Нервная система позвоночных состоит из сложного набора нейрональных петель (circuits), необходимых для восприятия, процессинга и контроля реакций на внешние и внутренние сигналы. Многие из этих рефлекторных петель (circuits) устанавливаются во время эмбрионального развития, когда траектории аксонов являются первоначально искусно разработанными и функциональными соединениями между нейронами и соотв. их мишенями. Точное соответствие между нейронами и мишенями д. приобретаться во время сборки circuit, что предполагает скоординированное развитие. Недавние исследования действий Hox генов у позвоночных продемонстрировали жизненно важную роль в спецификации субпопуляций нейронов и соотв. им мишеней.

Hox белки участвуют в спецификации сегментного паттерна тела и играют критическую роль в спецификации позиционной информации вдоль эмбриональных осей во время развития позвоночных (Krumlauf, 1994; Lumsden and Krumlauf, 1996; Tumpel et al., 2009). У млекопитающих имеется 39 Hox генов, которые расположены в виде 4-х самостоятельных кластеров (A-D). Каждый кластер содержит до 13 гомологичных генов (напр.,Hoxa1…Hoxa13) и расположены они на разных хромосомах. Гены, которые занимают одну и ту же позицию внутри кластера на разных хромосомах наз. "paralog genes" (напр., Hoxa1, Hoxb1, Hoxc1 и Hoxd1). Hox расположены непрерывно внутри каждого кластера, при этом их 3' до 5' позиции параллельны с их временной и пространственной экспрессией в эмбриональных тканях, при этом 3' факторы экспрессируются спереди, а 5' факторы экспрессируются сзади. Это свойство наз. колинеарностью и является результатом генерации перекрывающихся паттернов экспрессии Hox генов, составляя гнездовой комбинационный код для спецификации уникальных региональных качественных особенностей.

Различные Hox белки регулируют многочисленные гены мишени, но поскольку они обладают общей существенной гомологией последовательностей, то они вносят вклад в ограниченную ДНК-связывающую специфичность сами с собой. Т.о., изысканная ДНК-связывающая избирательность, которая связывает разные Hox белки со спецификацией разных структур тела, чаще всего зависит от взаимодействий с др. ДНК-связывающими белками, которые действуют как кофакторы Hox. Сюда входят PBX и MEIS классы TALE (Three Amino acid Loop Extension) гомеодомен-содержащих транскрипционных факторов, которые повышают специфичность связывания ДНК Hox белками посредством зависимой от типа клеток или тканей гетеродимеризации (Mann, 1995). Генетический анализ мышей и Drosophila melanogaster предоставил строгое in vivo подтверждение, что TALE и Hox белки действуют совместно во время развития, но не все TALE функции зависят от Hox, подтверждая, что TALE белки могут функционировать более широко, чтобы модулировать транскрипцию (Moens and Selleri, 2006). Мало известно о том, действуют ли TALE как кофакторы Hox в ходе всего развития или в частности только во время процесса формирования нейральных связей (circuit).

HOX TRANSCRIPTIONAL NETWORKS IN HINDBRAIN SEGMENTATION AND CIRCUIT FORMATION

Strength of Rhombomere-Specific Fate Maps

Задний мозг млекопитающих или ромбэнцефалон состоит из мозжечка, моста и продолговатого мозга (medulla oblongata). Во время ранних эмбриональных стадий ростральная часть заднего мозга организуется вдоль передне-задней (AP) оси в сегментированные единицы, наз. rhombomeres (r) (Vaage, 1969; Fraser et al., 1990; Kiecker and Lumsden, 2005). Каждый ромбомер ведет себя как компартмент, ограниченный клеточным клоном, так что как только появляются границы ромбомеров, нейроэпителиальные клетки более не перемещаются между ромбомерами (Lumsden and Keynes, 1989; Fraser et al., 1990). Puelles с сотр. Полагают, что даже хвостовая несегментированная часть заднего мозга может содержать скрытую метамерную организацию с посегментным паттерном нейронов, которая представлена пятью псевдо-ромбомерами (r7-r11) (Cambronero and Puelles, 2000; Marin et al., 2008). Однако нет доказательств, что псевдо-ромбомеры представляют тот же самый тип механизмов клонального ограничения, который описан для ромбомеров. Организация ромбомеров очень консервативна у позвоночных и ассоциирована с доменами экспрессии Hox генов, это, по-видимому, является критическим для становления определенных сетей circuits в зрелом заднем мозге.

Внутри каждого ромбомера индуктивные сигналы и специфические пути транскрипции обеспечивают позиционный паттерн нейральных предшественников, обнаруживающих связь своей позиции вдоль AP и дорсо-вентральной (DV) осей со спецификацией миграторного поведения специфических субтипов нейронов и проекциями нейронов к соотв. мишеням (Jessell, 2000; Sander et al., 2000; Pattyn et al., 2003; Landsberg et al., 2005; Machold and Fishell, 2005; Wang et al., 2005; Jacob et al., 2007; Lebel et al., 2007; Kim et al., 2008; Fujiyama et al., 2009; Rose et al., 2009b; Storm et al., 2009).

Долговременные исследования по картированию судеб ромбомеров эмбрионов кур (Tan and Le Douarin, 1991; Marin and Puelles, 1995; Diaz et al., 1998; Cambronero and Puelles, 2000; Cramer et al., 2000; Marin et al., 2008) и мвшей (Farago et al.,2006; Oury et al., 2006; Pasqualetti et al., 2007; Di Bonito et al., 2013; Di Meglio et al., 2013) было установлено, что ромбомеры вносят вклад в некоторое количество сенсорных и двигательных нейронов, а также в ассоциативные популяции нейронов слуховой, вестибулярной, тройничной, соматосенсорной и ретикулярной систем. Одиночные ромбомеры могут вносить вклад во множественные ядра и группы нейронов, принадлежащих разным сенсорно-двигательным системам, а множественные ромбомеры могут вносить вклад в разные подразделения одного и того же ядра нейронов. Взаимоотношения между ромбомерами и субпопуляциями нейральных клеток поэтому сложны.

Hox гены необходимы для предопределения AP качественных особенностей во время сегментации заднего мозга и также вносят вклад в регуляцию спецификации субтипов нейронов вдоль DV оси. В ростральной части заднего мозга Hox гены из групп паралогов (PG) 1-4 обнаруживают перекрывающиеся и гнездовые паттерны экспрессии, кроме r1, который лишен экспрессии Hox (rev. Tumpel et al., 2009). Хотя инициальные ст. экспрессии могут быть динамичными в пространстве и во времени, но ко времени завершения сегментации каждый ромбомер экспрессирует специфическую комбинацию Hox генов (Krumlauf et al., 1993; Krumlauf, 1994; Lumsden and Krumlauf,1996; Tumpel et al., 2009). Во время поддержания их передних границ экспрессии, последующая динамическая фаза постепенно ограничивает экспрессию Hox генов вдоль DV оси специфическими субпопуляциями предшественников и рано дифференцирующихся нейронов с разными нейрональными судьбами (Davenne et al., 1999; Gaufo et al., 2000; Gaufo et al., 2003; Pattyn et al., 2003; Samad et al., 2004; Jacob et al., 2007). Паттерны сегментной экспрессии Hox часто поддерживаются и в течение более поздних стадий в специфичных для ромбомеров субнаборах постмитотических нейронов, которые д. вносить вклад в разные сенсорно-двигательные ядра ствола мозга. Более того, недавние исследования подтвердили, что Hox гены регулируют стереотипичную миграцию нейронов и паттерны нахождения аксонами соотв. путей, а также картирование топографических связей (topographic connectivity) (Oury et al., 2006; Geisen et al., 2008; Narita and Rijli, 2009; Di Bonito et al., 2013; Di Meglio et al., 2013). Как следствие, одиночные ромбомеры с их специфическими комбинациями Hox генов генерируют отличающиеся функциональные компоненты сенсорно-двигательных систем. Это в конечном итоге приводит к становлению сложной сети circuits, которые обеспечивают многие жизненно важные функции, осуществляемые задним мозгом.

Initial Expression Patterns of Specific Hox Genes in Hindbrain Rhombomeres

Гены Hox paralog group 1 (PG1) , такие как Hoxa1 и Hoxb1, экспрессируются вплоть до границы r3/r4 в клетках предшественниках во время раннего развития заднего мозга. Когда ромбомеры оказываются полностью сформированными, экспрессия Hoxa1 подавляется (Murphy and Hill, 1991), тогда как Hoxb1 избирательно поддерживается в r4 с помощью ауторегуляционной петли (Popperl et al., 1995; Studer et al., 1998) и с помощью Hoxb2 (Barrow and Capecchi, 1996; Gavalas et al., 2003; Pattyn et al., 2003; Di Bonito et al., 2013).

