. Кроме того, при использовании XEN клеток, произошедших в кондиционированной среде от эмбриоидных тел, они оказались способны усилить кардиогенез (Brown et al. 2010a). Имеются интересные наблюдения с потенциальными терапевтическими свойствами. Чтобы получить соотв. клеточные продукты (в данном контексте, кардиомиоциты для репарации сердца), важно ступенчатообразно управлять судьбой интересующих стволовых клеток с помощью соотв. инструктивных сигналов in vitro. Во время развития, VE взаимодействует с возникающей мезодермой, чтобы индуцировать кардиальную судьбу. Следовательно, XEN клетки д. быть использованы для воспроизведения этого процесса развития in vitro и индуцировать и ускорить дифференцировку чувствительных стволовых клеток к кардиальный клон.

Происходящие из примитивной энтодермы XEN клетки вносят эффективный вклад в химеры с PE, но не с VE (Kunath et al. 2005; Kruithof-de Julio et al. 2011). Такое отсутствие вклада в VE клон может быть вызвано за счет многих факторов, включая предпочтительное взаимодействие с пристеночной (mural) трофэктодермой (Artus et al. 2012; Kruithof-de Julio and Shen, unpubl. data, 2009), изменение сигнального пути при становлении клеточной линии, базирующемся на процессе образования (XEN клетки образуются в присутствии LIF плохо отвечающего на стимуляцию факторами роста) или за счет образования "committed" клеток, которые потеряли потенцию. В подтверждение последнего в отношении предшественников внеэмбриональной энтодермы (XEN-P) стволовые клетки получали из бластоцистов крыс (Debeb et al. 2009; Galat et al. 2009). Эти клетки характеризовались как лишенные "энтодермой" определяемого профиля геной экспрессии; они экспрессировали ES маркеры OCT4, REX1, AP и SSEA1 и вносили вклад в PE, а также в VE клоны у химер. Авт. полагают, что они являются предшественниками энтодермальных клеток, т.к. они могут представлять собой первую ступень детерминации в ExEn.

Наконец, в отношении пластичности или детерминации стволовых клеток, недавно Cho et al. (2012) оказались способны получить XEN клетки из мышиных ES клеток посредством добавления экзогенной ретиноевой кислоты и Activin. Такие XEN клетки были неотличимы от XEN клеток, происходящих из эмбрионов, включая их способность к дифференцировке (Cho et al. 2012). Эти данные показывают высокую степень пластичности внутри ICM и предоставляют возможность получения линий XEN клеток от различных доступных мутантных ES клеточных линий, чтобы пролить свет на факторы, необходимые образования XEN клеток и развития ExEn.

Signaling pathways in XEN cells

Характерными для XEN клеток являются транскрипционные факторы GATA4 и GATA6, специфически экспрессируемые в ExEn. GATA6 присутствует с 3.5 dpc в ICM в виде распределения соль-и-перец с NANOG и затем ограничивается примитивной энтодермой (Chazaud et al. 2006). Gata6-дефицитные мыши являются эмбриональными леталями, а Gata6-нулевые ES клетки неспособны специфицировать VE in vivo и in vitro, подтверждая ключевую роль GATA6 в дифференцировке VE и PE (Morrisey et al. 1998). Индуцированная и поддерживаемая экспрессия Gata4 и Gata6 в мышиных ES клетках воспроизводит характеристики XEN клеток in vivo и in vitro (Fujikura et al. 2002; Shimosato et al. 2007), подразумевается, что GATA факторы играют критическую роль в спецификации XEN клеток. Недавно был идентифицирован важный фактор стволовости в XEN клетках - это SALL4. Фактически, XEN клетки не могут быть получены из Sall4-нулевых мышей. Принимая во внимание, что он расположен выше GATA4 и GATA6, по-видимому, SALL4 играет роль в качестве активатора ключевых генов, определяющих клон ExEn. Это в частности объясняет, почему потеря Gata4 или Gata6 ведет к дефектам VE, а не к более широкой потере примитивной энтодермы (Lim et al. 2008).

Интересно, что человеческие ES (hES) клетки также могут воспроизводить ExEn и дефинитивную энтодерму за счет конституитивной экспрессии SOX7 или SOX17, соотв. (Seguin et al. 2008). Кроме того, дифференцировка этих клеток за счет обработки или BMP4 в SOX7 избыточно экспрессирующих hES клетках увеличивает экспрессию маркеров ExEn, тогда как обработка Activin A в избыточно экспрессирующих SOX17 клетках hES повышает экспрессию маркеров дефинитивной энтодермы, как и ожидается для hES клеток. Обе клеточные линии, однако, поддерживают экспрессию NANOG и OCT4 в своём недифференцированном состоянии. Это подтверждает сходство избыточно экспрессирующих SOX7 hES с XEN-P клетками скорее, чем с мышиными XEN клетками и подразумевает роль SOX транскрипционных факторов в поддержании состояния предшественников в клетках, удерживая их от дифференцировки. Sox17 экспрессируется в происходящих от мышей XEN клетках и играет роль в их становлении, поскольку XEN клетки не могут возникать из Sox17-нулевых эмбрионов. Однако у Sox17 мутантных мышей отсутствует достоверный эффект на развитие ExEn, это авт. объясняют высоко регулятивными условиями мышиного эмбриона и непрерывной экспрессией Gata6 и Sox7 у Sox17-дефинитных эмбрионов (Niakan et al. 2010).

