Nuclease-mediated genome editing: At the front-line of functional genomics technology  Development, Growth & Differentiation Special Issue: GENOME EDITING EDITED BY T. YAMAMOTO AND H. NAKAMURA Volume 56, Issue 1, pages 2–13, January 2014 | |
|
Genome editing with engineered endonucleases is rapidly becoming a staple method in developmental biology studies. Engineered nucleases permit random or designed genomic modification at precise loci through the stimulation of endogenous double-strand break repair. Homology-directed repair following targeted ДНК damage is mediated by co-introduction of a custom repair template, allowing the derivation of knock-out and knock-in alleles in animal models previously refractory to classic gene targeting procedures. Currently there are three main types of customizable site-specific nucleases delineated by the source mechanism of ДНК binding that guides nuclease activity to a genomic target: zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR). Among these genome engineering tools, characteristics such as the ease of design and construction, mechanism of inducing ДНК damage, and ДНК sequence specificity all differ, making their application complementary. By understanding the advantages and disadvantages of each method, one may make the best choice for their particular purpose. Рисунки к статье |
При выяснении функции гена модификация последовательностей эндогенной ДНК главная основа технологии. Исторически функциональная геномика экстенсивно использует передовые генетические стратегии; случайный мутагенез с помощью трансгенетики (обусловленный вирусами или транспозонами) (Stanford et al. 2001) или химический мутагенез с помощью N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) и ethylmethanesulfonate (EMS) (Acevedo-Arozena et al. 2008). По природе случайный мутагенез требует больших усилий по поиску необходимых мутаций. В обратной (reverse) генетике, желаемые изменения в геноме достигаются с помощью не индуцируемой homologous recombination (HR), использующей целенаправленные вектора (Capecchi 2005). Однако, эффективная HR у эукариот обычно ограничивается дрожжами, куриными DT40 клетками и мышиными embryonic stem (ES) клетками. Недавно недостатки были преодолены за счет искусственно созданных endonucleases (EENs) и RNA-guided endonucleases (RGENs) (Pauwels et al. 2013). EENs и RGENs созданы, чтобы распознавать специфические локусы генома и вызывать double-strand breaks (DSBs) в этих местах мишенях, стимулируя пути репарации ДНК, которые обеспечивают генный targeting (Joung & Sander 2013). The basics of nuclease tools: ZFN, TALEN and CRISPR/Cas Первая EEN, разработанная для целенаправленной модификации генома, была zinc-finger nuclease (ZFN), химерным белком, состоящим из модулей zinc-finger (ZF) и FokI нуклеазного домена (Kim et al. 2011). Изолированный нуклеазный домен, лишенный распознающий ДНК специфичности, зависит от слияния сконструированных ZFs со специфической последовательностью к ДНК. Т.к. один ZF соединяется с тремя основаниями, то комбинация ZF может распознавать 9-18 bp (Fig. 1a) (Urnov et al. 2010). Сходне по своей концепции, TALENs (transcription activator-like effector nucleases) являются химерными белками, состоящими из нуклеазного домена и присоединенных ДНК-связывающих модулей, первоначально открытых в бактериальных белках, патогенных для растений, наз. transcription activator-like effectors (TALEs). Повторяющиеся домены TALE обычно состоят из 34 аминокислот, где одиночный повтор распознает одно основание ДНК посредством двух центральных аминокислот, наз. repeat-variable di-residues or RVDs (Boch et al. 2009; Moscou & Bogdanove 2009). Нативные белки TALE состоят из N-терминального домена, центрального сегмента из RVD повторяющихся доменов и C-терминального домена, включая мотив активации транскрипции (Bogdanove et al. 2010). В случае TALENs, около 15-20 RVDs собираются в одиночной молекуле. Будучи перепрофилированными как TALENs, искусственно созданные повторяющиеся домены с укороченными N- и C-терминальными TALE доменами (исключая нативную область активатора транскрипции) обычно сливают с одним и тем же FokI нуклеазным доменом, используемым и ZFNs (Fig. 1b) (Mussolino & Cathomen 2012). Благодаря природе FokI нуклеазы, и ZFNs и TALENs нуждаются в работе помещенных бок-о-бок пар, где димеризация FokI индуцирует локальную эндонуклеазную активность (illustrated in Fig. 1a,b). Эта димеризация необходима для генерации с высокой специфичностью DSB только в локусе мишени. Figure 1.
