Human pluripotent stem cells (hPSCs), которые включают human embryonic stem cells (hESCs) и human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), могут самообновляться неопределенно долго в культуре, сохраняя при этом способность становиться почти любым из типов клеток тела человека (Takahashi et al., 2007; Thomson et al., 1998; Yu et al., 2007). Потенциал использования hPSCs дл заместительной терапии и моделирования болезней активно обсуждается (Wu and Hochedlinger, 2011). Здесь основное внимание уделено аспекту: использования hPSCs для получения информации эмбрионального развития человека. Хотя этот потенциал давно известен (Keller, 2005; Pera and Trounson, 2004), он только начинает реализоваться благодаря успехам подходов дифференцировки in vitro и инструментам генетических манипуляций с hPSCs.

Данный обзор прежде всего сфокусирован на работах, осуществленных с использованием hPSCs, иногда с отсылками к исследованиям с использованием мышиных плюрипотентных клеток, когда подобные исследования недоступны ещё на клетках человека. Благодаря высокой степени сходства между hESCs и hiPSCs (Yamanaka, 2012), очень возможно, что генеральные стратегии и большинство заключений приложимо и к hESCs и к hiPSCs.

The need for a new model system

Мы накопили неслыханные количества знаний о геноме человека, физиологии и анатомии. Но имеется мало непосредственной информации о регуляции эмбрионального развития. Мутационный анализ наследственных болезней широко используется для идентификации потенциальных ассоциированных с болезнью генов, хотя этот подход сильно ограничен исследованиями дефектов, проявляющихся после рождения. Более того, функциональная оценка локусов риска сталкивается с сильными затруднениями. Т.к. мы не можем манипулировать с развитием человека тем же способом, как мы это делаем в экспериментах на мышах или плодовых мушках, большинство наших знаний о развитии человека экстраполированы с исследования модельных организмов. Эти исследования предоставляют фундаментальную информацию об генеральных принципах развития, а также о генах и сигнальных путях, которые контролируют специфические аспекты спецификации клеточных судеб и тканевого морфогенеза. Многие из этих генов и сигнальных путей выполняют законсервированные роли в развитии человека. Напр., генетические исследования на Drosophila продемонстрировали критические роли Hox генов в контроле плана тела и сходные роли Hox выполняют и в др. организмах, включая человека (Mallo et al., 2010). По практическим причинам мыши оказались преобладающей экспериментальной системой, с помощью которой моделируется развитие органов у человека. Мыши и люди имеют сходный размер генома. Они обладают 99% общих генов и обнаруживают существенное сходство своего развития, анатомии и физиологии. На сегодня мы имеет большой набор мощных генетических инструментов, пригодных для изучения развития мышей (Nagy, 2002). Напр., флюоресцентные белковые репортеры широко используются для визуализации динамических биологических процессов во время эмбрионального развития (Hadjantonakis et al., 2003), разработаны различные стратегии по отслеживанию клоенов, чтобы следить за потомками индивидуальных клеток (Kretzschmar and Watt, 2012) и получены многочисленные мутантные мыши для изучения функции генов в развитии (Capecchi, 2005). Ободряет, что мутации часто вызывают сходные фенотипы у мышей и людей. Напр., нулевые мутации pancreatic and duodenal homeobox 1 (Pdx1) или pancreas specific transcription factor 1a (Ptf1a) вызывают почти полное отсутствие поджелудочной железы у мышей (Jonsson et al., 1994; Kawaguchi et al., 2002; Krapp et al., 1998; Offield et al., 1996) и людей (Sellick et al., 2004; Stoffers et al., 1997).

Однако, не смотря на наличие мощного модельного организма, мыши обнаруживают некоторые заметные ограничения. Около 1% генов человека не обнаруживают своих гомологов у мышей (Waterston et al., 2002). Хотя большинство генов, как полагают, выполняют консервативные роли у мышей и людей, определенные видо-специфические различия существуют в период беременности, в морфологии и в пространственной и временной регуляции экспрессии генов во время эмбрионального развития. Поэтому мышиные модели не всегда полностью воспроизводят признаки болезней человека (Elsea and Lucas, 2002). Известный пример это hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Hprt), первый ген мутантный благодаря переносу гена, нацеленного на mouse embryonic stem cells (mESCs) (Doetschman et al., 1988; Thomas and Capecchi, 1987). У человека дефицит, HPRT вызывает синдром Lesch-Nyhan, нарушение, связанное с избыточной продукцией мочевой кислоты и нейрологической дисфункцией. Однако эти симптомы отсутствуют у Hprt мутантных мышей (Finger et al., 1988). В более недавнем примере гетерозиготные инактивирующие мутации в GATA6 были идентифицированы в более половине случаев у людей с агенезом панкреас (Allen et al., 2012). Однако, Gata6 гетерозиготные нулевые мыши не обнаруживают очевидных фенотипических отклонений, тогда как Gata6 гомозиготные нулевые мыши погибают во время гаструляции, не позволяя проанализировать фенотип поджелудочной железы (Morrisey et al., 1998). Недавнее исследование кондиционных нокаутов показало, что делеция как Gata4, так и Gata6 (т.e. потеря 4-х аллелей GATA генов) необходима, чтобы сгенерировать тот же самый панкреатический фенотип у мышей (Carrasco et al., 2012; Xuan et al., 2012). Имеются почти определенно множество др. генов, подобных GATA6 для которых существуют подобные расхождения между мышами и людьми, благодаря нескольким не исключающим взаимно возможностям: (1) видо-специфической потребности в гене; (2) перекрывающимися функциями с родственными генами видо-специфическим способом; и/или (3) различиям в чувствительности к дозе гена между людьми и мышами, как это наблюдается в развитии органов, таких как сердце и конечности (Bruneau, 2008; Wilkie, 2003). Следовательно, не редко можно промахнуться с критической функцией гена в развитии человека даже после тщательных исследований модельных мышей.

