Важность эпителиально-мезенхимных взаимодействий для развития gastro-intestinal (GI) органов многократно подтверждалась. Было продемонстрировано, что мезенхима и строма влияют на пролиферацию и дифференцировку GI эпителиальных клеток в культуре (Fukamachi et al. 1979; Fukamachi & Takayama 1980; Kedinger et al. 1986; Kedinger et al. 1987; Mizuno & Yasugi 1990; Simo et al. 1992; Sanderson et al. 1996), но механизм взаимодействия не был полностью понятен, хотя некоторые факторы, включая hepatocyte growth factor (HGF; Fukamachi et al. 1994a), transforming growth factor β (Sharp et al. 1995), laminin внеклеточного матрикса (Plateroti et al. 1997), wnt (Korinek et al. 1998), bone morphogenetic proteins (Narita et al. 2000), fibroblast growth factor 10 (Bhushan et al. 2001), secreted Frizzled-related proteins (Kim et al. 2005a), sonic hedgehog (Kim et al. 2005b) и endothelin-3 (Fukamachi et al. 2005), как было установлено, участвуют в этом.
Activins и inhibins являются членами сверхсемейства transforming growth factor β из структурно родственных, но функционально отличающихся белков. Activins являются димерными белками, состоящими из субъединиц disulphide-linked inhibin ?A или ?B. Т.о., может существовать три формы активинов in vivo; activin A (?A?A), activin B (?B?B) и activin AB (?A?B) (McNeilly 2012). Активины являются важными регуляторами процессов раннего развития у позвоночных, как показывают эксперименты, они индуцируют образование различных типов мезенхимных клеток в эксплантах animal шапочки от эмбрионов амфибий (Asashima et al. 1990; van den Eijnden-van Raaij et al. 1990; Green & Smith 1990; Smith et al. 1990; Thomsen et al. 1990). Позднее активины были найдены как индуцирующие множественные органы в анимальных шапочках в комбинации с др. молекулами (Moriya et al. 1993; Ninomiya et al. 1998). первоначально активины были идентифицированы как стимуляторы продукции и высвобождения фолликул стимулирующего гормона из гипофизарных гонадотрофов, их функция во взрослых гонадах хорошо известна, но их функция в развивающемся GI тракте исследована неполностью.
Feijen et al. (1994) сообщили, что inhibin bA обильно экспрессируется в мезенхимных тканях пищеварительной, респираторной и генитальной систем и что inhibin bB строго экспрессируется в эпителии желудка и пищевода. Они также установили, что рецепторы активина типа IIA (ActRIIA) и ActRIIB экспрессируются в областях, соседствующих с местами экспрессии ? субъединицы. Verschueren et al. (1995) сообщили, что рецептора активина типа I (ActRI) экспрессируется в мезенхиме желудка, а ActRIB в эпителиальной выстилке пищевода, желудка, средней кишки и задней кишки, подтверждая. что активины могут играть важную роль в регуляции роста и дифференцировки GI органов.
Многократно подтверждалось, что активины влияют на дифференцировку эпителиальных клеток желудка. У дефицитных по inhibin bA мышей, стромальные опухоли гонадного полового тяжа секретируют высокие уровни активинов при развитии на ранних стадиях, а дифференцировка множественных желудочных эпителиальных клонов, включая париетальные клетки, секретирующие кислоту, зимоген-секретирующие главные клетки и слизь-секретирующие пит-клетки, была нарушена. У компаундных мутантных мышей, дефицитные по inhibin bA и ActRIIA, железистые желудочные эпителиальные клетки дифференцируются нормально, подтверждая, что повышенные уровни передачи сигналов активинов посредством ActRIIA в желудке затрагивают их дифференцировку (Coerver et al. 1996; Li et al. 1998). Остается проверить, как активины влияют на рост и дифференцировку эпителиальных клеток желудка, хотя Ogihara et al. (2000) сообщили, что activin A стимулирует пролиферацию кишечных эпителиальных клеток морских свинок в отсутствие epidermal growth factor (EGF), но что он ингибирует их рост в присутствии EGF в первичной культуре.
Discussion
В данном исследовании мы установили, что inhibin bA специфически экспрессируется GI мезенхимой (Fig. 1) и что activin A регион-специфически влияет на рост GI эпителиальных клеток в первичной культуре. Эти результаты подтверждают, что activin A является важным медиатором эпителиально-мезенхимных взаимодействий. Мы установили, что inhibin bA сильнее экспрессируется мезенхимой двенадцатиперстной кишки и колона, чем мезенхимой кардиального отдела желудка и железистой части желудка (Fig. 1), и что activin A стимулирует рост эпителиальных клеток колона, тогда как он супрессирует рост эпителиальных клеток кардиальной части и железистой части желудка (Fig. 2). Возможно, что activin A строго экспрессируется в мезенхиме толстой кишки, на которой он стимулирует рост эпителия.
Мы установили, что activin A стимулирует рост эпителиальных клеток колона, тогда как он супрессирует рост эпителиальных клеток кардиальной и железистой частей желудка. Последние были культивированы на среде с добавлением BPE и лошадиной сыворотки, тогда как эпителиальные клетки двенадцатиперстной кишки и колона в бессывороточной среде без BPE. Возможно, что activin A не может стимулировать рост эпителиальных клеток кардиальной и железистой частей желудка из-за стимулирующего рост действия activin A, который испытывает влияние со стороны BPE и лошадиной сыворотки в культуральной среде. Рис. 2 показывает, что зависимые от дозы взаимоотношения сходны, когда эпителиальные клетки железистой части желудка и двенадцатиперстной кишки подвергаются действию activin A, демонстрируя, что рост этих эпителиальных клеток может регулироваться сходным образом с помощью activin A , хотя они и культивируются в разных средах с или без BPE и лошадиной сыворотки, соотв. Мы также полагаем. что BPE и лошадиная сыворотка не существенно влияют на действие activin A.