Описаны попытки увеличить как активность, так и специфичность за счет изменений нуклеазного домена. Высоко активный FokI мутант, наз. 'Sharkey' был разработан для ZFNs за счет направленной эволюции (Guo et al. 2010). Sharkey-ZFNs определенно являются более эффективными у животных in vivo (Ansai et al. 2012; Kawai et al. 2012; Ochiai et al. 2012; Watanabe et al. 2012), однако Sharkey-TALENs, по-видимому, не воспроизводят увеличение активности (Pillay et al. 2013). Чтобы снизить генотоксичность за счет активности вне расчётного региона, возникающей в результате само-димеризации, были использованы обязательные гетеродимеры FokI как для ZFNs (Miller et al. 2007; Ramalingam et al. 2011), так и TALENs (Tesson et al. 2011; Cade et al. 2012). Когда нуклеазная активность нарушена только в одной паре ZFN/TALEN, то гетеродимеризующиеся FokI нуклеазные домены обнаруживают склонность индуцировать разрез (nick) на одной нити и поэтому они менее склонны индуцировать DSB (Kim et al. 2012; Ramirez et al. 2012; Wang et al. 2013). Поскольку сайт-специфические nickases могут увеличивать эффективность HR, не способствуя склонной к ошибкам non-homologous end-joining (NHEJ), то возможно безопасное редактирование генома.
Хотя пары нуклеаз могут кооперировать, чтобы обеспечить специфичность, временная совместная доставка пар нуклеаз может быть технически проблематичной. Чтобы решить этот вопрос, мономерного типа ZFNs и TALENs были разработаны с использованием разных стратегий. В одном примере использована одиночная цепь FokI (scFokI); тандемно расположенная пара FokI нуклеазных доменов в одном белке (Minczuk et al. 2008; Mino et al. 2009; Mori et al. 2009). ZF-scFokI обнаруживает активность in vitro и в митохондриях культивируемых клеток, пока нет дальнейших сообщений, дополняющих эти находки. С др. стороны, ZF и TALE белки, сцепленные с приводной (homing) endonuclease, I-TevI, активны в редактировании ядерного генома (Kleinstiver et al. 2012; Beurdeley et al. 2013). Более того, TALE-TevI слитые белки могут действовать не только как нуклеазы, но и как nickases, а парные TALE-TevI nickases могут индуцировать DSBs в своих сайтах мишенях (Beurdeley et al. 2013). Т.о., некоторые EEN варианты могут предоставлять мощный альтернативный выбор для преобразования генома помимо канонических FokI-based EENs.
Др. метод одиночных нуклеаз специфически наводит на мишень др. способами. В противоположность EENs, RGENs такие как CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated) позволяют использовать short guide RNAs (gRNAs), чтобы управлять наведением РНК-связанной Cas9 нуклеазы на комплементарную последовательность ДНК для целенаправленной генерации DSB (Jinek et al. 2012; Cong et al. 2013; Mali et al. 2013a). Взаимодействующие Cas9-gRNA не обладают специфичностью распознавания оснований ДНК за исключением proto-spacer adjacent motif (PAM), позволяющему остальной gRNA обеспечивать специфичность мишени. Современные CRISPR/Cas системы происходят прежде всего из Streptococcus pyogenes, где gRNA PAM последовательность это 5'-NGG-3', ограничивающая потенциальные мишени последовательность предварительно фиксированные с помощью 'NGG'. Такое ограничение в дизайне может в конечном итоге быть ослаблено за счет повышенного применения Cas9/gRNA пар от др. видов. Напр., Streptococcus thermophilus Cas9 требует 5'-NNAGAAW-3' (Cong et al. 2013)? тогда как Neisseria meningitidis Cas9 требует 5'-NNNNGATT-3' (Hou et al. 2013). Большое количество аналогичных и полностью ортогональных CRISPR/Cas систем недавно было охарактеризовано в бактериях и клетках человека (Esvelt et al. 2013), это обещает дальнейшее разнообразие применений для геномного редактирования. Обычно одиночная gRNA и Cas9 комбинируют, чтобы индуцировать DSB в сайте мишени; однако, как и в случае FokI, нуклеазная активность Cas9 может быть превращена в nickase (Jinek et al. 2012). Подобно ZF- и TALE-nickases, Cas9-nickases индуцируют HR сверх NHEJ, хотя возникновение DSBs вне мишени не полностью устранено (Ran et al. 2013a).