Гены Hox PG2, такие как Hoxa2 и Hoxb2, экспрессируются вплоть до r1/r2 и r2/r3 границ, соотв. (Wilkinson et al., 1989; Hunt et al., 1991; Krumlauf et al., 1993; Prince and Lumsden, 1994; Davenne et al., 1999). Hoxb2 ко-экспрессируется с Hoxa2 в r3 на низких уровнях и с Hoxb1 в r4 на высоких уровнях, тогда как Hoxa2 обнаруживают сильную экспрессию в r3 и является единственным Hox геном, экспрессирующимся в r2 (Gavalas et al., 2003; Narita and Rijli, 2009; Di Bonito et al., 2013). Гены Hox PG3, такие как Hoxa3 и Hoxb3, экспрессируются вплоть до границы r4-r5, тогда как гены Hox PG4 экспрессируются до границы r6-r7 , а гены Hox PG5 до границы r7-r8 (Tumpel et al., 2009) (Fig. 1).

Большинство Hox генов экспрессируется в заднем мозге и т.о., имеет домены ранней экспрессии, которые простираются от специфической передней границы через более задние ромбомеры и в спинной мозг (Hoxb1 является исключением, т.к. ограничен единственным ромбомерным доменом). Возникающее в результате совокупное перекрывание Hox генов экспрессируется, перемещаясь спереди кзади (Fig. 1) , вызывая вопрос, неужели все Hox гены, экспрессирующиеся в данном домене оказывают одинаковое влияние. Ранние работы как на Drosophila , так и мышах показали, что этого обычно не происходит: более 5' Hox гены доминируют над более 3' Hox генами, что является важным элементом для гарантии колинеарности и известно как принцип posterior prevalence (заднего превалирования) (Duboule, 1991).

Hox Genes and Specific Hindbrain Sensorimotor Systems

Hox genes and the auditory system

Слуховой центральный путь формируется сенсорными проекциями, которые передают восходящую акустическую информацию, и центробежными проекциями, которые модулируют первичные центростремительны реакции. Внутренние и наружные волосковые клетки органа Корти в улитке реагируют на звуковые стимулы, но в то время как inner hair cells (IHCs) являются настоящими сенсорными детекторами слуховых стимулов, outer hair cells (OHCs) обеспечивают центробежный (efferent) контроль и умножают звуки низкой интенсивности за счет увеличения избирательности амплитуды и частоты вибраций базилярной мембраны посредством процесса "cochlear amplification" (Fettiplace and Hackney, 2006; Dallos,2008).

Слуховая сенсорная информация передается с помощью синапсов от IHCs к первичным слуховым афферентным волокнам, которые передают информацию через VIIIth черепно-мозговой нерв в cochlear nuclear complex (CN) заднего мозга. Информация перерабатывается и передается последовательно через CN, латеральный lemniscus complex (LL), inferior colliculus (IC) в среднем мозге, medial geniculate nucleus (MG) талямуса в слуховой кортекс. Раздельный параллельный путь обеспечивает временную и пространственную локализацию звука путем передачи информации от CN через superior olivary complex (SOC) в структуры высшего уровня головного мозга (Willott, 2001).

Собственно функция слуха зависит от центробежного контроля IHCs с помощью lateral olivocochlear (LOC) motoneurons (MNs), расположенных вблизи и внутри lateral superior olive (LSO). LOC MNs иннервируют синаптические окончания центростремительных сенсорных нейронов на IHCs, модулируют возбудимость слухового нерва и защищают улитку от акустических повреждений (Simmons, 2002; Darrow et al., 2007).

Центробежный контроль OHCs обеспечивается с помощью medial olivocochlear (MOC) MNs, расположенных вблизи medial superior olive (MSO). MOC MNs иннервируются с помощью нейронов posteroventral cochlear nucleus (PVCN) (Brown et al., 2003; de Venecia et al., 2005) и модулируют "cochlear amplification" посредством рефлекса MOC путем ингибирования вибраций OHCs (Guinan, 2006). Собственно взаимодействие между центробежными MNs улитки и их постсинаптическими мишенями во время ранней постнатальной жизни, как известно, необходимо для нормального развития кохлеарной функции (Walsh et al., 1998; Simmons, 2002; Di Bonito et al., 2013).

Др. механизм обратной связи обеспечивается с помощью middle ear muscle reflex (MEM), который формируется лицевыми и тройничными branchiomotor нейронами (FBMNs, TBMNs), которые иннервируют мышцы stapedius и tensor tympani, соотв. Активация этих мышц натягивает цепочку косточек барабанной перепонки и снижает амплитуду передачи звука через среднее ухо (Liberman and Guinan, 1998; Lee et al., 2006). Т.о., MOC и MEM рефлексы представляют собой параллельные возбуждаемые звуками механизмы обратной связи, действующие на внутреннее и среднее ухо, соотв., чтобы защитить улитку, когда исходящие акустические сигналы слишком интенсивны (Kujawa and Liberman, 1997; Maison et al., 2002; Lee et al., 2006).

Разные сообщения показывают, что разные ромбомеры вносят вклад в разные компоненты слуховой системы. Основным игроком в этой системе является r4 (Di Bonito et al., 2013). В то время как вентральная часть r4 вносит вклад в центробежные FBMNs (Auclair et al., 1996; Studer et al., 1996; Di Bonito et al., 2013) and OC MNs (Bruce et al., 1997; Simmons, 2002), дорсальная часть r4 дает специфические происходящие из alar пластинки сенсорные компоненты слуховой системы. В частности, клетки, мигрирующие кпереди от r4, образуют вентральное ядро LL (VLL), важную передаточную станцию в основном пути восприятия звуков, тогда как дорсальные сенсорные клетки остаются внутри r4 и вносят основной вклад в задне-вентральные (PVCN) и дорсальные (DCN) порции CN комплекса, но не в гранулярные клетки улитки из микронейрональной оболочки (Di Bonito et al., 2013). Т.о., происходящие из r4 кохлеарные сенсорные нейроны вносят вклад вместе с базальными происходящими из пластинки двигательными структурами в два отличающиеся слуховые сенсорно-двигательные sub-circuits обратной связи, описанные выше. PVCN нейроны вместе с центробежными MOC MNs формируют MOC рефлекс и вместе с FBMNs составляют MEM рефлекс (Di Bonito et al., 2013). Касательно ромбомерного происхождения др. компонентов слуховой системы, ядра lateral lemniscus у мышей представлены тремя компонентами: вентральным. промежуточным и дорсальным. Промежуточные нейроны происходят из r1, тогда как дорсальный LL (DLL) , как полагают, происходит из перешейка (Moreno-Bravo et al., 2013). R2 вносит вклад в AVCN и ассоциированную оболочку, тогда как r3 и r5 (оценивались одновременно с помощью репортеров, которые были нацелены на эту специфическую пару ромбомеров) вносят вклад в AVCN, PVCN (скромно), DCN, и оболочку (Farago et al., 2006). R5 вносит вклад столь же массивный в SOC (Maricich et al.,2009), тогда как r4 вносит вклад только частично в LSO, который поэтому лишь частично повреждается у Hoxb1мутантов (Maricich et al., 2009; Di Bonito et al., 2013). Т.о., разные ромбомеры вносят вклад в разные ядра и/или субъядра слуховой системы с разными функциями.

Касательно экспрессии в специфических популяциях нейронов Hox генов, экспрессия Hoxb2 и Hoxa2 поддерживается в CN, VLL и SOC ядрах во время пренатальных и постнатальных ст. развития (Narita and Rijli, 2009; Di Bonito et al.,2013). В кохлеарном ядерном комплексе экспрессия Hoxa2 поддерживается в r2/r3-происходящих AVCN, тогда как Hoxb2 высоко экспрессируется в структурах, происходящих из r4, таких как PVCN, и в происходящих из r3 AVCN и в популяциях гранулярных кохлеарных клеток. Оба гена экспрессируются в происходящих из r3/r4/r5 DCN (Farago et al., 2006; Narita and Rijli, 2009; Di Bonito et al., 2013).

Некоторые исследования описывают перекрестную регуляцию между Hoxb1, Hoxb2 и Hoxa2 на ранних ст. становления качественных особенностей ромбомеров (Maconochie et al., 1997; Studer et al., 1998; Gavalas et al., 2003; Pattyn et al., 2003; Tumpel et al., 2007), но лишь недавно эта перекрестная регуляция была доказана как критическая для корректного развития постмитотических групп нейронов, происходящих из разных ромбомеров, особенно в разных ядрах слуховой системы (Di Bonito et al., 2013). Все эти исследования демонстрируют, что Hoxb1 играет ключевую роль в становлении региональных характеристик вентральной и дорсальной частей r4 с помощью дифференциально регулируемой экспрессии Hoxb2/Hoxa2 (Maconochie et al., 1997; Tumpel et al., 2007; Di Bonito et al., 2013).