Ранее нами было показано, что HGF (Fukamachi et al. 1994a) и endothelin-3 (Fukamachi et al. 2005) также обеспечивает эпителиально-мезенхимное взаимодействие в развивающемся GI тракте. Т.о., три фактора роста, включая HGF, endothelin-3 и activin A были идентифицированы в качестве медиаторов эпителиально-мезенхимного взаимодействия в первичных культурах. Мы использовали эпителиальные клетки GI на 16.5 день беременности, когда эпителий GI epithelia состоял из гомогенных, недифференцированных и высоко митотических клеток (Kammeraad 1942). Если эпителиальные клетки получали от плодов на более ранних стадиях, то было трудно получить достаточные количества клеток, поскольку органы были очень маленьких размеров. На 17.5 день беременности наблюдался достоверный морфогенез в железистой части желудка и двенадцатиперстной кишке и стратифицированный эпителий превращался в простой железистый эпителий с признаками локальной пролиферации вреди эпителиальных клеток. Мы полагаем, что 16.5-дн. эпителиальные клетки GI являются наилучшим материалом для идентификации факторов, которые влияют на эпителиальный рост. Используя эти первичные культуры, мы сравнивали эффекты факторов на рост эпителиальных клеток исследуемых частей ЖКТ вдоль оси голова-хвост. Мы сравнили эффекты HGF, endothelin-3 и activin A на рост эпителиальных клеток GI в первичных культурах.
Показано, что эпителиальные клетки кардиальной части желудка быстро растут в первичной культуре и их количество увеличивается более чем в 30 раз за 4 дня (Fukamachi et al. 1995). Эпителиальные клетки железистой части желудка также росли быстро в первичной культуре и их количество увеличивалось в 15 раз за 4 дня (Fukamachi et al. 1994b). Эпителиальные клетки тонкого кишечника, напротив, росли относительно медленно в первичной культуре и их количество увеличивалось примерно в 9 раз как в двенадцатиперстной кишке, (Fukamachi 1992) так и толстой кишке (Fukamachi et al. 2005). Для количественного сравнения эффекта ростовых факторов на рост эпителиальных клеток ЖКТ, определяли относительные количества клеток на 4 день (Figure 3A). Рост эпителиальных клеток кардиальной и железистой частей желудка стимулировался с помощью HGF и endothelin-3, а Activin A супрессировал их рост. Но вряд ли activin A вызывал апоптоз эпителиальных клеток этих частей желудка, поскольку наблюдался быстрый рост клеток (количества клеток увеличивались примерно в 20 раз и в 7 раз на 4-й день культивирования этиъ эпителиальных клеток, соотв.) в присутствии activin A.
Figure 3. (A) Relative cell numbers of forestomach, glandular stomach, duodenal and colonic epithelial cells on day 4 in primary culture when hepatocyte growth factor (HGF; 10 ng/mL), endothelin-3 (ET-3; 10 nmol/L) and activin A (100 ng/mL) were added into culture media. Effect of HGF, ET-3 and activin A are cited from Fukamachi et al. 1994a, Fukamachi et al. 2005, and Figure 2, respectively. 100% means the cell number on day 1. Forestomach and glandular stomach epithelial cells increased more than 30 times and about 15 times in control cultures, respectively, while duodenal and colonic epithelial cells about nine times on day 4. (B) Data shown in (A) are converted into line graphs to show region-specific effects of mesenchymal growth factors on the growth of attaching epithelial cells in primary culture. HGF stimulated the growth of glandular stomach (GS) epithelial cells, followed by duodenal (D), colonic and forestomach (FS) epithelial cells. ET-3 and activin A, in contrast, stimulated the growth of colonic epithelial cells strongly while they stimulated only weakly or inhibited the growth of FS and GS epithelial cells, respectively.
Рост эпителиальных клеток колона строго стимулировался с помощью endothelin-3 и activin A, и их количества увеличивались в 20 раз и 13 раз, соотв., на 4-й день. Интересно бы проверить, стимулируют ли endothelin-3 и activin A синергично рост эпителия колона, но мы не смогли обнаружить синергичных эффектов этих факторов в предварительных экспериментах, возможно из-за того, что клетки росли с максимальной скоростью при стимуляции с помощью endothelin-3.
Регион-специфические эффекты факторов мезенхимного роста на пролиферацию примыкающих эпителиальных клеток в первичной культуре суммированы на Рис. 3B. Endothelin-3 и activin A вели себя одинаково, строго стимулируя рост эпителиальных клеток колона среди 4-х типов эпителиальных клеток GI, и они отличались тем, что endothelin-3 стимулировал слабо, а activin A ингибировал рост эпителиальных клеток кардиальной и железистой частей желудка, соотв. HGF отличался от endothelin-3 или activin A. поскольку он наиболее сильно стимулировал рост эпителиальных клеток железистой части желудка среди всех 4-х типов эпителиальных клеток GI. Эти результаты указывают на то, что эпителиальный рост в GI тракте является регион-специфичным и регулируется разными факторами, секретируемыми соседними мезенхимами. Остается установить, что предопределяет регион-специфическую реакцию эпителия. Возможно, что гомеозисные гены могут играть некоторую роль, поскольку продемонстрировано, что связанный с каудальной частью гомеозисный ген Cdx2 играет существенную роль в предопределении судьбы ЖКТ у мышей
(Silberg et al. 2002).