Др. препятствие заключается в трудности проведения исследований на мышах. С момента 'Гейдельбергского скрининга' на плодовых мушках, проведенного Christiane Nusslein-Volhard и Eric Wieschaus (Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980), генетический скрининг в модельных организмах стал инструментальным в помощь нашему пониманию эмбрионального развития и болезней человека. Такие скрининги довольно популярны у беспозвоночных видов, таких как Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster, хотя некоторые передовые генетические скрининги были также проведены на мышах (Acevedo-Arozena et al., 2008). Один такой скрининг привел к неожиданному открытию первичных ресничек как важных клеточных органелл для сигнальной трансдукции Hedgehog (HH) (Huangfu et al., 2003). Это исследование четко продемонстрировало необходимость проведения генетических скринингов у млекопитающих, т.к. реснички необходимы не только для передачи сигналов HH у Drosophila. Теоретически возможно проведение насыщающих скринингов на мышах, чтобы открыть все гены, участвующие в интересующем специфическом процессе. Однако существуют практические ограничения: деньги, время и пространство для содержания мышей, возникающих в результате скрининга геномного мутагенеза. Неотразимые доказательства указывают, что in vitro дифференцировка hPSCs воспроизводит аспекты развития человека и может быть использована в качестве новой модельной системы для изучения развития человека.

Modeling embryonic development using hPSCs

Thomson с коллегами получили первую линию hESC из культивируемых бластоцистов человека (Fig. 1A) (Thomson et al., 1998). Это случилось почти 2 десятка лет тому назад после получения первых mESCs (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Недавним прорывом стали, Yamanaka and Takahashi репрограммированные взрослые мышиные клетки в индуцированные плюрипотентные клетки при экспрессии 4-х транскрипционных факторов [Oct3/4 (Pou5f1), Sox2, Myc и Klf4] (Takahashi and Yamanaka, 2006). Спустя лишь год были получены и hiPSCs (Fig. 1B) (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007). Способность генерировать hiPSCs от выборок пациентов сделала их подходящими для изучения критических аспектов интересующих болезней (see section below), и для аутологической заместительной клеточной терапии (Wu and Hochedlinger, 2011). Fig. 1.

Две уникальные характеристики hPSCs сделали их одчень подходящими для изучения развития человека. Во-первых, hPSCs обладают потенциалом генерировать каждый тип клеток взрослых. Их система культивирования in vitro позволяет быстро и с небольшими затратами выяснять функцию гена во время специфического процесса развития. Во-вторых, hPSCs обладают неограниченной способностью к самообновлению, предоставляя богатый материал для высоко-производительного скрининга (HTS). Следовательно, hPSCs могут быть использованы не только для тестирования гипотезы стволовости, выдвинутой предыдущими исследованиями модельных организмов, но и для discovery-driven исследований посредством биологического и химического скрининга. Такие исследования базируются на мощных in vitro платформах дифференцировки, которые в точности воспроизводят эмбриональное развитие.

Embryoid bodies: a potential model of early embryogenesis

Будучи культивируемы в суспензии без питающих слоёв, hPSCs спонтанно формируют агрегаты, известные как эмбриоидные тела (EBs) (Itskovitz-Eldor et al., 2000). EBs обычно образуются из плотно упакованных клеток и превращаются в кистозные структуры, центр которых содержит полость, заполненную жидкостью. Формирование EB широко используется в качестве инициальной ступени во многих протоколах дифференцировки; клетки в EBs могут быть направлены по пути развития специфических клеточных клонов под действием сигналов дифференцировки (discussed below) (Schuldiner et al., 2000). Интересно, что определенная степень полярности и тканевой регионализации наблюдается во время формирования EB (Itskovitz-Eldor et al., 2000). Хотя и далекое от воспроизведения формирования паттерна у действительных эмбрионов, эта регионализация напоминает всё же гаструляцию, процесс, ответственный за образование трех эмбриональных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы.

Анализ профилей экспрессии в EBs человека продемонстрировал, что каскады генов, которые управляют гаструляцией и формированием зародышевых листков, активируются последовательно, которая, по-видимому, соответствует последовательным стадиям эмбрионального развития (Dvash et al., 2004). Среди них находятся гены, как известно, участвующие в формировании раннего паттерна, подтверждая использование EBs в качестве ценной модели для понимания молекулярных механизмов, которые лежат в основе раннего эмбриогенеза человека. Напр., человеческих EBs подтвердило, что LEFTY и NODAL, члены семейства transforming growth factor β (TGFβ) играют законсервированные роли в гаструляции эмбрионов человека (Dvash et al., 2007); ингибирование пути NODAL/LEFTY нарушает дифференцировку hESCs в мезодермальный клон. Однако видо-специфические различия также существуют. Используя EBs человека, чтобы воспроизвести развитие желточного мешка, было показано, что передача сигналов TGFβ ингибирует эндотелиальную дифференцировку, в противоположность своей роли у мышей (Poon et al., 2006). Следовательно, EBs человека предоставляют ценную модельную систему для изучения как законсервированных, так и не законсервированных механизмов раннего эмбриогенеза.

По сравнению с дифференцировкой в слипчивых культуральных условиях, трехмерная (3D) структура EBs предоставляет преимущества потенциально воспроизводящего комплекса клеток и тканевых взаимодействий. Напр., клетки, которые напоминают организатор гаструлы, были идентифицированы в EBs человека и эти клетки индуцировали вторую ось, когда трансплантировались в эмбрионы лягушки (Sharon et al., 2011). Эти находки подтверждают, что EBs человека могут предоставить информацию о становлении оси тела эмбриона человека. Однако, спонтанная дифференцировка EBs часто использует клеточные реакции на локальные сигналы морфогенов. Поскольку трудно контролировать в точности микроусловия в EBs, не всегда можно прямолинейно интерпретировать результаты экспериментов, базирующихся на EB. Помимо гетерогенности в размерах и временя развития EBs может также ограничивать их использование в качестве мощной модели раннего развития in vitro. Методы, разработанные для генерации EBs наиболее униформны и воспроизводимы. Напр., принудительная агрегация определяет количества hPSCs, а использование 3D microwell культур обнаруживает тенденцию генерации EBs, которые более униформны по размеру и морфологии (Mohr et al., 2010a; Ng et al., 2005). Др. исследование с использованием полужидкого 3D внеклеточного матрикса для поддержания образования EBs обнаруживало более организованные структуры зародышевых слоёв (Rust et al., 2006). Такие технологические усовершенствования могут привести к широкому использованию EBs для изучения раннего эмбриогенеза.