У мутантов Hoxb1, у которых Hoxb1 или постоянно (Hoxb1^null) или в зависимости от условий (Hoxb1^lateCKO) элиминирован в r4 на ст. E9.0, и у Hoxb2^ΔKO мышей, у которых экспрессия Hoxb1 неспособна поддерживаться в r4, экспрессия Hoxb2 снижена и экспрессия Hoxa2 повышена до уровней, сходных с таковыми в r3. Возникающее в результате преобразование паттерна r4 в характерный для r3, как результат инактивации Hoxb1, в конечном итоге ведет к потере происходящих из r4 слуховых ядер (FBMNs, MOC, LOC, VLL и PVCN) и к эктопическому образованию популяций нейронов, которые обычно происходят из r3 (TBMNs, AVCN и кохлеарных гранулярных клеток) (Studer et al., 1996; Di Bonito et al., 2013 and unpublished results). Hoxb2^ΔKO и Hoxb1^lateCKO мутантные эмбрионы имеют сходный, хотя и менее выраженный фенотип. Показано, что ранняя экспрессия Hoxb1 способна частично специфицировать качественные особенности r4 у этих мутантов, но неспособна поддерживать высокие уровни экспрессии на поздних стадиях, ингибируя дальнейшее развитие происходящих из r4 слуховых ядер (Di Bonito et al., 2013). Это действует в основном на ядра, которые развиваются в то время, когда Hoxb1 инактивирован в r4 (FBMNs, OC and VLL), тогда как ядра, которые развиваются после инактивации Hoxb1, такие как CN, обнаруживают сходный фенотип у всех трех мутантов.

У Hoxb1 и Hoxb2 мутантных мышей передача низко-уровневых слуховых стимулов теряется, вызывая в результате тяжелые нарушения слуха (Di Bonito et al., 2013). Дегенерация OHCs и, следовательно, аномальная кохлеарная амплификация, могут вызываться за счет отсутствия синаптической и трофической стимуляции OHCs с помощью центробежных MOC волокон во время постнатального критического периода, которая является критической для аккуратного созревания OHCs (Walsh et al., 1998). Несмотря на это, эти мутанты также обнаруживают альтерации в CN и VLL, которые д. вносить вклад в наблюдаемую потерю слуха.

Прогрессивно более тяжелые нарушения слуха возникают с возрастом у мутантов Hoxb1, которые вместо того, чтобы быть связанными с изменением функции в двух центробежных (MOC и MEM) рефлексах, а также отсутствием LOC MNs, не могут защитить орган Корти от повреждений слуха, вызываемых шумами. В соответствии с этим Hoxb1^lateCKO кондиционные мыши сохраняют некоторые эфферентные нейроны (MOC, LOC и FBMNs) и характеризуются менее тяжелым слуховым фенотипом по сравнению с Hoxb1^null мышами (Di Bonito et al., 2013 and unpublished data). Интересно, что миссенс мутации, недавно описаны в локусе HOXB1 человека в двух разных Германски-Американских семьях (Webb et al., 2012). Пациенты, несущие мутацию на обоих аллелях, обнаруживают врожденную слабость лица и варьирующую нейросенсорную потерю слуха. Как было предположено авт., подобно Hoxb1 мутантным мышам, пациенты, несущие мутацию HOXB1 могут не обладать собственно взаимодействием между OC нейронами и OHCs, и это приводит к высокому риску повреждений волосковых клеток, возникающих в результате звуков высокой интенсивности, по сравнению с их нормальными братьями-сестрами. Пациенты, по-видимому, не обладают измененной реакцией стремянного мышечного рефлекса, даже если лицевые мышцы парализованы (Webb et al., 2012), подтверждая, что MEM рефлекс не изменен и что аномальное развитие OC нейронов может быть единственной причиной потери слуха.

Помимо стимуляции экспрессии Hoxb2, Hoxb1 негативно регулирует экспрессию Hoxa2 в r4 (Tumpel et al., 2007; Di Bonito et al., 2013). Hoxa2 обычно экспрессируется на низких уровнях в r4 и играет лишь минорную роль в формировании паттерна происходящих из r4 слуховых сенсорных ядер (Di Bonito et al., 2013). Напротив, Hoxa2 строго экспрессируется в r3 и наиболее низком уровне в r2, и в основном необходим в развитии происходящего из r2/r3 AVCN (Gavalas et al., 1997). Конституитивная активация Hoxa2 влияет на развитие AVCN (Gavalas et al., 1997), тогда как вызванная условиями инактивация Hoxa2 в производных ромбической губы влияет на пересечение проекций AVCN. Это обусловлено подавлением Slit рецептора Rig1/Robo3, как известно, контролирующих пересечение срединной линии комиссуральными аксонами в заднем мозге (Renier et al., 2010), в результате происходит снижение иннервации контралатеральных и эктопически направляемых ипсилатеральных MNTB (Di Bonito et al., 2013).

Специфическая роль Hoxb2 в дифференцировке гранулярных клеток и роль Hoxa2 и Hoxb2 в SOC и VLL ещё предстоит идентифицировать. Вызываемая условиями инактивация Hoxb2 после ст. (E) 13.5, когда экспрессия Hoxb1 выключается, д. продемонстрировать позднюю специфическую роль Hoxb2 в постмитотических производных r4. Вместо этого разумно предположить, что Hoxa2 может быть важен для ведения VLL тракта аксонов, как это показано для AVCN (Di Bonito et al., 2013) и для principal trigeminal nucleus (PrV) (Oury et al., 2006) (see below).

Итак, ростральные ромбомеры и ассоциированные с ними Hox гены участвуют в становлении и поддержании двух основных функциональных circuits в центральной слуховой системе. Hoxb1 и Hoxb2, по-видимому, регулируют прежде всего сборку, происходящих из r4 популяций, нейронов, участвующих в основном пути трансмиссии воспринимаемых звуков в сенсорно-двигательных рефлекторных петлях (circuits), критических для кохлеарной амплификации и защиты. Напротив, Hoxa2 регулирует развитие и связи AVCN, и может , следовательно, вносить вклад в сборку производных из r2-, r3- и r5 рефлекторных дуг (circuitry) локализации звука; модель нуждается в экспериментальной проверке (Fig. 2).

Hox genes and the trigeminal system

Система тройничного нерва важна для передачи соматосенсорных стимулов, включая прикосновения, боль и температуру с поверхности тела в кору. Лицевые соматосенсорные импульсы, передаются через связи тройничного нерва, топографически и периодически, в ствол головного мозга, таламус и неокортекс. Нейроны первого порядка, чьи клеточные тела располагаются в тройничном ганглии, передают сомато-сенсорные импульсы из определенных регионов лица через мандибулярную (поддерживающую нижние челюсть и губу), максиллярную (поддерживающую усы, верхние челюсть и губу) и глазную (поддерживающую роговицу, веки, брови, лоб и нос) веточки тройничного нерва (Erzurumlu and Killackey,1983). Центральные афферентные аксоны нейронов тройничного ганглия вступают в задний мозг и дают восходящие и нисходящие веточки, которые иннервируют соотв. rostral principal (PrV) и caudal spinal (SpV) ядра (rev. Erzurumlu et al., 2010). Спинальные ядра формируют три отличающихся ростро-каудальных субъядра: SpV pars oralis, SpV pars interpolaris и SpV pars caudalis. Каждое субъядро обладает характерными цитоархитектурой, связями и функцией. Сенсорные импульсы передаются в свою очередь в соматосенсорную кору посредством ventral posterior medial (VPM) и posterior medial (POm) таламических ядер. На всех уровнях тройничного пути пространственное расположение нейронов и их проекций somatotopically воспроизводит физическое распределение лицевых рецепторов.

Вдоль AP оси, ассоциированные с разными частями principal (PrV) и spinal (SpV) pars interpolaris субъядер, описаны 4 самостоятельных пути, передающие сигналы от лица в соматосенсорный кортекс. Три из них (lemniscal, dorsal и extralemniscal) обеспечиваются сменой нейронов в определенных подчиненных регионах VPM таламических ядер, тогда как др. (paralemniscal) обеспечивается сменой нейронов в POm таламическом ядре. Т.о., разные субъядра тройничной системы вносят вклад в формирование разных путей с отличающимися функциями и топографическими связями с таламусом (rev. Pouchelon et al., 2012) (Fig. 3).