Кроме того, существуют разнообразные альтернативные стратегии относительно ZFNs, TALENs и CRISPR/Cas. Сконструированные meganucleases были успешно использованы, пока они остаются непокорными для наделения их последовательностями специфичности (Grizot et al. 2009; Munoz et al. 2011; Menoret et al. 2013). ДНК-базирующаяся DSB-индуцирующая молекула, наз. ARCUT (Komiyama 2013), является ещё одной потенциальной альтернативой. Сохраняется вероятность, что такие стратегии или ещё неоткрытые методы будут использованы в качестве инструментов редактирования генома в будущем. Current construction methods for EENs and RGENs И EENs и RGENs могут сегодня быть сконструированы независимо исследователями с использованием плазмид из открытых источников, доступных в Addgene (Cambridge, MA, USA). Для ZFNs, может быть использованы два основных метода конструирования: сборка модулей и oligomerized pool engineering (OPEN). Для сборки из модулей просто необходимо переваривание и связывание индивидуальных ZF модулей из библиотеки плазмид, это легко осуществимо (Wright et al. 2006). Однако, ZFNs, созданные таким способом часто имеют разные специфичности распознавания оснований от тех, что были предсказаны, поскольку мешают др. др. тандемно связываемые ZF модули (Ramirez et al. 2008). Метод OPEN, с др. стороны, является бактериальным базирующимся на скрининге методом, которые может непосредственно отбирать функциональные наборы ZF (Maeder et al. 2009). Успешность при этом методе выше, чем при сборке модулей, но пока он не получил распространения.
По сравнению с ZFNs, методы конструкции для TALENs значительно легче и более надежны в получении функциональных EENs. Сегодня пять TALEN конструкционных комплектов предоставляется разными группами в Addgene. Для каждого конструктора (kit), принцип конструирования сходен с таковым для сборки ZFN модулей, варьирует только метод клонирования. Наиболее широко используется конструктор Bogdanove/Voytas Lab's Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit (Cermak et al. 2011). Этот конструктор состоит из библиотеки индивидуальных плазмид модулей, промежуточных векторов и векторов финального предназначения. При использовании TALEN плазмид, обладающих 12-31 повторяющимися доменами, может быть получена конструкция в две клональные ступени (Cermak et al. 2011). Более того, различные добавочные плазмиды были разработаны для Voytas lab конструктора, включая улучшенную TALE N- и C-терминальную архитектуру, и Yamamoto Lab's TALEN Accessory Pack, который позволяет создавать улучшенные конструкции и оценивать созданные TALENs (Sakuma et al. 2013a). В ближайшем будущем, др. Golden Gate cloning-based TALEN construction kit, the Platinum Gate TALEN Kit (Sakuma et al. 2013b), как ожидается, будет предоставлен Addgene. TALENs , созданные с помощью Platinum Gate Kit - Platinum TALENs - используются более активно, чем традиционные Golden Gate TALENs в культивируемых клетках и животных, включая лягушек и крыс (Sakane et al. 2013; Sakuma et al. 2013b), и также эффективно работают у нематод (Sugi et al. 2013), морских ежей (Hosoi et al. 2013), асцидий (Treen et al. 2013), тритонов (Hayashi et al. 2013) и мышей (Nakagawa et al. 2013).