Modeling cell fate specification through directed differentiation

Чтобы исследовать специфический вопрос относительно детерминации клонов, необходимо разработать более определенные условия дифференцировки. Были разработаны разнообразные методы: большинство используют добавление рекомбинантных факторов роста или низкомолекулярных соединений, при этом многие методы используют условия слипчивых (adherent) культур, некоторые использую образование EB, а др. используют питающие клетки (Fig. 2). Мы суммировали ниже три ключевые аспекта направленной дифференцировки и подчеркнули строгую связь между дифференцировкой hPSC и эмбриональным развитием у модельных организмов. Fig. 2.

Во-первых, направленная дифференцировка обычно соответствует серии ступеней, которые воспроизводят процесс эмбрионального развития. Одним из первых онтогенетических событий является образование трех зародышевых листков посредством гаструляции; соотв., большинство протоколов использует сначала направление hPSCs по пути развития эктодермы, энтодермы или мезодермы, сопровождаемое серией ступеней, чтобы управлять дифференцировкой в направлении определенного интересующего типа клеток (Fig. 2) (Williams et al., 2012). Напр., чтобы генерировать эпителий сетчатки или фоторецепторы, hPSCs сначала дифференцируются в нейроэктодерму, затем в клетки, представляющие глазное поле; наконец, субнабор клеток подвергается со временем продвинутой дифференцировке в сетчатку, которая сильно напоминает развитие сетчатки человека (Meyer et al., 2009).

Во-вторых, каждая ступень дифференцировки ведется специфическими сигналами дифференцировки. Рекомбинантные факторы роста и низкомолекулярные соединения обычно используются, чтобы воспроизвести сигналы, которые, как известно, инструктируют эмбриональное развитие. Напр., согласно знаниям о формировании зародышевых листков во время гаструляции (Keller, 2005), hPSCs подвергаются воздействию высоких концентраций activin A (члена семейства TGFβ) для дифференцировки в энтодерму (D'Amour et al., 2005), bone morphogenetic protein 4 (BMP4) и activin A для дифференцировки в мезодерму (Yang et al., 2008), и воздействию ингибиторов передачи сигналов BMP и WNT для формирования эктодермы (Lamba et al., 2006) (Fig. 2). То же самое верно для более поздних ступеней дифференцировки. Для иллюстрации, генерация клеток панкреатических предшественников из hPSCs (D'Amour et al., 2006) нуждается в использовании множественных сигнальных путей, которые играют роль в спецификации поджелудочной железы, включая активацию ретиноевой кислоты и передачу сигналов fibroblast growth factor 10 (FGF10) и ингибирование передачи сигналов HH (Cleaver and MacDonald, 2010). Прежде, когда знания об эмбриональном развитии ещё не были доступны, единственной стратегией воспроизведения in vivo условий было использование клеток, выделенных из физического местоположения, где необходимый тип клеток обычно появлялся. В элегантном недавнем исследовании, напр., определенные сигнальные воздействия были впервые использованы для дифференцировки mESCs в эктодерму и затем в отические предшественники (Oshima et al., 2010). Эти отические предшественники были затем помещены на слой стромальных клеток из внутреннего уха, чтобы вызывать образование сенсорных волосковых клеток. Итак, эти исследования продемонстрировали, что детерминация клонов во время дифференцировки hPSC может воспроизводить эмбриональное развитие и использует сходные сигнальные события.

Наконец, качественные особенности типов клеток, происходящих из hPSC, оценивали путем сравнения с их аналогами in vivo. Постоянно растет список типов клеток, генерируемых из hPSCs (Williams et al., 2012). Обычно первой ступенью оценки является проверка экспрессируемых in vivo специфических маркеров, часто используется информация от исследований на мышах. Более строгая функциональная оценка осуществляется исходя из наших знаний о физиологических функциях клеток. Напр., трансплантированные происходящие hESC клетки ретинальных предшественников, как было установлено, дифференцировались в функциональные фоторецепторы и восстанавливают некоторые реакции на свет у слепых модельных мышей (Lamba et al., 2009). Другое недавнее исследование получило dopaminergic (DA) нейроны, которые обладали сходными электрофизиологическими свойствами, что и эндогенные DA нейроны (Kriks et al., 2011). Будучи трансплантированными в животные модели болезни Паркинсона, такие происходящие из hPSC DA нейроны полностью устраняли вызываемое лекарствами поведение верчения и реципиентные мыши и крысы демонстрировали улучшение в тестах по использованию передних лап по контролю произвольных движений.

Осложнения функционального анализа происходящих из hPSC клеток, однако, базируются на том факте, что желательные типы клеток присутствуют в культуре для дифференцировки вместе со многими др.типами клеток и терапевтическое использование таких смешанных популяций клеток спорно. Одно исследование, напр., использовало hPSCs для генерации клеток, похожих на предшественники поджелудочной железы, которые, по-видимому, давали функциональные, чувствительные к глюкозе панкреатические ?-cells спустя 3 мес. после трансплантации immunocompromised мышам (Kroon et al., 2008). Однако культура для дифференцировки содержала энтодермальные клетки на разных стадиях дифференцировки, а также различные типы клеток из не энтодермальных клонов. Это ставит барьер в терапевтическом использовании таких клеток, из-за проблем с образованием тератом и непредсказуемых эффектов от смешанной популяции. Кроме того, трансплантации таких популяций смешанных клеток и продолжительное время дифференцировки in vivo также порождают сомнения относительно источника ?-cells ,образующихся после трансплантации и делает затруднительной идентификацию точных сигналов, необходимых для спецификации и созревания ?-cells. Последующее исследование той же самой группы выявило маркеры клеточной поверхности, которые могут быть использованы для обогащения клеток панкреатических предшественников с целью трансплантации (Kelly et al., 2011). Хотя клетки не были обогащены до чистоты, это безусловно важная ступень вперед к лучшему функциональному пониманию происходящих из hPSC клеток. Др. исследование также показало, что возможно продуцировать более чисты популяции клеток мишеней благодаря обогащению клеток предшественников наиболее ранних ступенях дифференцировки (Cai et al., 2010). Кроме того, более точно контролируемые культуральные условия на более ранних стадиях дифференцировки также могут снизить гетерогенности в популяции клеток мишеней. Напр., обработка как высокими, так и низкими дозами activin генерирует одинаковый процент энтодермальных предшественников инсулин-экспрессирующих клеток на более поздних стадиях (D'Amour et al., 2006). Будущий функциональный анализ возможно будет более благоприятным благодаря улучшениям протоколов дифференцировки, а также методам обогащения, которые будут базироваться на идентификации специфических маркеров клеточной поверхности или на разработке настоящих флюоресцентных репортеров (see below).