Неудивительно, что соматотопическая представленность лица в заднем мозге коррелирует с ромбомерным происхождением субнаборов нейронов PrV вдоль AP оси. Долговременное картирование генетических судеб и в самом деле выявило, что мышиный PrV состоит в основном из нейронов, происходящих из r2- и r3, которые сегрегируют в разные регионы зрелого ядра (Oury et al., 2006). Дорсальная часть PrV содержит происходящие из r2 нейроны, которые воспринимают импульсы от нижней челюсти и губы посредством мандибулярной веточки тройничного нерва и что проецируются они первоначально в ветромедиальное VPM. Вентральная часть PrV содержит происходящие из r3 нейроны, организованные в нейрональные модули или barrelettes, воспроизводящие набор усов (whiskers) и синусных волос на морде и получающие импульсы от подушечек (pad) усов через максиллярную веточку. Происходящие из r3 PrV нейроны проецируются в barreloids и с синусными волосками связанные нейрональные модули в дорсо-латеральном VPM таламуса. В целом, специфичное ромбомерное происхождение подтипов PrV нейронов создает пространственное расхождение нейронов, которые вносят вклад в упорядоченные связи входящих лицевых центростремительных и trigemino-thalamic проекций в lemniscal путь (Oury et al., 2006). Эта колинеарность ромбомерного разделения и путей спецификации распространяется и за пределы PrV, поскольку мы установили, что SpV pars oralis, которая является каудальной по отношению происходящих из r2/3 PrV, формируется нейронами. происходящими из r4 (Fig. 3 and unpublished data).

Два пути, ассоциированные с r2- и r3-происводными дорсальным и вентральным PrV регионами, коррелируют с уровнями дифференциальной экспрессии Hoxa2. Экспрессия Hoxa2 высокая в регионе, происходящем из r3, и значительно более низкая в регионе, происходящем из r2 (Oury et al., 2006). Генетические манипуляции демонстрируют, что Hoxa2 играет множественные пространственно-временные роли в сборке circuit тройничного нерва. Ранняя экспрессия Hoxa2 в r2 необходима для нормального ареста центростремительных волокон тройничного нерва на границе r1/r2, чтобы предупредить их от вступления в r1. У Hoxa2^null и Hoxa2 кондиционных мутантов с избирательной инактивацией в r2, восходящие афферентные тройничные волокна проецируются эктопически в мозжечок, вместо того. чтобы остановиться в PrV ядре. В r3, Hoxa2 необходим для избирательного ветвления максиллярных афферентных волокон и для нормального топографического паттерна ветвления PrV аксонов внутри VPM. Избирательная инактивация Hoxa2 в r3 вызывает значительное снижение окончаний максиллярных афферентных волокон в происходящем из r3 вентральном PrV, приводя к отсутствию формирования паттерна barrelette, при этом наблюдается эктопическая переориентация некоторых мандибулярных афферентных волокон в направлении территории, которая обычно является целью максиллярных афферентных волокон. Аксоны из вентрального PrV нацеливаются неправильно и большинство из неспособно проецироваться в область barreloid, а вместо этого эктопически проникают в вентромедиальный VPM. Т.о., Hoxa2 регулирует топографию прокладки путей с периферии к PrV и от PrV к таламусу (Fig. 4A). Поскольку Hoxa2 позитивно регулирует экспрессию EphA4 и EphA7 в PrV ядре, то Hoxa2 может контролировать PrV топографические связи частично посредством передачи сигналов Eph рецептора и лиганда ephrin (Oury et al., 2006). Figure 4.

Эти результаты демонстрируют, что прирожденная соматотопическая организация PrV и trigeminothalamic lemniscal пути устанавливается рано в развитии и может быть сцеплена с ранними ромбомерным и поздними субпопуляциями нейронов специфическими паттернами экспрессии Hox генов ву заднем мозге (also summarized in Fig. 1).

Hox genes and the precerebellar system

Предмозжечковые ядра передают периферические ощущения и кортикальные импульсы в мозжечок и происходят из ромбической губы каудальной части заднего мозга (precerebellar губа), которые распространяются от r6 до r8 (Marin and Puelles, 1995; Rodriguez and Dymecki, 2000; Wingate, 2001; Landsberg et al., 2005; Machold and Fishell, 2005; Wang et al., 2005; Farago et al., 2006), и в более каудальные псевдоромбомеры (Cambronero and Puelles, 2000; Hidalgo-Sanchez et al., 2012). Происходящие из ромбической губы нейроны мигрируют тангенциально, чтобы сформировать две основные предмозжечковые афферентные системы: восходящие волокна и систему мшистых (mossy) волокон. Нейроны восходящих волокон мигрируют посредством внутристеночных потоков миграции внутри паренхимы заднего мозга, чтобы сформировать inferior olivary nucleus (ION) (Altman and Bayer, 1987b; Bourrat and Sotelo, 1988; Wassef et al., 1992). Нейроны мшистых волокон вместо этого мигрируют посредством миграторных потоков вне стенок, непосредственно под поверхностью мягкой мозговой оболочки паренхимы заднего мозга, чтобы сформировать lateral reticular (LRN) и external cuneate (ECN) ядра в задней части заднего мозга, и pontine gray (PGN) и reticulotegmental (RTN) ядра, коллективно обозначаемые как pontine nuclei (PN), в передней части заднего мозга (Altman and Bayer, 1987a). Проекции мшистых волокон нейронов мигрируют вдоль двух разных расположенных под мягкой оболочкой потоков: posterior extramural stream (pes), который пересекает срединную линию, чтобы сформировать контралатеральные LRN и ECN (Altman and Bayer, 1987c; Bourrat and Sotelo, 1990) и anterior extramural stream (aes), который пересекает несколько ромбомеров прежде чем закрепиться ипсилатерально, чтобы сформировать PGN и RTN вблизи срединной линии (Altman and Bayer, 1987d; Marin and Puelles, 1995).

Специфичные для ромбомеров Cre-recombinase линии были использованы, чтобы картировать вклады нижней части ромбической губы разных ромбомеров в разные предмозжечковые миграторные потоки и ядра. Это показало, что ромбическая губа от r6 до r8 топографически маркируется дорсовентрально внутри aes и, в свою очередь, рострокаудально внутри PN, при этом субнаборы нейронов поддерживают свои относительные позиции посредством миграции и поселений. Короче, из r6 ромбической губы происходящее потомство (RLp) картируется в наиболее дорсальной части aes и в наиболее передней порции PN, r7-8RLp вносит вклад в остальную часть aes и PN, а r8RLp сегрегирует наиболее вентрально в aes и наиболее заднюю порцию PN. Это указывает на то, что r7RLp вносит вклад специфически в части aes и PN в промежутке между частями, происходящими из r6 и r8, но может также вносить вклад в последний. Т.о., топографическая организация pontine мигрирующих нейронов отражает ростро-каудальное происхождение предшественников и сохраняется в PN (Di Meglio et al., 2013).

В терминах Hox генов, PG2 (Hoxa2/Hoxb2) и PG3 (Hoxa3/Hoxb3) гены экспрессируются по всей предмозжечковой ромбической губе, тогда как PG4 (Hoxa4/Hoxb4) гены экспрессируются до r6-r7 , а PG5 (Hoxa5/Hoxb5) гены вплоть до границы r7-r8. В aes и PN, Hoxb4+ нейроны распространяются вентрально и кзади до происходящих из r6 нейронов, тогда как Hoxa5+ и Hox5b+ нейроны сегрегируют до наиболее вентральных частей aes и наиболее задних PN. Т.о.,, HoxPG2 по PG5 гены сохраняют свои исходные, связанные с ромбомерами, паттерны экспрессии внутри миграторных потоков и PN (Di Meglio et al., 2013).Итак, субнаборы PN клеток из разных ростро-каудальных источников сохраняют свои относительные топографические позиции и свои отличающиеся Hox коды во время миграции и формирования колоний в зрелом ядре, где они воспринимают разные кортикальные стимулы.

Hox genes and the vestibular system

Вестибулярная система определяет движения и притяжение и инициирует движения для поддержания баланса и ориентации. Это обеспечивается сенсорными внутренними органами внутри лабиринта внутреннего уха, сенсорные центростремительные волокна, которые передают сенсорную информацию от сенсорных внутренних органов в задний мозг, где проекции вестибулярных нейронов располагаются внутри вестибулярных ядер и ассоциированных групп нейронов. Эти проекции вестибулярных нейронов преобразуют и передают информацию к разным мишеням в головном и спинном мозге. Вестибулярные рефлексы, обеспечиваемые с помощью этих проекций высоко стереотипичны, но вестибулярная система взаимодействует экстенсивно со зрительной и проприоцептивной системами, и её активность зависит от влияния со стороны мозжечка и коры, чтобы обеспечивать высокую степень приспособляемости (Glover, 2007).