Конструкция CRISPR RGENs намного легче, чем TALENs. Поскольку Cas9 обычно подходит к любой gRNA, то исследователям необходимо только сконструировать специфический вектор экспрессии gRNA путем клонирования синтезированных олигонуклеотидов в управляемый промотором polIII вектор экспрессии (Mali et al. 2013a; Ran et al. 2013b). Более того, Cas9 и gRNA архитектуры оптимизированы для нескольких типов клеток и организмов, таких как бактерии, дрожжи, нематоды, мухи, рыбки данио и клетки и эмбрионы млекопитающих, разработаны и представлены в Addgene.
Чтобы помочь в создании EENs и RGENs, доступны множественные online ресурсы. The Zinc Finger Consortium (http://www.zincfingers.org/) предлагает ZiFiT, который может быть использован для разработки последовательностей мишеней для ZFNs, TALENs и CRISPRs (Sander et al. 2010). Для сканирования off-target ZFN сайтов, the ZFN-Site (http://ccg.vital-it.ch/tagger/targetsearch.html) пригоден для использования (Cradick et al. 2011). Для TALEs и TALENs, TAL Effector Nucleotide Targeter (TALE-NT; https://tale-nt.cac.cornell.edu/) доступна коллекция инструментов в Cornell University (Doyle et al. 2012). Используя TALE-NT, последовательности мишеней одиночных TALEs и парных TALENs могут быть определены и оценена их специфичность. Доступны замещающие для построения TALEN web инструменты, такие как idTALE (http://idtale.kaust.edu.sa/) (Li et al. 2012), Mojo Hand (http://www.talendesign.org/) (Neff et al. 2013) и E-TALEN (http://www.e-talen.org/E-TALEN/) (Heigwer et al. 2013). Для разработки gRNAs для CRISPR/Cas9 системы, пригоден CRISPR Design Tool within CRISPR Genome Engineering Resources (http://www.genomeengineering.org/crispr/). В качестве баз данных широкого назначения для EENs и RGENs, EENdb (http://eendb.zfgenetics.org/) предоставляется Peking University (Xiao et al. 2013a). Diverse applications of EENs and RGENs Для общего мутагенеза и целенаправленного разрушения гена, EENs и RGENs могут быть использованы одинаково, даже заменяя др. др. Когда EENs или RGENs индуцируют DSB в их сайте мишени, они должны репарироваться немедленно с помощью эндогенных путей репарации ДНК, включая NHEJ, microhomology-mediated end joining (MMEJ) или HR (Podevin et al. 2013). NHEJ является склонным к ошибкам механизмом репарации, приводящим к инсерциям и/или делециям (indels), которые индуцируются и распространяются из сайта мишени (Fig. 2a). MMEJ может давать короткие делеции в 2-6 bp гомологичной последовательности. Когда EENs или RGENs вносятся, то при этом целенаправленный донор, несущий левое и правое фланкирующее плечо гомологии, то гомологичной рекомбинацией обусловленные добавления или модификации последовательностей может быть инкорпорированы непосредственно в локус мишень с более высокой частотой, чем при обычном таргетинге гена (Fig. 2a) (Voytas 2013). Так, в качестве targeting доноров, используются не только двунитчатые плазмидные вектора, но и также single-strand oligonucleotides (ssODNs) в качестве матрицы для репарации ДНК (Fig. 2a) (Chen et al. 2011). Учитывая достаточную эффективность, ssODN таргетинг предоставляет возможность вносить более легкие модификации в геном без необходимости в дальнейшем удалении лекарственных селекционных кассет. Более того, одновременное внесение двух и более EEN пар может быть использовано для индукции множественного целенаправленного мутагенеза (Wang et al. 2013), хромосомных делеций (Lee et al. 2010), инверсий (Lee et al. 2012), дупликаций (Lee et al. 2012) или транслокаций (Piganeau et al. 2013) (Fig. 2b). По этому сценарию использование системы CRISPR для многократного использования (multiplexing) безусловно благоприятно, т.к. только одиночная Cas9 нуклеаза необходима для взаимодействия с любым количеством направляющих на цель gRNAs. Т.о., разнородность Cas9 упрощает multiplexing. Figure 2.
