Runx1 необходим в гемогенном эндотелии для формирования EMP и HSC, но как только EMPs и HSCs колонизируют печень плода они становятся независимы от Runx1 (Chen et al., 2009). Runx1 экспрессируется в мезодерме желточного мешка или гемогенном эндотелии в течение нескольких дней в период от ст. E7.5 иногда аж до E11.5, и нужен ли Runx1 для всего периода или для дискретного окна, неизвестно. Мы показали, что Runx1 постоянно необходим в гемогенном эндотелии (или в клетках, экспрессирующих VEC-CreERT) для образования EMP и HSC, т.к. делеция в VEC-CreERT в любой момент времени не дает по существу ни EMPs , ни HSCs при делеции двух аллелей Runx1. Тем не менее, время в течение которого делеция Runx1 наиболее существенно влияет на формирование EMP в противовес HSC было определенным и отражало, момент, когда большинство EMPs и HSCs дифференцируется из гемогенного эндотелия. Большинство EMPs дифференцируется из гемогенного эндотелия на ст. E10.5, а делеция Runx1 проявляющаяся вплоть до этого времени, но не после, негативно влияет на количество EMP. Напротив, делеция Runx1 между ст. E10.5 и E11.5 не оказывает влияния на количество EMP, теперь полностью элиминируются HSCs и pre-HSCs в AGM а также в пупочной и вителлиновой артериях. Раздельные временные потребности в Runx1 для образования EMP в противовес HSC согласуются с тем фактом, что EMPs и HSCs впервые обнаруживаются в разное время (Dzierzak and Speck, 2008). Эти данные в согласии с нашей предыдущей демонстрацией разных временных потребностей для CBFβ в формировании EMP в противоположность HSC (Chen et al., 2011). Tanaka et al. (Tanaka et al., 2012) ранее показали, что восстановление экспрессии Runx1 из эндогенного локуса Runx1 на ст. E6.5 и E7.5 д. восстанавливать образование EMP и жизнеспособность Runx1-дефицитных эмбрионов, тогда как восстановление экспрессии Runx1 на ст. E8.0 или позднее не приводит к восстановлению. Их эксперимент использовал CreERT, экспрессируемый с эндогенного Runx1 аллеля, чтобы постоянно восстанавливать экспрессию Runx1 с др., кондиционно активируемого аллеля Runx1. Tanaka et al. (Tanaka et al., 2012) исследование определило начало потребности в Runx1 для образования EMP на ст. E7.5, а мы установили конец потребности на ст. E10.5. Конец потребности, скорее всего, отображает завершение трехдневного процесса образования EMP из эндотелия. Tanaka et al. также определили начало потребности в Runx1 для формирования HSC на ст. E7.5 (Tanaka et al., 2012). Хотя они показали c помощью трансплантационных экспериментов, что HSCs восстанавливались, когда Runx1 реактивировался на ст. E7.5, они не прямо оценивали функцию HSC c помощью трансплантации после реактивации в более позднее время, а вместо этого использовали жизнеспособность плода и активность CFU-C в регионе AGM как суррогатов для восстановления HSC. Однако, HSCs могут формироваться в AGM регионе в отсутствие активности CFU-C или жизнеспособности плодов (Chen et al., 2011); т.о., они не являются реальными суррогатами для HSCs. Т.о., самое раннее время, в которое функция Runx1 может быть представлена для образования HSC остается неопределенной. Здесь мы установили, что Runx1 абсолютно необходим с E10.5 по E11.5 в AGM+U+V для pre-HSCs/HSCs, которые могут быть размножены или доведены до созревания в культурах эксплантов, но начиная со ст. E11.5, некоторые pre-HSCs/HSCs переходят к состоянию независимости от Runx1. Наши данные не исключают возможности, что некоторые Runx1-независимыен pre-HSCs/HSCs появляются до ст. E10.5 и тут же колонизируют печень плода, поскольку наши оценки pre-HSCs/HSCs были ограничены AGM+U+V. Переход к независимости от Runx1 не нуждается в микроусловиях печени плода, поскольку он происходит в культуре экспланта в AGM+U+V и, по-видимому, контролируется по времени.