Мишени проекций вестибулярных нейронов включают: (1) двигательные нейроны и промежуточные нейроны в спинном мозге, ассоциированные с vestibulospinal и vestibulocollic рефлексами; (2) двигательные нейроны и промежуточные нейроны в заднем мозге и среднем мозге, ассоциированные с vestibulo-ocular рефлексами; (3) нейроны ретикулярной формации, ассоциированные с контролем положения тела и vestibulosympathetic рефлексами; (4) кортикальные слои мозжечковых flocculus, nodulus и uvula, ассоцированных с регуляцией и пластичностью вестибулярных рефлексов; (5) таламус, с помощью которого осуществляется осознанное восприятие вестибулярных сигналов, обеспечиваемое корой головного мозга; (6) гиппокамп, с динамически модернизируемыми пространственными, связанными с движениями картами активности нейронов; и (7) одноименные контралатеральные вестибулярные ядра, преимущественно связанные с общей двухтактной (push-pull) организацией путей вестибулярных рефлексов (Angelaki and Cullen, 2008).

Исследования по ретроградному отслеживанию аксонов у эмбрионов кур (Fig. 5A) и мышей (Fig. 5B) описали hodological мозаику, в которой вестибуло-спинальные, вестибуло-глазничные и вестимуло-мозжечковые проекции происходят из сегрегированных, когерентных групп проекций вестибулярных нейронов, расположенных внутри специфических AP и DV доменов (Glover and Petursdottir, 1991; Glover, 1994, 1996, 2000; Auclair et al., 1999; Diaz and Glover, 2002; Diaz et al., 2003). Проекции вестибулярных нейронов были первыми популяциями проекционных нейронов в задний мозг, демонстрирующие присутствие границ AP доменов, которые выстраиваются в ряд с границами ромбомеров у амниот (Glover, 1989), а картирование судеб у эмбрионов кур и мышей подтвердило онтогенетическое происхождение из специфических ромбомерных территорий (одиночных или множественных) для многих из групп (Diaz et al., 1998; Pasqualetti et al., 2007). Эти свойства подтверждают тесную связь между фенотипом вестибулярных проекционных нейронов и экспрессией Hox генов (Glover, 2001). В самом деле, одним из поразительных свойств вестибулярной hodological мозаики является то, что группы проекционных нейронов родственны на DV территориях, но разные ромбомеры обнаруживают сильно отличающиеся проекции аксонов и паттерны окончаний (Glover,2003). Напр., glutamatergic lateral vestibulospinal tract (LVST) группа, которая является основополагающей вестибуло-спинальной группой (Kasumacic et al., 2010, 2012) и происходит преимущественно из r4, проецируется каудально в латеральные территории внутри заднего мозга, тогда как вестибуло-глазные группы, располагающиеся в сходных DV позициях, но в более ростральных и более каудальных ромбомерах, проецируются рострально вдоль траекторий внутри медиальных продольных пучков (Fig. 5).

Недавний анализ Hoxb1 мутантных мышей подтвердил идею, что Hox гены участвуют в спецификации субпопуляций вестибулярных проекционных нейронов. LVST теряются у Hoxb1^null мутантных эмбрионов и Hoxb1 необходим для наделения r4 качественными особенностями предшественников, которые, по-видимому, вносят вклад в LVST группу (Chen et al., 2012). Предшественники в регионе группы LVST обычно экспрессируют низкие уровни Ascl1 (ранее известного как Mash1), но у Hoxb1^null мутантов, Ascl1 усиливает свою активность до уровней, характерных для r3 (Gaufo et al., 2000; Chen et al., 2012). Как результат нейроны в латеральном регионе r4 экспрессируют отличающийся набор постмитотических транскрипционных факторов, что сопровождается изменениями в характере проекций. Т.о., экспрессия Hoxb1 в r4 безусловно регулирует судьбу вестибулярных нейронов, чтобы сформировать группу LVST с помощью ингибирования Ascl1 (Chen et al., 2012) (see also below).

HOX TRANSCRIPTIONAL NETWORKS IN SPINAL CORD REGIONALIZATION AND CONNECTIVITY

Как и в заднем мозге, инициальная экспрессия Hox генов создает группы мозаичного расположения в спинном мозге в виде продольных доменов, идентифицируемых с помощью уникальных комбинаций Hox генов (rev. Nolte and Krumlauf, 2006; Fig. 6). Хотя домены экспрессии паралогов 1-4 Hox генов, чьи передние границы лежат в заднем мозге, распространяются на спинной мозг с сохранением принципа posterior prevalence, в спинном мозге доминирует экспрессия Hox PG5-13 генов. Последовательный каудальный сдвиг границ передней экспрессии Hox PG5-13 генов создает чрезвычайно очерченный паттерн, который в плечевом и поясничном регионах приближается к посегментному разрешению. Заметим. что используя термин "сегмент" применительно к спинному мозгу, мы подразумеваем анатомически определяемые сегменты, которые характеризуются сегментным расположением спинальных афферентных и эфферентных корешков, а не на прирожденной сегментации, базирующейся на клонами обеспечиваемых компартментах, как в случае ромбомеров заднего мозга. Эта анатомическая сегментация прежде всего накладывается на спинной мозг за счет ограничивающего действия соседней сегментированной сомитной мезодермы на выросты нервов и эмиграцию нервного гребня (Keynes and Stern, 1984; Kuan et al., 2004). Однако имеются доказательства формирования внутреннего сегментного паттерна нейронов в спинном мозге млекопитающих, по крайней мере, в торакальном регионе (Forehand et al., 1994, 1998). Независимо от онтогенетических механизмов, с помощью которых формируются сегменты спинного мозга, как и в заднем мозге ранняя экспрессия Hox генов делит на части спинной мозг вдоль AP оси в соответствии с региональным (т.e., MN столбы и пулы [Tsuchida et al., 1994]; определенные популяции проекционных нейронов [Berretta et al.,1991; Tsuchida et al., 1994]) и сегментным (т.e., субпопуляции симпатических преганглиолярных нейронов Forehand et al., 1994) паттерном популяций спинальных нейронов. В самом деле, дифференциальная экспрессия Hoxc гена обеспечивает регион-специфические колоно-образные характеристики MNs и симпатическим преганглиолярным нейронам (Dasen et al., 2003). Hoxc9, в частности, играет критическую роль в ограничении двигательных нейронов, иннервирующих конечности, которые создают латеральные двигательные столбы в плечевом и поясничных регионах. Hoxc9 экспрессируется в торакальном регионе и репрессирует Hox гены, связанные со спецификацией иннервирующих конечности MNs. В его отсутствие, торакальные сегменты оказываются заполнены излишними количествами иннервирующих конечности MNs , а пулы двигательных нейронов передних конечностей и торакса становятся дезорганизованными (Jung et al.,2010). Регуляция границ передней экспрессии Hoxc с помощью активности polycomb repressive complex 1 (PRC1) является др. ключевым элементом в становлении продольных доменов, соответствующих специфическим столбам MN columns (Golden and Dasen, 2012). Очень вероятно, что дальнейшие исследования доменов ранней экспрессии Hox PG5-13 генов, как они связаны с продольными доменами специфических популяций спинальных нейронов, включая продольно ограниченные промежуточные нейроны и популяции проецирующихся нейронов, выявят множественные примеры колинеарности. Figure 6.

Более прямые взаимоотношения со спинальными circuitry нейронов выявлены при оценке более поздних паттернов экспрессии генов Hox и TALE в специфических пулах MN. Как и в заднем мозге, после ранних стадий, на которых экспрессия представлена непрерывными продольными доменами, экспрессия Hox генов в спинном мозге разрешается в более ограниченные домены, связанные с группами нейронов, в частности с субнаборами MNs (Lance-Jones et al., 2001; Carpenter, 2002). Чтобы определить, связано ли это ограничение со связями MNs с мышцами мишенями, Dasen et al. (2005) систематически оценивали экспрессию всех 39 Hox генов и TALE транскрипционных факторов Meis1, 2 и 3 и Pbx1, 2 и 3 в постмитотических MNs, начиная со стадии их генерации (когда домены экспрессии Hox генов продольные и непрерывные) до того момента, когда их аксоны покидают спинной мозг, чтобы иннервировать свои мышечные мишени. Они сфокусировались прежде всего на переходе от Hoxa5/c5 домена к Hoxc8 домену, который, как было установлено, четко демаркирует деление вдоль бокового двигательного столба между специфическими пулами MN, иннервирующих 4 разные мышцы передних конечностей. Используя РНК интерференцию или электропортацию, они затем показали, что нокдаун экспрессии Hoxc8 ведет к каудальной экспансии домена экспрессии Hoxa5/c5, тогда как эктопическая экспрессия Hoxc8 появляется более рострально за счет экспрессии Hoxa5/c5. В обоих случаях сдвиг границы экспрессии Hox генов приводил к сопутствующему сдвигу в расположении пулов MN, как показало ретроградное мечение из соотв. мышц. Т.о., переход от Hoxa5/c5 к Hoxc8 является критическим для становления определенного подразделения внутри боковых двигательных столбов, а экспрессия Hoxa5/c5 в противовес Hoxc8 участвует в спецификации связей с мышцами мишенями MNs на любой из строн этого подразделения (Fig. 7). Поскольку эктопическая экспрессия Hoxa5/c5 внутри нормального Hoxc8 домена не подавляет экспрессии Hoxc8 (как в случае обратного эксперимента), Hoxc8 безусловно контролирует переход посредством репрессирующего эффекта на Hoxa5/c5, в соответствии с принципом заднего превалирования (Duboule,1991). Figure 7.