При дополнительном слиянии нуклеаз, ZF-, TALE- и Cas9-ДНК связывающие домены могут быть использованы при др. созидательных способах. ZF/TALE-recombinases (Gordley et al. 2007; Gersbach et al. 2011; Mercer et al. 2012; Gaj et al. 2013) и ZF/TALE-transposases (Li et al. 2013b; Owens et al. 2013) являются новыми геном редактирующими инструментами, которые не вносят DSBs. Сайт-специфическая активация и репрессия гена расширяют границы использования ZFs (Sanchez et al. 2002; Yaghmai & Cutting 2002; Liu et al. 2005) в TALEs (Tremblay et al. 2012; Crocker & Stern 2013; Maeder et al. 2013; Perez-Pinera et al. 2013), а также при нуклеазой инактивированной Cas9 (Cheng et al. 2013; Gilbert et al. 2013; Qi et al. 2013). Недавно светом индуцируемые транскрипционные эффекторы и гистоновые эффекторы были разработаны с использованием TALE технологии (Konermann et al. 2013). Эти альтернативные методы сайт-специфических и эпигенетических модификаций представляют пути для поиска дополнительных к нуклеазным подходам уникальных ДНК связывающих доменов. Genome editing in animals Сконструированные эндонуклеазы или RGENs расширили парадигму геномного инженеринга внутри и вне круга стандартных животных моделей. Целенаправленный мутагенез с использованием EENs/RGENs не обязательно требует целой геномной последовательности, но минимума информации о ДНК последовательности вокруг локуса мишени. Внесение EENs или RGENs животным обычно достигается с помощью инъекций in vitro транскрибируемых РНК непосредственно в оплодотворенные яйца. В дополнение к этой гибкости, EEN/RGEN-обеспечиваемый таргетинг генов был применен непосредственно к большому количеству животных организмов, включая нематод (Wood et al. 2011), мух (Bibikova et al. 2002; Liu et al. 2012), москитов (Aryan et al. 2013; Smidler et al. 2013), бабочек (Merlin et al. 2013), crickets (Watanabe et al. 2012), шелкопряда (Ma et al. 2012), морских ежей (Ochiai et al. 2010), асцидий (Kawai et al. 2012), zebrafish (Doyon et al. 2008; Meng et al. 2008; Hisano et al. 2013), medaka (Ansai et al. 2012, 2013), лягушек (Young et al. 2013; Suzuki et al. 2013), мышей (Carbery et al. 2010; Sung et al. 2013), крыс (Mashimo et al. 2010, 2013) и свиней (Hauschild et al. 2011; Carlson et al. 2012). Прямая продукция knock-in животных с использованием targeting векторов, однако, используется не столь широко. Среди редких, успешных примеров, целенаправленная инсерция трансгена у нематод (Dickinson et al. 2013), морского ежа (Ochiai et al. 2012), мух (Beumer et al. 2008), рыбок данио (Zu et al. 2013), мышей (Cui et al. 2011; Yang et al. 2013) и крыс (Cui et al. 2011). С др. стороны, ssODN-обусловленные точные модификации генов описывались чаще (Bedell et al. 2012; Meyer et al. 2008; Gratz et al. 2013; Hwang et al. 2013; Lo et al. 2013; Wang et al. 2013; Wefers et al. 2013). Более сложное редактирование генома у животных было применено на практике, напр., DSB-обусловленные хромосомные делеции и инверсии у рыбок данио (Gupta et al. 2013; Xiao et al. 2013b). Редактирование генома животных суммировано в Table 1.