Эндогенные non-coding small RNAs (miRNAs) играют роль в плюрипотентности регуляторной сети ES, TS и XEN клеток (Marson et al. 2008; Xu et al. 2009; Spruce et al. 2010). Интересно, что мутанты Dicer не формируют корректно паттерн VE. Кроме того, истощение miRNAs в XEN клетках ведет к потере мультипотентности, которая, по-видимому, обеспечивается посредством модуляции пути передачи сигналов ERK1/2 и идет в разрез с тем, что происходит в клетках, происходящих из эмбриона. Это подтверждает, что во внеэмбриональном клоне обнаруживается критическая роль miRNAs в становлении и поддержании способности к самообновлению (Spruce et al. 2010). Более того, внеэмбиональные ткани, как известно, гипометилированы по сравнению с эмбриональными тканями (Chapman et al. 1984; Monk et al. 1987; Gardner & Davies 1992). Сходным образом, XEN клетки, как было установлено, экспрессируют низкие уровни репрессивных хроматиновых модификаций, каких как H3K27me3 (Rugg-Gunn et al. 2010). Низкое метилирование ExEn д. потенциально наделять эту ткань значительной компетентностью легко подвергаться дифференцировке и трансдифференцировке.

Отсутвие вклада XEN клеток в VE заинтересовало несколько групп и привло к находке, что действие Nodal и BMP4, оба члены сверхсемейства transforming growth factor (TGF)β , направляет клетки XEN в направлении фенотипа VE in vivo и in vitro (Kruithof-de Julio et al. 2011; Artus et al. 2012; Paca et al. 2012). Nodal соединяется с type I (ALK4) или type II рецепторами в присутствии ко-рецептора Cripto или Cryptic (члены семейства EGF-CFC). Их сигнал распространяется в ядро посредством фосфорилирования SMAD2 и тонко регулируется с помощью ингибиторов, включая Lefty и Cerberus. XEN клетки, обработанные с помощью Nodal или Cripto могут быть дифференцированы в VE фенотип in vitro? а у химер они вносят более эффективный вклад в VE. Такой вклад, однако, не является исключительным для VE, это может быть обусловлено высокой гетерогенностью популяции XEN клеток. В клетках XEN, передача сигналов Nodal только посредством ALK4 рецептора и EGF-CFC Cryptic, поскольку SB431542 (в качестве ингибитора рецептора ALK4) обработанные XEN клетки и XEN клетки, происходящие из Cryptic-нулевых мышей, не реагируют на Nodal. Cripto, по крайней мере, частично Nodal-независим, поскольку его функция не может быть ингибирована с помощью SB431542. Авт. предлагают два возможных механистических сценария: альтернативный с низким сродством рецептор или неканонический путь посредством пока неизвестного сигнального трансдуктора (Kruithof-de Julio et al. 2011). Интерсно, что к сходному выводу пришли Clements et al. (2011). Авт. сконцентрировались на взаимодействии между Nodal/Activin сигнальным путем и MAPK p38 в XEN клетках и выявили новую роль для p38 в регуляции порогов Nodal. Они наблюдали, что активация p38 не зависит от ALK4, 5 или 7 и поэтому не может быть подавлена с помощью SB431542; однако, она может быть запущена с помощью Cripto. Это указывает на то, что неканонический путь, с помощью которого действует Cripto, может зависеть от p38 (Clements et al. 2011).

Как упоминалось, обработка BMP4 также направляет XEN клетки на выбор VE фенотипа. В этом случае, как полагают, канонические BMP рецепторы, в качестве химического ингибитора Dorsomorphin предупреждают индукцию VE обусловленную с помощью BMP4. Интересно, что главным образом индуцированный подтип VE напоминает таковой VE, соседствующих с ExEc, а не emVE (Artus et al. 2012; Paca et al. 2012). Это наблюдение согласуется с известной экспрессией BMP4 у ранних эмбрионов, которая наивысшая в ExEc, ближайших к проксимальной части эпибласта (Lawson et al. 1999). BMP4 был также способен индуцировать VE дифференцировку в PE, демонстрируя, что этот тип клеток не дифференцирован окончательно и сохраняется способность формировать VE (Artus et al. 2012; Paca et al. 2012).

Conclusions

Мультипотентные стволовые клетки обладают потенциалом развиваться в разные типы клеток тела во время ранней жизни и роста. Они отличаются от др. типов клеток двумя важными характеристиками. Во-первых, они могут самообновляться и, во-вторых, при определенных физиологических или экспериментальных условиях они могут становиться ткане- и орган-специфичными клетками со специальными функциями.