Dasen et al. (2005) затем исследовали паттерн экспрессии Hox генов позднее, когда продольные непрерывные домены, начинали превращаться в небольшие, более ограниченные домены. На этой ст. они установили, что экспрессия определенных Нох генов и Meis1, оказывалась ограниченной специфическими MN пулами (Fig. 8A,B). В частности, специфические комбинации Hoxa4/c4, Hoxa6, Hoxa7, и Meis1 коррелировали с индивидуальными иннервирующими передние конечности пулами MN. Эктопическая экспрессия каждого из этих генов приводила к репрессии др., приводя к модели, согласно которой перекрестное репрессивное действие определяет субнабор экспрессируемых Hox генов в данной субпопуляции MNs. Более того, изменение профиля экспрессии Hox генов меняет соотв. мышечные связи MNs. Figure 8.

Т.о., две ступени участвуют в подразделении спинальных MNs в мышце-специфические пулы, которые и создают основу для избирательной активации мышц моторными circuits, обе регулируются Hox генами. Во-первых, ранние продольные домены Hox генов демаркируют шейный, плечевой, торакальный, поясничный и крестцовый регионы спинного мозга и тем самым предопределяют продольную протяженность столбов разных MN. Во-вторых, позднее экспрессия Hox генов разрешается в более ограниченные домены, которые коррелируют с индивидуальными пулами MN. Такая дифференциальная экспрессия возникает в результате взаимных репрессирующих действий, которые гарантируют уникальные профили Hox генов внутри пулов MN и тем самым соответствующие связи с мышцами.

HOX GENE REGULATION OF DIFFERENTIATION, AXON PATHFINDING, AND NEURONAL MIGRATION

Переход от ранних паттернов региональной экспрессии к более поздним паттернам экспрессии, специфичным для субпопуляций нейронов, ставит вопрос, могут ли Hox гены регулировать последующую дифференцировку нейронов и образование синаптических связей. Дифференцировка является процессом, который начинается вскоре после того, как рождаются нейроны и связана с экспрессией широкого спектра белков, необходимых для сигнальных функций (ионные канальцы, синтез и хранение нейротрансмиттеров, синаптическая функция) , а также рецепторов клеточной поверхности, обеспечивающих соотв. миграторное поведение и выросты аксонов. Некоторые гомеобоксные гены сопричастны к дифференцировке этих фенотипов, но здесь мы ограничим наше внимание специфически на Hox и TALE генах.

Neural Cell Differentiation and Axon Pathfinding

К нашему сведению нет доказательств прямой транскрипционной регуляции ионных каналов, связанных с нейротрансмиттерами или синаптических белков Hox генами млекопитающих. Хотя были придуманы различные стратегии для идентификации специфичных для ромбомеров генов и генов мишеней Hox (Rohrschneider et al.,2007; Chambers et al., 2009), исчерпывающая компиляция нижестоящих мишеней для различных Hox генов, которая могла бы предоставить важные указания относительно их роли в спецификации нейронов, всё ещё отсутствует. Описаны корреляции, такие как экспрессия Meis2 в субнаборе GABAergic амакринных клеток сетчатки и её временные взаимоотношения с перходом от GABAergic к glycinergic фенотипу у мышей (Bumsted-O'Brien et al., 2007) и экспрессия нескольких Hox генов, а также Meis1/2 в каудальной популяции serotonergic нейронов в заднем мозге мышей (Wylie et al., 2010). Однако имеются указания от беспозвоночных, что Hox гены могут играть непосредственную роль в определенных аспектах дифференцировки нейронов. Наиболее четкий пример это регуляция dopaminergic фенотипа ray сенсорных нейронов у C. elegans (Lints and Emmons, 1999). В этой системе, мутации в гене Egl5 (родственном с PB9-13 Hox генами позвоночных) устраняют dopaminergic дифференцировку, указывая на важную пермиссивную роль этого Hox гена в становлении dopaminergic фенотипа.

Хотя прямой транскрипционный контроль с помощью Hox генов генов терминальной дифференцировки недостаточно документирован, имеются всё увеличивающиеся доказательства, что Hox гены регулируют определенные пронейральные и нейрогенные гены, которые обнаруживают более тесные вышестоящие взаимоотношения с генами терминальной дифференцировки. Взаимодействие между генами Hox и пронейральными/нейрогенными генами связано со сцеплением между поздней экспрессией Hox генов и формированием DV паттерна , поскольку некоторые домены DV предшественников внутри нейроэпителия заднего и спинного мозга вычленяются с помощью экспрессии пронейральных и нейрогенных генов, таких как транскрипционные факторы Atoh1 (ранее известен как Math1), Ngn1 и 2, Ascl1 и Ptf1a. Это взаимоотношение было исследовано в основном в слуховой и предмозжечковой системах, обе происходящие из доменов дорсальных предшественников в заднем мозге.

В кохлеарном ядре GABAergic или glycinergic нейроны возникают из Ptf1 домена, тогда как glutamatergic нейроны из AVCN, PVCN, DCN и гранулярных клеток, а также из LSO и MSO, все происходят из домена Atoh1 (Wang et al.,2005; Maricich et al., 2009; Rose et al., 2009a, Fujiyama et al., 2009). Напротив, MNTB, VNTB и LNTB в основном возникают из En1-клона (Marrs et al.,2013). Некоторые расходящиеся доказательства также показывают вклад Wnt1 в VNTB и LNTB и вклады Atoh1 и Wnt3a в MNTB (Louvi et al., 2007; Maricich et al., 2009; Fu et al., 2011). В соответствии с этим функциональный анализ выявил критическую роль Atoh1 в слухе, балансе и бессознательной проприорецепции (Bermingham et al., 1999; Machold and Fishell, 2005; Wang et al.,2005; Maricich et al., 2009; Rose et al., 2009a, 2009b).

Предмозжечковая система обладает более разнообразным набором DV источников (rev. Ray and Dymecki, 2009). Нейроны с мшистыми волокнами происходят из доменов с Atoh1 и высоким уровнем Wnt1 (Landsberg et al., 2005; Machold and Fishell, 2005; Wang et al., 2005; Ray and Dymecki, 2009; Fu et al., 2011) и проецируются принципиально в гранулярные клетки и deep nuclear neurons (DNs) в мозжечке (Wang et al.,2005). Все мшистые волокна предмозжечковых ядер и их мозжечковые мишени зависят от Atoh1 в отношении детерминации своей судьбы и теряются у Atoh1^null мышей (Batini et al., 1992; Ben-Arie et al., 1997, 2000; Bermingham et al., 2001; Machold and Fishell, 2005; Wang et al., 2005; Hori and Hoshino, 2012). Большинство нейронов с восходящими волокнами в ION возникают из доменов с Ptf1a, Olig3 и низким уровнем Wnt1 (Landsberg et al., 2005; Yamada et al., 2007; Storm et al., 2009; Fu et al., 2011), но каудальный субнабор нейронов с восходящими волокнами в ION может происходить из Ngn1 и/или Ascl1 доменов (Ray and Dymecki, 2009). Ptf1a необходим для спецификации нейронов с восходящими волокнами и для их мишеней, клеток Пуркинье, в мозжечке. В самом деле, у Ptf1a^null мутантов ION не формируется и некоторые происходящие из Ptf1a нейроны трансформируются в нейроны с мшыстыми волокнами в PGN и ECN мутантных ядрах (Yamada et al., 2007). Сходным образом, в отсутствие Ptf1a, происходящие из Ptf1a мозжечковые GABAergic предшественники, оказываются детерминированными к продукции клеток Пуркинье, они экспрессируют Atoh1 и принимают фенотип, похожий на гранулярные клетки (Hoshino et al., 2005; Pascual et al., 2007). Следовательно, Ptf1 и Atoh1 предшественники генерируют взаимосвязанные компоненты (нейроны с предмозжечковыми волокнами и их мишени) восходяшей и мшистой предмозжечковых систем, соотв. В обеих, нейронах с восходящими волокнами и в клетках Пуркинье, Ptf1a ингибирует продуцируемые Atoh1 фенотипы.