Understanding human development: insights gained from studying hPSCs

Поддержание плюрипотентности в hPSCs представляет огромный интерес для биологов стволовых клеток. Знание, получаемое из этих исследований, хотя и не всегда непосредственно приложимо к эмбриональному развитию, однако существенно улучшает наше понимание взаимодействие сигнальных трансдукторов, транскрипционных факторов и эпигенетических регуляторов во время развития в целом. Напр., транскрипционная пауза после связывания промотора и инициацией транскрипции впервые была описана для hESCs благодаря геномному анализу гистоновых модификаций (Guenther et al., 2007). Дальнейшие исследования на рыбках данио и мухах показали, что такие свойства паузы перед транскрипцией также присутствуют в дифференцированных типах клеток и могут вносить вклад в детерминацию клеточных судеб во время эмбрионального развития (Bai et al., 2010; Zeitlinger et al., 2007).

Вообще-то более важно, что hPSCs стали модельной системой для исследования непосредственных механизмов, которые лежат в основе эмбрионального развития. Ясно, что информация, полученная из исследований модельных организмов существенно облагчает поиск определенных условий для направления выбора hPSCs специфической судьбы (Fig. 3). Это подтверждает общее заключение, что большинство онтогенетических механизмов законсервированы. Можно утверждать, что лучшим способом оценки наего понимания эмбрионального развития является использование hPSCs для воспроизведения тех же самых процессов in vitro. Однако специфичные для человека регуляция и сигнальные пути очевидны. Напр., спецификация нейроэктодермы является одним из наиболее изученных процессов во время гаструляции. Недавнее исследование показало, что Pax6 необходим и достаточен для спецификации нейроэктодермы из hESCs, но не из mESCs (Zhang et al., 2010). Более того, hPSCs предоставляют также уникальные преимущества для изучения законсервированных механизмов развития. Напр., точная роль передачи сигналов TGFβ в развитии поджелудочной железы является предметом споров у мышей (Harmon et al., 2004; Sanvito et al., 1994; Tei et al., 2005; Tulachan et al., 2007; Wandzioch and Zaret, 2009), в основном благодаря зависимой от времени потребности в передаче сигналов TGFβ dj время развития поджелудочной железы. Подобно многим др. генам и сигнальным путям, передача сигналов TGFβ используется многократно во время эмбрионального развития. Чтобы обойти ограничения функции плейотропных генов в исследованиях in vivo, часто необходимы серьезные усилия по генерации кондиционных нокаутов или гипоморфных аллелей, тогда как относительно удобнее манипулировать с передачей сигналов TGFβ (или др. интересующих белков) во время специфического периода времени с использованием hPSCs. Недавние базирующиеся на hPSC исследования показали, что передача сигналов TGFβ ингибирует дифференцировку панкреатических предшественников в эндокринный клон - клон который дает ?-cells (Nostro et al., 2011; Rezania et al., 2011).Fig. 3.

Prospects and potential challenges of using hPSCs as a developmental model

Благодаря направленной дифференцировке hPSCs, биологи развития сегодня получили беспрецедентный доступ к широкому разнообразию происходящих из hPSC типов эмбриональных клеток человека и к ранним онтогенетическим процессам. Однако затруднения остаются. Напр., существует заметная гетерогенность между линиями hPSC в отношении их способности дифференцироваться в разные клоны клеток (Hu et al., 2010; Osafune et al., 2008). Поэтому часто необходима специфичная для hPSC-линий оптимизация, чтобы приспособить протоколы дифференцировки в разных группах исследователей. Несколько факторов вносят вклад в такую гетерогенность среди линий hPSC, включая генетический фон, происхождение и культуральные условия. В самом деле, эпигенетические различия были выявлены между разными hPSC линиями или в одной и той же линии после нескольких пассажей (Mekhoubad et al., 2012; Nazor et al., 2012). Для induced pluripotent stem cells (iPSCs), эпигенетическая память об их тканевом происхождении (Bar-Nur et al., 2011; Kim et al., 2010; Polo et al., 2010), а также генетические и эпигенетические альтерации во время репрограммирования и последующего размножения клеток (Gore et al., 2011; Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011; Lister et al., 2011; Mayshar et al., 2010) могут вносить вклад в ещё большую гетерогенность. Существование гетерогенности среди hPSC линий подчеркивает важность оценки находки с использованием многих линий клеток.

Др. главное затруднение связано с трудностью генерации зрелых функциональных типов клеток. Напр., in vitro дифференцировка происходящих из hPSC панкреатических предшественников генерирует в основном незрелые ?-cells с низкой чувствительностью к глюкозе (D'Amour et al., 2006). Трудности с генерацией зрелых клеток могут быть просто связаны с трудностями воспроизведения длительного периода времени развития в условиях in vitro; dj время развития человека, insulin-секретирующие клетки, по-видимому, появляются приблизительно 2 мес. спустя после зачатия, но регулируемая стимулируемая глюкозой секреция инсулина происходит только после рождения (Espinosa de los Monteros et al., 1970). Недавнее исследование, использующее серию химических ингибиторов, чтобы специально ускорить приобретение судьбы взрослых клеток, в данном случае нейрональных клеток, оказалось втрое более эффективным (Chambers et al., 2012). Эта стратегия может быть использована и в отношении др. типов клеток, хотя остается неясным, использует ли 'ускоренное развитие' эмбрионов тот же самый сигнальный каскад, что и при нормальном эмбриональном развитии. Вторым препятствием является отсутствие знаний о ключевых сигналах, необходимых для финальной ступени созревания. В самом деле, в сравнении с огромным количеством знаний о раннем развитии, мы знаем относительно мало о терминальной дифференцировке. Т.к. большинство протоколов дифференцировки смоделировано для развития мышей, у которых ключевые специфичные для человека компоненты могут отсутствовать. Крупномасштабный химический и биологический скрининг (discussed below) может помочь в идентификации некоторых из отсутствующих компонентов. Наконец, часто упускаемый аспект, что могут генерироваться не функциональные клетки из-за проблем в более ранних ступенях дифференцировки. Напр., DA нейроны могут быть сгенерированы с помощью или rosette- или floor-plate-based протоколов; однако, только второй подход, по-видимому, воспроизводит в точности развитие DA нейронов среднего мозга и чтобы получить функциональные DA нейроны, которые эффективно приживляются в животных моделях (Kriks et al., 2011). Этот результат подчеркивает необходимость воспроизведения в точности онтогенеза клеток. В др. примере, по-видимому, тривиальная ступень оптимизации на первой стадии дифференцировки (дефинитивной энтодермы) ведет к достоверному увеличению экспрессии ?-cell маркеров несколько более поздней стадии (Nostro et al., 2011). Т.к. генерация терминально дифференцированных клеток почти всегда нуждается во множественных ступенях дифференцировки, то эти находки подчеркивают важность оптимизации каждой данной ступени дифференцировки и установления каждого промежуточного типа клеток.