Table 1. Examples of various genome editing in animals reported so far (http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/doi/10.1111/dgd.12111/?isReportingDone=true) Для использования на животных быстрый и реальный скрининг мутантов является важным вопросом. В подтверждение фенотипических наблюдений, многие методы доступны для скрининга мутаций: метод детекции гибридной ДНК, такой как Cel-I (Guschin et al. 2010), high-resolution melting analysis (HRMA) (Dahlem et al. 2012), restriction fragment length polymorphisms (RFLP) (Ochiai et al. 2010; Ansai et al. 2013; Suzuki et al. 2013), heteroduplex mobility assay (HMA) (Ota et al. 2013), или детекция с помощью стандартного Sanger секвенирования или с помощью next-generation ДНК sequencing (NGS). Недавнее сравнение множественных методов скрининга (выявление фенотипических отклонений, RFLP анализ, HMA и ДНК секвенирование) выявило, что комбинаторное тестирование этих методов увеличивает эффективность скрининга мутантов (Nakagawa et al. 2013). Genome editing in cultured cells Разработка нуклеаз была обоснована на методах культивирования клеток и в свою очередь революционизировала модельные клеточные культуры in vitro. Обычный предварительный скрининг разработанных рекомбинантных нуклеаз обычно осуществлялся на HEK293T (human embryonic kidney) или клетках U2OS (osteosarcoma) с помощью проверки репарации плазмидных репортеров (Sakuma et al. 2013a) или оценки прямой хромосомной активности DSB (Reyon et al. 2012). Как и при использовании эмбрионов, HR-обусловленный таргетинг генов с донорской ДНК и NHEJ-обеспечиваемым разрушением генов может быть достигнут с помощью одновременной индукции или плазмид, экспрессирующих нуклеазу, или in vitro транскрибируемой РНК, при этом трансфекция РНК устраняет возможность случайной интеграции нуклеазных векторов. В отличие от животных моделей клеточные культуры делают возможной новую доставку нуклеаз; прямая трансдукция ZFN белка, очищенного от включенных телец, может создавать HEK293T, CHO (Chinese hamster ovary), HDF (human dermal fibroblasts), THP1 (human acute monocytic leukemia), и первичные CD4+ клетки, происходящие из периферической крови (Gaj et al. 2013). Клеточные культуры также предоставляют уникальные пути получения животных. Культивируемые мышиные ES клетки были одновременно и гомозиготно преобразованы по многим локусам, используя RGENs, контролируя сроки происхождения сложных линий мышей (Wang et al. 2013). Более того, обогащение модифицированных плодных фибробластов сделало возможным преобразовывать домашний скот с помощью комбинации с somatic cell nuclear transfer (SCNT) (Tan et al. 2013).
Примеры преобразования генома человека в культуре клеток в основном ограничены клетками с обширной пролиферативной способностью, таких как линии трансформированных клеток и взрослые или эмбриональные стволовые клетки. ZFNs были использованы для клеток K562 (линия клеток эритролейкемии человека) и преимущественно CD4+ T-клетки последовательно повреждаемые и затем репарируемые обе копии гена IL2RG - мутации в которых являются принципиальной причиной severe combined immunodeficiency (SCID) (Urnov et al. 2005). В попытке скорректировать генетические нарушения, эпителиальные стволовые клетки (Coluccio et al. 2013) и скелетные миобласты (Ousterout et al. 2013) были успешно модифицированы с помощью нуклеаз. В получении терапевтически преобразованных клеточных линий геномное редактирование ex vivo предоставляет преимущества контроля продукции качества перед доставкой пациенту. T клетки (Perez et al. 2008) и CD34+ гематопоэтические стволовые клетки (Holt et al. 2010), резистентные к HIV-1 инфекции, были получены ex vivo с использование геномного редактирования и CRISPR система была даже использована для нарушения латентного HIV-1 провируса и 'лечения' инфицированных T клеток (Ebina et al. 2013). Более того, комбинация коррекции гена с помощью человеческих induced pluripotent stem (iPS) клеток породила крупные надежды в регенеративной медицине и клеточной терапии при решении вопросов аутологических трансплантаций. Хотя и существует перспектива, разумно воздержаться от применения на человека in vivo при отсутствии абсолютной гарантии контролируемых повреждений ДНК вне мишени.