Особенно интересен тот факт, что как в кохлеарных ядрах, так и в мозжечке Atoh1 домен дает возбуждающие (glutamatergic) нейроны, тогда как Ptf1 домен дает ингибирующие (GABAergic или glycinergic) нейроны (Fujiyama et al., 2009; Hoshino et al., 2005). Ptf1a экспрессия способствует дифференцировке GABAergic над glutamatergic нейронами в мозжечке и спинном мозге (Glasgow et al., 2005; Pascual et al., 2007). В отсутствие экспрессии Ptf1 в мозжечке, нейроны, происходящие из Ptf1a домена, аномально экспрессиют Atoh1 и генерируют эктопические возбуждающие glutamatergic гранулярные клетки (Pascual et al., 2007).

Хотя доказательства прямых регуляторных взаимоотношений между Hox генами и этими пронейральными/нейрогенными генами ещё не получены, наши исследования в слуховой системе показали некоторые интересные наблюдения касательно Hox генов м сленов семейства Atoh. В отсутствие Hoxb1, Hoxa2 и Atoh7, обычно экспрессирующихся на высоком уровне в AVCN, наблюдается эктопическое усиление активности в происходящем из r4 PVCN, ведущее к трансформации PVCN в AVCN (Di Bonito et al., 2013). Эктопические Atoh7+ клетки, которые происходят из домена Atoh1, д. дифференцироваться в glutamatergic, parvalbumin⁺ сферические лохматые клетки (Farago et al., 2006; Saul et al., 2008; Fujiyama et al., 2009; Maricich et al., 2009 and unpublished data), и проецироваться в MNTB ядро, как если бы они были AVCN нейронами (Saul et al., 2008; Renier et al., 2010; Di Bonito et al., 2013). Более того, происходящие из r4 мутантные нейроны аномально дифференцируются в кохлеарные гранулярные клетки, которые обычно не происходят из r4, и проникают в слой glutamatergic гранулярной оболочки, как это наблюдается в мозжечке у Ptf1a мутантов. Аномальная продукция Atoh7⁺ нейронов и glutamatergic гранулярных клеток в происходящем из r4 мутантном CN коррелирует с увеличением домена Atoh1 в дорсальной части r4 Hoxb1^null мутантов на ранних стадиях, подтверждая, что Hoxb1 обычно ингибирует Atoh1 в r4 (Di Bonito et al., 2013) (Fig. 9). Следовательно, трансформация характеристик r4 в r3, как результат инактивации Hoxb1, ведет к увеличению происходящих из Atoh1 популяций возбуждающих нейронов и одновременно к снижению ингибирующих типов клеток (таких как Gad67-экспрессирующие популяции в VLL) в r4. Исходя из этих наблюдений, можно предположить, что Ptf1a, как известно, способствующий выбору GABAergic судьбы в противовес glutamatergic нейрональным клеткам, может действовать ниже Hoxb1, чтобы редуцировать продукцию происходящих из Atoh1 популяций glutamatergic нейронов в дорсальной части r4 и его производных (Fig. 9). Как в мозжечке и предмозжечковой системах Ptf1a может негативно регулировать Atoh1 glutamatergic судьбы в происходящем из r4 кохлеарном ядре, тогда как Atoh1 будет в основном вносить вклад в r3-r5 производные слуховой системы. Т.о., поскольку в r4, Hoxb1 ингибирует Atoh1, возможно посредством Ptf1a, то в предмозжечковой системе возможен контроль Atoh1 и Ptf1a с помощью Hox генов, но это предстоит доказать. напротив, экспрессия Atoh7 не меняется в клетках Hoxa2^null кохлеарного ядра, несмотря на сильную редукцию ядра (Di Bonito et al., 2013). Следовательно, Hoxa2 и Atoh7, стоящие ниже Atoh1 могут действовать в двух независимых путях, участвуя в формировании AVCN, качественных характеристик и связей в r3. Оба пути д. обычно замалчиваться в r4 благодаря действию Hoxb1, который негативно регулирует Hoxa2 и Atoh1, чтобы ингибировать спецификацию r3-подобных структур (Fig. 9).

Hoxb1 ингибирование Hoxa2 в r4 репрессирует r3-подобные свойства не только в слуховой системе, но и также в др. системах. Мы установили, что у Hoxb1^null и кондиционных мутантов, у которых r4 приобретает r3-подобные качественные особенности, происходящие из r4 нейроны вносят вклад эктопически в PrV и проецируются к barreloids дорсо-латеральных частей VPM в тройничной системе (Fig. 4B-D and unpublished data). Усиление активности Hoxa2 в r4, наблюдаемое на ранних стадиях (Di Bonito et al., 2013), может, следовательно, наделять признаками нахождения путей для аксонов, характерных для происходящих из r3 PrV нейронов (Fig. 4A).

Др. пример контроля Hox генами пронейральных генов исходит из доказательств противоположных ролей Hoxb2 и Hoxa2 генов во время олигодендрогенеза ростральной части заднего мозга (Miguez et al., 2012). Поскольку Hoxa2 пространственно ограничивает дорсальное расширение домена предшественников, экспрессирующих Olig2/Nkx2.2 в вентральных территориях, происходящих из r2-r4, то Hoxb2 усиливает пролиферацию Olig2⁺ предшественников в r3 и особенно в r4. У Hoxa2^null мутантных эмбрионов домены экспрессии Nkx2.2 и Olig2 в происходящей из r2-r4 вентральной пластинке, и расширяются дорсально, тогда как Pax6 и пронейральный ген Ngn2 редуцируются, приводя к дорсальному сдвигу их вентральных границ (Miguez et al., 2012). На уровне r4, обычно, домен экспрессии Nkx2.2 дорсальнее крупнее, чем его r2/3 аналог, тогда как у мутантных Hoxb1^null эмбрионов, Nkx2.2 редуцирован, а Pax6 расширяется вентрально в регион, который обычно экспрессируют Nkx2.2 (Gaufo et al., 2000), противоположный фенотип у Hoxa2^null мутантов. Т.о., Hoxb1, путем репрессии Hoxa2 в r4 (Di Bonito et al., 2013), может уменьшить Hoxa2-обеспечиваемое ингибирование, которое обычно ограничивает генерацию предшественников олигодендроцитов и вносит вклад в увеличение домена Nkx2.2. Противоположный контроль Hoxb1, оказываемый на Hoxb2 и Hoxa2 в r4, может быть критическим во время экстенсивной продукции олигодендроцитов в регионе варолиева моста, территории, происходящей из r4; в согласии с этим мы обнаружили уменьшение олигодендроцитов у Hoxb1 мутантных щенков (Fig. 9 and unpublished data). Напротив, задержанная и пониженная продукция олигодендроцитов в регионе варолиева моста из r2- и r3-происходящих территорий д. быть существенной благодаря тонкой регуляции двух Hox PG2 генов (Miguez et al., 2012).

В целом, ингибирование Hoxa2, обеспечиваемое с помощью Hoxb1 в r4, по-видимому, обычно репрессирует r3-подобные свойства в слуховой и тройничной системах и во время продукции олигодендроцитов посредством разных путей (Fig. 9).

Neuronal Migration

Важная ступень в становлении нейрональных связей (circuits) связана с миграцией нейронов из мест своего происхождения к финальному местоположению. Связь между экспрессией Hox генов и миграторным поведением исследовалась в предмозжечковой системе (Geisen et al., 2008; Di Meglio et al., 2013).

Тангенциально мигрирующие PN нейроны перемещаются из r6-r8 ромбической губы рострально через r5, r4 и r3. Они никогда не вступают в r2, но поворачивают вентрально и повторно вступают в r4, где они, наконец, гнездятся вблизи вентральной пластинки нервной трубки (Geisen et al., 2008). Отсюда они проецируют свои аксоны поперек срединной линии в контралатеральные части мозжечка (Altman and Bayer, 1987d). Система ведения, состоящая из лиганда Netrin1 и рецептора DCC, участвует в хемоаттракции тангенциально мигрирующих нейронов в направлении срединной линии. Вентральная пластинка экспрессирует Netrin1, а PN нейроны экспрессируют его рецептор DCC вдоль миграторного пути (Yee et al., 1999). оотв. у Netrin1 и Dcc мутантных мышей, PN нейроны развиваются аномально (Serafini et al., 1996; Fazeli et al., 1997), мигрируют рострально и агрегируют в эктопической дорсальной позиции (Yee et al., 1999).