Наконец, в отличие от детерминации клонов, некоторые аспекты развития, такие как тканевой морфогенез и формирование паттерна не могут быть легко воспроизведены с использованием современных протоколов дифференцировки. Это также может ставить препятствие при изучении детерминации клонов клеток, которая базируется на межтканевых взаимодействиях для собственно их спецификации, созревания и жизнеспособности. Некоторые недавние исследования успешно генерировали 3D органы или 'органоиды' из hPSCs. А одном из примеров, hPSCs были проведены через дефинитивную энтодерму, заднюю энтодерму и заднюю кишку, прежде чем они смогли сформировать эпителиальную трубку задней кишки, которая отпочковывалась в виде плавающих сфероидов (Spence et al., 2011). Будучи культивируемые в условиях, которые поддерживают рост взрослого кишечного эпителия, эти происходящие из hPSC сфероиды развивались далее в кишечные органоиды, состоящие в основном из плодных кишечных типов клеток. Описаны также некоторые 3D нервные и железистые тканевые структуры Sasai and colleagues (Eiraku et al., 2011; Eiraku et al., 2008; Nakano et al., 2012; Suga et al., 2011). Наиболее разительны пример, происходящий из mESC ретинальный эпителий, спонтанно формирующий бокало-подобные полусферические эпителиальные пузырьки, напоминающие оптические бокалы (Eiraku et al., 2011), и сходные находки были недавно описаны при использовании hESCs (Nakano et al., 2012).

Modeling human diseases using hPSCs

Помимо исследований нормального развития hPSCs открывают также путь по воспроизведению аномального развития и исследования патогенеза болезней человека. Многие имеющие отношение к болезням клетки, такие как нейроны, не очень доступны у пациентов. Следовательно, животные модели, особенно мыши, широко используются, чтобы понять патогенез болезней человека. Однако мышиные модели не всегда воспроизводят фенотипические проявления людей. hPSCs, несущие ассоциированные с моделью генетические модификации, могут преодолеть эти ограничения за счет предоставления неограниченного источника любых связанных с болезнью типов клеток человека и онтогенетической токсикологией (van Dartel et al., 2010).

Имеющие отношение к болезни hPSCs могут быть получены за счет нескольких подходов. Эмбрионы человека с генетическими дефектами, идентифицированными с помощью preimplantation genetic diagnosis (PGD), могут быть использованы для создания hESCs для изучения болезней, вызываемых хромосомными аномалиями и известными связанными с болезнью мутациями (Maury et al., 2012). Кроме того, такие исследования могут приводить к лучшему пониманию спонтанных абортов во время ранней беременности, причины которых остаются плохо изученными (Macklon et al., 2002). Однако, PGD эмбрионы доступны только при ограниченном числе болезней человека. Это ограничение может быть преодолено, т.к. сегодня возможно получение iPSCs от индивидов с широким кругом болезней, включая моногенные заболевания, такие как spinal muscular atrophy (SMA) и сложные болезни, такие как болезнь Паркинсона (Wu and Hochedlinger, 2011). Разработка этих базирующихся на iPSC моделей болезней может позволить исследователям изучить роль специфического гена на выбор клеточной судьбы в ходе развития и на физиологические функции имеющих отношение к болезни клеток. В первых исследованиях проверки принципов, iPSCs получали от индивидов с SMA, которые были дифференцированы в двигательный нейроны со сходной эффективностью относительно iPSCs от незатронутых матерей индивидов. Однако продожительные культуры выявили достоверное уменьшение количества двигательных нейронов, что соответствовало фенотипу болезни с избирательной потерей двигательных нейронов (Ebert et al., 2009). Хотя это исследование подтвердило огромный потенциал использования iPSCs, чтобы моделировать специфические патологические условия, связанные с наследственной болезнью, вариации среди клеточных линий hiPSC могут влиять на их использование во время моделирования болезни. Хотя возможно контролировать условия возникновения и культивирования и тип клеток, используемых для генерации hiPSCs, невозможно полностью устранить генетические вариации в hiPSC линиях, получаемых от двух разных индивидов. Приемлемым решением этой проблемы является продукция изогенных hPSC линий, которые отличаются только по вызывающей болезнь генетической модификации(ям). hESC линии были получены, чтобы создать мутации HPRT для моделирования синдрома Lesch-Nyhan (Urbach et al., 2004; Zwaka and Thomson, 2003). В отличие от мышиной модели, мутантные клетки человека обнаруживают достоверное накопление мочевой кислоты, подтверждая пригодность использования генетически модифицированных hPSCs для моделирования болезней.

New genetic tools for hPSC research

Чтобы использовать hPSCs для изучения развития и болезней человека важно разработать модные генетические инструменты. Сила и слабость трансгенных подходов рассмотрена др. (Giudice and Trounson, 2008); конечно основными преимуществами являются удобство и экспериментальная выполнимость подходов, тогда как недостатки включают позиционные эффекты, вариации копий генов и замалчивание трансгенов. Мы сфокусируемся на подходах генного таргетинга, который в последние годы подвергся существенной трансформации и может революционизировать генетические исследования hPSCs.