Для определенных биологических моделей, in vitro культуры клеток представляют большую гибкость платформы для испытаний. Это верно для вопросов биологии человека, где эксперименты in vivo непрактичны и в нравственном отношении спорны. Использование zinc-finger нуклеаз для нокаута WAS гена в K562 привело к созданию человеческой клеточной модели мегакариоцитов и синдрома Wiskott-Aldrich (Toscano et al. 2013). ES и iPS клетки предоставляют существенные преимущества для in vitro исследований биологии развития, т.к. они могут быть индуцированы к дифференцировке в давать почти любые клетки, обнаруживаемые в теле или даже сложные ткани (Lancaster et al. 2013). Для человека это единственный способ достижения стадии, подобной эмбриональной, или взрослых тканей. Появление технологии iPS клеток совпало с появлением эры геномного секвенирования, приведшей к специфичной для пациентов моделей болезни и к более прямому способу подтверждения эффектов генетического вклада в болезни или в чувствительность к лекарствам (Tiscornia et al. 2011). Экспериментальные стратегии по модификации iPS клеток, по крайней мере, частично сходны с модификациями др. культивируемых клеток, используя EENs (Hockemeyer et al. 2009, 2011) и RGENs (Cong et al. 2013; Mali et al. 2013a). Интересно, что эффективно продуцируемые клетки iPS от определенных генетических болезней, таких как анемия Фанкони, природа мутаций показала их пригодность для осуществление первой коррекции гена в соматических клетках пациента и затем для репрограммирования плюрипотентности (Raya et al. 2010).
Использование EENs или RGENs в культуре клеток является безусловно здравым, но необходимы уникальные размышления относительно непосредственного получения видоизмененных животных. Клеточные линии предоставляют преимущества по непосредственному клональному отбору и генотипированию, аналогичных скринингу потомства на желаемые мутации, возникающие от мозаичных животных основателей. Как при классическом генетическом таргетинге немодифицированные клетки могут быть элиминированы посредством маркеров резистентности к антибиотикам измененных генов (Capecchi 2005), которые могут быть позднее удалены с помощью сложных методов (Yusa et al. 2009). Альтернативное к селекционным кассетам, клональное выделение легких, лишенных маркеров мутаций, используется помещение одиночных клеток с помощью ограничивающих разведений или сортировки с помощью проточной цитометрии. При таких экспериментах суррогатные вектора со структурой, обогащенной для трансфекции и нуклеазной активностью, выделяет клетки с высокой вероятностью геномных модификаций (Kim et al. 2011). Несмотря на эти преимущества для селекции, культивируемые клетки ставят в тупик интересными головоломками тем, что они не могут быть разведены за исключением вторичных мутаций, вызываемых расщеплением вне мишени. Т.о., биоинформационное предсказание и эффективный скрининг необходимы для детекции таких мутаций. Более того, неспособность разведения мутаций до гомозиготности вызывает необходимость sequential targeting или высоко активных EENs/RGENs, которые могли бы одновременно воздействовать на оба аллеля, чтобы выявлять рецессивные фенотипы. Напротив, высокого уровня активность нуклеаз увеличивает шансы эффектов вне мишеней, угрожая чёткой интерпретации желаемых фенотипов. Технологии, которые повышают специфичность нуклеаз или улучшают выявление мутаций, необходимы для будущего развития технологий.
Perspectives Over just the last 3 years, EENs and RGENs have veritably revolutionized gene targeting. Although ZFNs have seen a much longer period of service, the simple construction of TALENs and CRISPRs are allowing these two newer methods to quickly take center stage in the genome engineering field. Clearly, a lingering concern for efficacious nuclease application is the potential for off-target effects, which may very well undermine precision engineering efforts. Recently, several reports have highlighted potent off-target cleavage by CRISPRs in cultured cells (Cradick et al. 2013; Fu et al. 2013; Hsu et al. 2013; Mali et al. 2013b; Pattanayak et al. 2013). The standing opinion at this time is, unfortunately, that the CRISPR system may allow for multiple mismatches in the target sequence, including PAM. This leniency in binding and cleavage will certainly lead to compounded risk in CRISPR multiplexing experiments. TALENs, on the other hand, are only active as dimers, with further limitations governed by spacer length. Moreover, even single TALEs have been shown to have relatively high specificities compared to CRISPR/Cas (Mali et al. 2013b). Considering various factors impacting the current state-of-the-art, the simple design of CRISPRs must be weighed against their tendency to tolerate mismatches. In this period of active tool development, innovative adaptations may ultimately overcome limitations in the present technology. Using the detailed examples and experiences in this issues’ collection of reports as a guide, we encourage industrious researchers to keep current, and choose the most appropriate methods in accordance with their intended applications.
|