Было предположено, что переход EMPs к независимости от Runx1 может быть обусловлен началом экспрессии Runx2 и/или Runx3, которые могли бы затем компенсировать потерю Runx1 (Hoogenkamp et al., 2009). Однако мы продемонстрировали, что делеция Cbfb c помощью Vav1-Cre, которая д. на активность трех белков Runx, оказалась дозволяющей функционирование EMP/CFU-C. Наиболее вероятно, что Runx1 устанавливает состояние хроматина в гемогенном эндотелии и EMPs, и с определенного момента оказывается более не нужным для поддержания этого состояния. Глобальный анализ соединения Runx1 в гемогенных клетках, происходящих из эндотелиальных клеток, происходящих из эмбриональных стволовых клеток (ESC), подтверждает мнение первых авторов этой гипотезы (Lichtinger et al., 2012). Используя эндотелий, происходящий из Runx1-дефицитных ESCs, содержащих индуцируемую doxycycline форму Runx1, Lichtinger et al. (Lichtinger et al., 2012) показали, что Runx1 действует как первый фактор, который д. связывать хроматин в местах, удаленных от промоторов с низкими или незначительными уровнями ацетилирования H3K9, являющихся метками активирования, и вызывает сильное ацетилирование. Транскрипционные факторы Tal1 и Fli1, которые экспрессируются в гемогенном эндотелии, связывают специфичные для гематопоэза гены в отсутствие Runx1, но индукция Runx1 ведет к быстрому перераспределению этих факторов в местах вблиз мест, оккупированных Runx1. Механизм, лежащий в основе перехода от нестабильного к стабильному эпигенетическому состоянию действительно ли не нуждается более в Runx1 является важным вопросом, и является, по-видимому, многоступенчатым процессом, использующим кооперацию с разными белками, регулирующими хроматин, или непосредственно или косвенно транскрипционные факторы мишени для Runx1.

Эмбрионы мыши на ст. E10.5 содержат примерно 800 Kit⁺ клеток в гематопоэтических кластерах в дорсальной аорте, но почти не имеют функциональных HSCs (Muller et al., 1994; Yokomizo and Dzierzak, 2010). Однако, на ст. E10.5 AGM регион содержит pre-HSCs, которые могут созревать в HSCs в течение 3-5 дней культивирования экспланта. Rybtsov et al. (Rybtsov et al., 2011) показали, что все pre-HSCs на ст. E10.5 в регионе AGM были популяцией VEC⁺ CD45^-, которая содержит эндотелиальные клетки и субнабор клеток в виде кластеров и ни один не был популяцией VEC⁺ CD45⁺ кластера. Мы показали, что делеция Runx1 c помощью VEC-CreERT между E10.5 и E11.5, после культивирования экспланта теряет все HSCs. Это указывает на то. что все pre-HSCs в регионе AGM+U+V между E10.5 и E11.5 всё ещё экспрессируют VEC-CreERT и требуют Runx1. Клетки, экспрессирующие VEC-CreERT, включая гемогенный эндотелий, могут также индуцировать некоторые или все клетки внутри кластеров, поскольку делеция VEC-CreERT д. потенциально возникать в клеткках кластера. Начиная со ст. E11.5, pre-HSCs, по-видимому, становятся независимыми от Runx1. Делеция на ст. E11.5 c помощью Actb-CreERT дает HSCs с двумя делетированными аллелями Runx1, но этого не происходит при делеции c помощью VEC-CreERT, что делает возможным появление Runx1-дефицитных HSCs. Следовательно, Runx1 всегда необходим в клетках, экспрессирующих VEC-CreERT для формирования pre-HSC/HSC, независимо от периода развития.

Наконец, наше наблюдение, что CBFβ -дефицитные LT-HSCs клетки тяжело нарушены, проливает свет на интересное наблюдение при лейкемии. Хотя биаллельные мутации потери функции в RUNX1 обнаружены многими исследователями при острой миелогенной лейкемии, биаллельные мутации в CBFB не описаны (Mangan and Speck, 2011). Возможно, что потеря всей активности стержневого фактора связывания несовместима с поддержанием лейкемических или пре-лейкемических стволовых клеток и их легко превосходят нормальные HSCs. Следовательно, лекарства, которые воздействуют на CBFβ и вмешиваются в способность взаимодействовать с Runx белками, могут в принципе использоваться в клинике, если будет идентифицирован временной промежуток активности лейкемических и пре-лейкемических стволовых клеток.