Gene targeting mediated by ZFNs and TALENs

Генный таргетинг означает внесение сайт-специфических модификаций в геном с помощью гомологичной рекомбинации (HR). Этот подход широко используется у мышей, чтобы генерировать нулевые (с полной потерей функции) или гипоморфные (с частичной потерей функции) мутации или создавать репортерные гены для отслеживания экспрессии эндогенных транскриптов. С момента первого успешного таргетинга мышиного гена Hprt (Doetschman et al., 1987; Thomas and Capecchi, 1987), многочисленные гены мыши были преобразованы. Однако лишь небольшое количество локусов оказалось успешно изменено, используя обычные методы таргетинга для hPSCs, из-за низкой специфичности HR (Hockemeyer and Jaenisch, 2010). Сегодня эта позиция изменилась.

Давно известно, что индукция DNA double-stranded break (DSB) в локусах мишенях значительно усиливает эффективность HR (Puchta et al., 1993; Rouet et al., 1994; Smih et al., 1995). Исходя из этой идеи были разработаны два метода для внесения DSBs в сайт мишень. Для этого использовали zinc-finger nucleases (ZFNs; see Box 1); ис недавних пор transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs; see Box 1). Эти преобразованные химерные белка состоят из разделенных ДНК-связывающего и ДНК-расщепляющего доменов, которые позволяют им действовать как 'геномные ножницы', которые могут вызывать разрывы ДНК в специфических локусах генома. В присутствии донорского фрагмента ДНК, содержащего гомологичные плечи с локусом мишенью, HR-обеспечиваемая репарация ДНК приводит к инсерции донорской последовательности ДНК в специфический геномный локус. Этот подход может быть использован для генерации точковых мутаций, геномных делеций и инсерций репортерных генов.

Box 1. Designer ZFNs and TALENs for gene targeting

Zinc-finger nucleases (ZFNs) are engineered chimeric proteins composed of a zinc-finger DNA-binding domain and a FokI DNA cleavage domain (see figure; colored blocks represent zinc-finger motifs, which are color coded for different binding specificity to DNA triplet sequences). Zinc fingers are among the most common DNA-binding motifs in eukaryotic transcription factors. When Pavletich and Pabo described the first crystal structure of zinc fingers bound to DNA (Pavletich and Pabo, 1991), they immediately recognized the potential of designing artificial DNA-binding proteins based on the simple modular zinc-finger/DNA interaction: each finger primarily interacts with three nucleotides in DNA. Chandrasegaran and colleagues went one step further, and engineered the first ZFNs to cleave DNA at a predetermined site (Kim et al., 1996). To target a specific genomic locus, a pair of ZFNs is designed to bind to DNA in opposite orientation with a defined space in between. In the presence of a donor DNA fragment containing homology arms to the target gene, homologous recombination-mediated DNA repair will result in the insertion of donor DNA sequence into the specific genomic locus.

Transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs) составляют новый класс ДНК-связывающих белков - TAL эффекторы - идентифицируемые в Xanthomonas, группе бактериальных растительных патогенов (Boch and Bonas, 2010) (see figure; окрашенные блоки, представляющие повторы TAL эффекторов, которые окраской означают разную специфичность связывания с мишенями в одиночный нуклеотид). Они имеют уникальный ДНК-связывающий домен, состоящий из повторяющихся единиц, каждый из которых распознает один специфический нуклеотид (Boch et al., 2009; Deng et al., 2012; Mak et al., 2012; Moscou and Bogdanove, 2009). Этот простой код делает его более удобным для преобразования искусственных TAL ДНК-связывающих доменов, чем цинковые пальчики для распознавания специфических ДНК последовательностей. Подобно ZFNs, проектировщик TALENs может быть создан путем слияния TAL ДНК-связывающего домена с FokI ДНК расщепляющим доменом (Cermak et al., 2011; Miller et al., 2011). TALEN-обеспечиваемый генный таргетинг уже был использован для линий hPSC с минимальными побочными эффектами (Hockemeyer et al., 2011).

Использование ZFNs или TALENs значительно улучшает эффективность генного таргетинга по сравнению с традиционными методами. Это даже более удобно, т.к. только короткие гомологичные плечи (~500 bp или даже короче) необходимы в противоположность обычно значительно более длинным гомологичным плечам (2-6 kb или даже длиннее), используемым при обычном генном таргетинге. Используя однонитчатые ДНК oligos (ssDNA) в качестве донора, длина каждого гомологичного плеча может быть далее уменьшена до ~40 bp, с полной длиной донорской ssDNA составляющей всего ~100 bp (Chen et al., 2011; Liu et al., 2010); это недавно было применено к hPSCs (Soldner et al., 2011). Более короткие гомологичные плеча могут снизить время, необходимое для генерации донорской ДНК матрицы и повысить эффективность трансфекции.

Эти новые технологии редактирования генов, как полагают, существенно ускорят шаги использования hPSCs линий для изучения развития и болезней. В недавнем исследовании были получены точковые мутации в гене, кодирующем, ?-synuclein, чтобы смоделировать болезнь Паркинсона (Soldner et al., 2011). Генерация изогенных клеточных линий, которые отличаются только мутациями, ассоциированными с болезнью, будет неоценимой для отличия ассоциированных с болезнью фенотипов от фоновых шумов. Помимо генерации репортерных линий и модификации эндогенных генов, ZFNs и TALENs могут также помочь в целенаправленном получении трансгенов для избранного геномного локуса. По сравнению со случайной интеграцией трансгена, целенаправленный трансгенез обладает рядом преимуществ: место интеграции может быть выбрано, чтобы сделать возможной реальную экспрессию, и только одиночная копия трансгена может быть внесена. Сайт-специфический трансгенез впервые был использован для внесения трансгена в локус Hprt у mESCs 16 лет тому назад (Bronson et al., 1996). С тех пор мышиный ROSA26 локус, был идентифицирован при скрининге генных ловушек Philippe Soriano с коллегами (Zambrowicz et al., 1997), стал затем более широко использоваться для инсерции трансгенов в определенный локус. Идентифицируя сходные трансгенные safe-harbor локусы (see Box 2) в геноме человека можно будет сделать выполнимым исследование геной функции во время дифференцировки hPSC differentiation. Заметим, локус adeno-associated virus site 1 (AAVS1), по-видимому, является хорошим кандидатом на роль такого локуса: около половины клонов корректно вставляются (targeted) при ZFN- или TALEN-обеспечиваемым экспериментам по геному таргетингу (Hockemeyer et al., 2009; Hockemeyer et al., 2011). Соответственно, могут быть осуществлены непосредственные исследования с избыточной экспрессией гена или нокаутом в hPSCs путем целенаправленного внесения кДНК или shRNAs в локус AAVS1. Напр., используя ZFNs, возможно целенаправленно воздействовать как на AAVS1 аллели в in trans положении с одиночном эксперименте для экспрессии M2rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator), так и чувствительный к тетрациклину элемент, который управляет экспрессией интересующего гена для гибкого временного контроля экспрессии гена (DeKelver et al., 2010).