Для целей клеточной терапии необходимо манипулировать с этими клетками in vitro , чтобы успешно дифференцировать их в направлении интересующего типа клеток. Дотошное использование онтогенетических принципов к стволовым клеткам в культуральных системах является основой подобных исследований. Основным ограничением является очень низкая частота идентифицируемых дифференцированных клеток и значительная клеточная гетерогенность. Только когда большие количества высоко обогащенные предшественниками, это достижимо. XEN клетки могут давать отсутствующую связь в этом процессе дифференцировки.

Внеэмбриональные и эмбриональные ткани взаимодействуют, чтобы специфицировать каждое из таких предназначений. При использовании XEN клеток в качестве индуктивного питающего слоя для ES клеток, epiblast stem cells (EpiSC) или их мультипотентного потомства, может быть индуцирована определенная онтогенетическая или дифференциальная судьба (Kruithof-de Julio, Moerkamp and Goumans, unpubl. data, 2012). В этом контексте, XEN клетки могут не только служить моделью для понимания развития ExEn, но и также вычленять индуктивную роль ExEn в спецификации эмбриональных тканей, напр., образование сердечного и кровяного клонов (Brown et al. 2010a; Artus et al. 2012). Как только будет установлена их роль в этих индуктивных процессах, могут быть получены мутантные линии, чтобы точно определить участвующие специфические гены. Т.о., XEN могут быть мощным инструментом in vitro (Fig. 2), путем использования кондиционированной среды или совместных культур, для выявления факторов, которые поддерживают дифференцировку во время процессов развития, подобных кардиогенезу и гематопоэзу. Идентификация экзогенных стимулов дифференцировки позволит использовать их в клинической практике в подходах, базирующихся на стволовых клетках для эффективного получения больших количеств интересующих дифференцированных типов клеток. Для клеточной терапии, XEN клетки д. происходить из эмбрионов человека. Однако, получение из человеческих эмбрионов возможно лишь частично при добавлении SOX7, избыточно экспрессирующегося в hES клетках и остается пока предметом будущих исследований. Альтернативно, для идентификации онтогенетических стимулов, XEN клетки д. происходить из мышиного постимплантационного эпибласта. Мышиные EpiSC очень сходны с hES клетками по их состоянию плюрипотентности и потребностям в факторах роста и, следовательно, их производные XEN клетки могут напоминать очень сильно развитие человеческой ExEn. Cho et al. (2012) оказались неспособны получить XEN клетки из мышиных EpiSC при использовании того же самого протокола, что и при получении XEN клеток из мышиных ES клеток(Cho et al. 2012). В случае EpiSC, благодаря их эпигенетическому статусу, получение XEN клеток может потребовать разные экзогенные стимулы. Однако, остается возможность, что EpiSC в самом деле неспособны менять свою онтогенетическую судьбу. Наконец, хотя и не было установлено, XEN клетки возможно получать из соматических клеток посредством прямого репрограммирования, обходя тем самым потребности человеческих эмбрионов.

Хотя необходимо держать в уме очень высокую гетерогенность популяции и существование межвидовых различий, которые могут быть обусловлены стадией и протоколами получения, XEN клетки также могут быть моделью для изучения внеэмбрионального вклада в дефинитивную энтодерму и её дифференцированные производные. Возникает вопрос, могут ли XEN клетки per se в самом деле вносить вклад в примитивную кишечную трубку или они должны сначала быть дифференцированными в направлении клона дефинитивной энтодермы. На поздних стадиях химеры, происходящие из Nodal, Cripto или из необработанных XEN клеток, вносящие вклад в дефинитивную энтодерму,огда не наблюдались (Kruithof-de Julio and Shen, unpubl. data, 2010), наблюдался только вклад в висцеральный желточный мешок.

In summary, XEN cells provide a valuable cell culture model to dissect the extraembryonic endodermal lineage and its potential contribution to the embryonic one. Thereby, XEN cells may increase our understanding of the molecular mechanism behind endoderm behavior and function during development. Furthermore, XEN cells may give an insight into the inductive factors underlying mesoderm specification, like cardiogenesis and hematopoiesis, which may be reflected into stem cell-based therapeutic approaches.

Extraembryonic Endoderm cells as a model of endoderm development Asja T. Moerkamp, Agnieszka Paca, Marie-Jose Goumans, Tilo Kunath, Boudewijn P. T. Kruithof, Marianna Kruithof-de Julio Development, Growth & Differentiation Volume 55, Issue 3, pages 301–308, April 2013

Extraembryonic Endoderm cells as a model of endoderm development
Asja T. Moerkamp, Agnieszka Paca, Marie-Jose Goumans, Tilo Kunath, Boudewijn P. T. Kruithof, Marianna Kruithof-de Julio
Development, Growth & Differentiation Volume 55, Issue 3, pages 301–308, April 2013