, как было установлено,

Box 2. Choosing transgene safe harbors

A transgene safe harbor must satisfy a number of criteria: (1) the locus should allow ubiquitous sustained transgene expression without affecting expression of neighboring genes; (2) integration of the transgene should not disrupt an essential endogenous gene or affect the maintenance or differentiation of hPSCs; and (3) the gene targeting efficiency should be relatively high to facilitate rapid, efficient transgenesis experiments. It is worth noting that more stringent criteria have been proposed for transgene safe harbors in therapeutic applications (Papapetrou et al., 2011). Three promising loci have been identified so far: the human ortholog of the mouse ROSA26 locus (Irion et al., 2007), the chemokine (CC motif) receptor 5 (CCR5) gene locus (Lombardo et al., 2007) and AAVS1 (also known as PPP1R12C) (Smith et al., 2008). These loci have been extensively discussed in a recent review in the context of gene therapy (Sadelain et al., 2012).

Gene targeting in hPSCs: prospects and challenges

Мы ожидаем, что такие технологии окажут выраженное влияние на исследования биологии развития и болезни с использованием hPSCs. Задачи на будущее включают дальнейшее улучшение эффективности ZFNs и TALENs для генерации ДНК разрывов, минимизации расщеплений вне мишени и увеличения эффективности трансфекций. Недавние улучшения по оптимизации основы ZFN и TALEN и методов детекции мутаций (Bedell et al., 2012; Miller et al., 2011) , как полагают, сделают генный таргетинг в hPSCs более пригодным, эффективным и подходящим по цене. В то же самое время, др. технологии будут улучшать далее эффективность генного таргетинга в hPSCs, такие как использование helper-dependent adenoviral vectors (HDAdVs) (Aizawa et al., 2012; Suzuki et al., 2008). Вместо создания локус-специфических DSBs, HDAdVs обладает высокой клонирующей способностью (вплоть до ~25-35 kb ДНК), и делает возможным использование значительно более длинных гомологичных плеч, что может увеличить эффективность HR. Защита аденовирусных геномов с помощью терминального белка м. также снизиить случайные интеграции при HDAdV-обусловленном генном таргетинге.

Discovery-driven research using hPSCs

Генетический скрининг является мощным подходом, с помощью которого идентифицируются новые регуляторы развития. Неограниченная способность к самообновлению hPSCs делает их очень подходящими для крупномасштабного генетического скрининга. Недавние успехи в HTS технологиях, включая автоматизированные роботы и системы наблюдения, делают это выполнимым для крупномасштабного скрининга. Упомянутые выше генетические инструменты д. облегчить отслеживание или изоляцию интересующих типов клеток при таких скринингах.Fig. 4.

Chemical screens

Химический скрининг (see Box 3) является привлекательным подходом, при котором чтобы идентифицировать соединения, которые способствуют дифференцировке hPSCs в специфические клоны клеток. Последующая идентификация молекулярных мишеней ключевых соединений, не всегда прямолинейна, можно открыть новые гены и сигнальные пути, используемые для процесса дифференцировки. Некоторые высоко продуктивные скрининги были предприняты, чтобы идентифицировать химические соединения, которые влияют на выбор hPSCs или самообновляться или дифференцироваться (Barbaric et al., 2010; Desbordes et al., 2008; Zhu et al., 2009). Один из таких скринингов продемонстрировал, что агонист protein kinase C (PKC) увеличивает количество панкреатических предшественников, происходящих из hPSCs (Chen et al., 2009). Осталось посмотреть, играет ли передача сигналов PKC сходную роль in vivo и каков её механизм действия. Будущие исследования in vivo безусловно установят биологическое значение передачи сигналов PKC и др. биологических мишеней, идентифицируемых в разных химических скринингах на hPSCs.

Box 3. Chemical screens

Chemical libraries are typically supplied in an arrayed format, such that each chemical occupies a unique well of a multi-well plate (e.g. 96- or 384-well plate). The effects of chemicals can be determined by a variety of high-throughput screen assays, such as fluorescent reporter assays, luciferase-based reporter assays and assays for cell morphology and function. Notably, high-content image-based assays allow acquisition of multiple cellular features simultaneously, thus enabling investigation of complex cellular behaviors. Successful chemical screens rely on the establishment of robust directed differentiation platform, and access to chemical libraries and high-throughput equipment for compound application and image analysis. There is also the challenge of identifying the biological target(s) of a hit compound. Finally, chemical screens are limited by the number of genes that can be effectively targeted, which may be overcome by increasing the structural diversity of compounds in chemical libraries.

RNAi screens

Открытие RNA interference - замалчивания гена с помощью двунитчатой РНК - не только трансформировало наше понимание регуляции генов, но и также предоставило мощный инструмент для исследования, с помощью которого исследуется непосредственно функция гена. В последние годы RNAi становится всё более популярной как эффективный инструмент для геномного, высокопроизводительного анализа генной функции не только у классических модельных организмов, таких как C. elegans и D. melanogaster, но и также в культивируемых клетках человека и мыши (Mohr et al., 2010b). RNAi скрининги обычно проводятся с помощью или базирующейся на small-interfering RNA (siRNA) временной трансфекции или с помощью базирующемся на шпилечных РНК (shRNA) стабильном генном нокдауне (see Box 4, Fig. 4).

Box 4. RNAi screens

A standard small-interfering RNA (siRNA) library is composed of chemically synthesized 21 nucleotide siRNAs supplied in an arrayed format. Transfection of siRNAs into target cells can transiently downregulate target genes, thus providing a convenient way to screen for loss-of-function phenotypes. Short hairpin RNAs (shRNAs) are typically cloned into retro- or lentiviral vectors, which allows integration of the shRNA expression cassette into the host genome for sustained expression. Several genome-wide shRNA libraries have been constructed, including the Netherlands Cancer Institute (NKI) libraries (Berns et al., 2004), the RNAi consortium (TRC) libraries (Moffat et al., 2006) and the Hannon-Elledge libraries (Paddison et al., 2004; Silva et al., 2005). More recently, Cellecta has released the Decipher libraries available to the research community free of charge.

Высоко-производительный RNAi скрининг в клетках млекопитающих может проводиться или в упорядоченном (arrayed) (siRNA and shRNA libraries) или pooled формате (shRNA libraries) (Fig. 4). Т.к. подвергающиеся действию гены каждый хорошо известен при arrayed скрининге, идентификация гена мишени является прямолинейной когда наблюдается соотв. фенотип. Однако широкое использование этого метода ограничивается несколькими факторами, включая высокую цену реагентов и роботехнику и оснащение, необходимое для детекции фенотипа. При pooled скрининге, эффекты индивидуальных shRNAs идентифицируются по их обогащению или истощению в популяциях клеток мишеней. Анализ микромассивов использовался при ранних скринингах чтобы обнаруживать изменения в количествах shRNA (Berns et al., 2004; Paddison et al., 2004). Недавние успехи next generation sequencing открывают теперь более количественную и менее дорогую альтернативу. По сравнению с arrayed форматом pooled формат менее трудоёмкий и более осуществим в стандартных лаб. условиях. Однако pooled скрининг зависит от методов выбора клеток мишеней и несовместим с базирующимся на изображениях высокого содержания анализом.

Несколько RNAi скринингов было проведено на разных шкалах для изучения самообновления mESCs (Ding et al., 2009; Fazzio et al., 2008; Hu et al., 2009; Ivanova et al., 2006; Jian et al., 2007; Zhang et al., 2006), и только один скрининг был проведен на hESCs (Chia et al., 2010). Используя геномную библиотеку siRNA, этот скрининг успешно идентифицировал PRDM14 в качестве нового регулятора самообновления hPSC. Такого типа скрининг не был ещё произведен для изучения специфических аспектов эмбрионального развития. В связи с быстрой разработкой лучше управляемых протоколов дифференцировки и мощных генетических инструментов для продукции настоящих репортерных линий, теоретически становится возможным впервые становление реальной платформы для дифференцировки, затем для генерации тканеспецифических флюоресцентных репортеров и в конечном итоге использование или pooled или arrayed скрининга для идентификации генов, которые регулируют спецификацию интересующих типов клеток (Fig. 4).

Одно из потенциальных препятствий по HTS может заключаться в продолжительности протокола дифференцировки для некоторых типов клеток, которая будет длиться, по крайней мере, недели или даже месяцы. Поскольку множественные ступени дифференцировки скорее всего участвуют в таких случаях, то индивидуальный скрининг может быть разработан для изучения каждой специфической ступени дифференцировки. Этот подход подобно кондиционному нокауту in vivo также позволит обойти такие препятствия, как ранняя летальность и генная плейотропия, встречающиеся при генетическом скрининге мышей. В то же самое время др. методы генетического скрининга могут возникнуть, которые будут комплементарны RNAi скринингу. Крупномасштабный инсерционный мутагенез был использован для генерации библиотеки mESCs, несущих мутации всех белок-кодирующих генов (Gragerov et al., 2007; Skarnes et al., 2011). Использование in vitro этих библиотек ограничено из-за того, что рецессивные фенотипы нуждаются в гомозиготных мутантных аллелях. Недавно стало возможно получать гаплоидные mESCs, которые обладают потенциалом генерировать широкий круг дифференцированных типов клеток, включая зародышевые клетки как in vitro, так и эмбрионы (Elling et al., 2011; Leeb et al., 2012; Leeb and Wutz, 2011; Li et al., 2012; Yang et al., 2012). При комбинировании инсерционного мутагенеза, гаплоидные mESCs могут предоставить пригодную платформу для генетического скрининга in vitro. Сходным образом, такая платформа может быть разработана для клеток человека посредством использования инсерционного мутагенеза и становления гаплоидных линий hPSC. Мы ожидаем, что беспристрастный генетический скрининг с использованием RNAi или более новых, еще не разработанных методов, сможет революционизировать открытие генов для развития человека.

Conclusions

Knowledge gained from studies of model organisms has clearly furthered our understanding of human development and has guided our efforts to generate specific cell types from hPSCs. Technological advancements in recent years have now presented us with an exciting opportunity to use hPSCs to gain novel insights into human embryonic development. We anticipate that hPSC-based research, combined with studies of classic model organisms, will teach us how human embryos develop. This knowledge will not only help us understand the underlying causes of human diseases, but will also guide our efforts to develop treatments for these diseases. For example, the generation of functional mature cell types from hPSCs will be useful for cell replacement therapy, in vitro disease modeling and drug discovery. Will hPSCs become a favorite model of choice for developmental biologists? It is too early to say. Further development of this new model system will require the same kind of open-mindedness that has propelled the progress of previous model organisms in biology.

One future challenge of hPSC-based studies lies in validating the in vivo relevance of any in vitro findings. An obvious strategy is to use mouse models to investigate gene function during development, as we expect most genes will play conserved roles in mice and humans. However, there are clearly genes that do not exhibit conserved functions between mouse and human, and there is currently no clear strategy for investigating such genes. One solution is to engraft genetically modified hPSCs into animal models, such as mouse embryos or adult mice, in order to observe developmental or physiological phenotypes. Various ‘humanized’ mouse models have been explored in the past (Behringer, 2007; Eckardt et al., 2011; Shultz et al., 2007). We anticipate more powerful experimental systems will emerge in the next decade for study of gene function during human development in an in vivo environment.

Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology Zengrong Zhu and Danwei Huangfu Development 2013. 140, 705-717.

Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology
Zengrong Zhu and Danwei Huangfu
Development 2013. 140, 705-717.