Экспрессия Hoxa2 и Hoxb2 поддерживается в PN нейронах в ходе всей их миграции. Hoxa2, и в меньшей степени Hoxb2, необходимы для нормальной ростральной миграции, т.к. предупреждают преждевременное привлечение в направлении срединной линии (Geisen et al., 2008). У Hoxa2 мутантов и варьирующего числа Hoxb2 мутантов, субнаборы PN нейронов мигрируют вентрально преждевременно, занимая эктопическое заднее местоположение, тогда как основная масса нейронов следует нормальному пути ростральной миграции. Аномальный характер миграции обнаруживает варьирующую пенетрантность. Часть нейронов варьирует в обнаружении ошибок миграции в количественном и пространственном отношении среди индивидов и часто асимметрично распределяется на двух сторонах одного и того же ствола мозга. Т.о., др. члены семейства Hox могут стохастически компенсировать потерю Hox PG2 генов во время миграции PN. Более того, функциональное перекрывание может также существовать среди Hox PG2 генов, поскольку двойные Hox PG2 мутанты обнаруживают больше эктопических нейронов по сравнению с одиночными.

Кондиционные мутанты, у которых Hoxa2 делетируется избирательно в производных ромбической губы, обнаруживают менее выраженный фенотип во сравнению с нулевыми мутантами, подтверждая, что Hoxa2 необходим как клеточно автономно в PN нейронах, так и клеточно неавтономно в окружении, через которое мигрируют нейроны (Geisen et al., 2008). Важными факторами в этом окружении являются хемотрофные молекулы семейства Slit и их Roundabout (Robo) рецепторы. Slit белки являются главными репеллентами для развивающихся нейронов (rev. Brose and Tessier-Lavigne, 2000) и, как было установлено, противодействуют привлекающему действию Netrin1 посредством Robo/DCC рецепторного комплекса (Stein and Tessier-Lavigne, 2001; Causeret et al., 2002). Robo1 и Robo2 экспрессируются в PN во время их миграции, а Slit1-3 экспрессируются в вентральной пластинке нервной трубки и ромбической губе, а Slit2 и Slit3, но не Slit1, экспрессируются в facial motor nucleus (FMN). Hoxa2 непосредственно регулирует Robo2, а у Hoxa2 мутантов экспрессия Robo2 снижена в мигрирующих PN нейронах, тогда как уровни экспрессии Slit2 редуцированы в FMN. Дефекты миграции PN обнаруживаемые у Hoxa2 мутантов, фенокопируют дефекты, наблюдаемые у Slit/Robo компаундных мутантов и у Phox2b-нокацтных мышей, которые полностью лишены Slit-экспрессирующего FMN. Т.о., FMN является важным внешним источником Slit лигандов, участвующих в поддержании нормальной ростральной миграции Robo-экспрессирующих PN нейронов (Geisen et al., 2008).

В модели, предлагаемой для контроля траектории миграции PN, Netrin1/DCC-обеспечиваемому привлечению в направлении срединной линии осуществляется противодействие Hoxa2-обеспечиваемой регуляцией передачи отталкивающих сигналов Slit-Robo во время ростральной фазы миграции, тем самым предупреждается преждевременная вентральная миграция до тех пор, пока нейроны не достигнут r3 и не предпримут своей финальной миграции в вентральную часть r4 (Geisen et al.,2008; Narita and Rijli, 2009). На этом осевом уровне, Robo3 функция становится преобладающей, репрессирующей обеспечиваемое Slit отталкивание (Sabatier et al., 2004). Это позволяет комплексу Netrin1/DCC привлекать PN нейроны (Yee et al., 1999), которые теперь поворачивают вентрально и способны отвечать на Slit белки, диффундирующие из FMN в вентральной части r6. Robo3 контролирует пересечение срединной линии предмозжечковыми нейронам заднего мозга и аксонами (Marillat et al., 2004).

Др. интересный пример того, как экспрессия Hox генов регулируется во время миграции нейронов, связан с Ezh2, членом Polycomb repressive complex 2, который репрессирует экспрессию Hox PG4 и PG5 генов в нейронах, которые мигрируют в дорсальном aes, внося вклад в молекулярную гетерогенность миграционных потоков (Di Meglio et al., 2013). Hox PG5 гены, обычно репрессируют Unc5b, Netrin-связываемый рецептор (Leonardo et al.,1997), необходимый для обеспечения реакций отталкивания к Netrin1 в нейронах, которые мигрируют в вентральной части aes (Przyborski et al., 1998). Следовательно, дорсо-вентральная высокая-к-низкой плотность клеток, экспрессирующих Unc5b, противоположная градиенту экспрессии Hox PG5 гена, вносит вклад в поддержание топографических взаимоотношений в миграторных потоках в варолиевом мосту (Di Meglio et al., 2013) (Fig. 10).

Ezh2 обладает также неавтономной функцией. Ezh2 репрессирует Netrin1 в дорсальных территориях заднего мозга, включая окружение, через которое мигрируют PN (Di Meglio et al., 2013). У мутантных мышей, где Ezh2 кондиционно инактивирован в окружении, дерепрессия Netrin1 приводит к аномальной миграции и избыточному количеству PN, которые интегрируют в кортико-мозжечковые circuitry. Unc5b-экспрессирующие нейроны остаются дорсальными и продолжают свою нормальную миграцию, тогда как Hox PG5⁺/Unc5b^- нейроны испытывают предпочтительно влияние со стороны усиленной активности Netrin1 и эктопически привлекаются к срединной линии. Когда Ezh2 инактивирован как в мигрирующих нейронах, так и из миграторном окружении, то наблюдается более тяжелый фенотип. Нейроны, которые обычно должны следовать в aes неспособны мигрировать рострально в r6 и вместо этого обосновываются в одиночном заднем PN. Когда теряются пути, регулируемые внутренними и внешними Ezh2, то все Ezh2 мутантные pontine нейроны становятся Hox PG5⁺, подавляют Unc5b и мигрируют через окружение, экспрессирующее Netrin1, и на этом пути преждевременно привлекаются к эктопической задней позиции срединной линии (Fig. 10).

Напротив, избыточная экспрессия Unc5b в мигрирующих нейронах блокирует Hoxa5-негативные субнаборы PN в дорсальной позиции и предупреждает или задерживает поворот к срединной линии, вызывая эктопическую переднюю миграцию. Сходным образом, кондиционная избыточная экспрессия Hoxa2 в производных ромбической губы также поддерживает высокую экспрессию Unc5b в мигрирующих нейронах, приводя к передней эктопической миграции и к генерации рострально удлиненного PN.

Итак, Hox PG2 гены позитивно регулируют экспрессию Unc5b в дорсальном aes, тогда как Hox PG5 гены, репрессируют Ezh2 в дорсальном aes, негативно регулируя Unc5b в вентральном миграторном потоке, генерируя в этом пути дифференциальные реакции на средовые сигналы (Di Meglio et al., 2013) (summarized in Fig. 10). Следовательно, Hox гены, за счет поддержания своих пространственно ограниченных паттернов экспрессии предшественников в pontine миграторном потоке, контролируют сложные миграторные процессы с вовлечением множественных сигналов ведения в предмозжечковой системе (Geisen et al., 2008; Di Meglio et al., 2013).

CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES

There is now a wealth of evidence that Hox genes not only are crucial for the early segmental and regional patterning of the hindbrain and spinal cord along the AP axis, but that they play pivotal roles in the patterning of postmitotic neurons and their connections into circuits. Although significant advances have been made in understanding the role of Hox genes in the specification and differentiation of several neuronal systems, there remains a huge amount of information yet to be acquired. Here, we list some of the important challenges we believe need to be addressed. Complete Fate-Mapping of the AP and DV Origins of Neural Cell Populations From Early Hox Gene Domains During Stages of Hindbrain and Spinal Cord Regionalization To date, only a few of the early domains defined by Hox gene expression have been fate-mapped, and in existing studies only a few of the derivative neuron populations have been identified. A more comprehensive analysis will provide important information about which neuron populations share common AP and/or DV origins, as well as about migratory patterns that mix and reposition neurons into the characteristic mature anatomical organization of nuclei and interposed neuron groups.

Intersectional long-term fate mapping, first proposed by the Dymecki group (Farago et al., 2006), is becoming a pivotal approach to selectively access single neuron populations for higher resolution fate-mapping and functional manipulation (Dymecki et al., 2010). Dissecting the DV sub-domains and/or sub-types of single rhombomeres would extensively contribute to the elucidation of individual sensorimotor systems and their respective circuits. To achieve this goal, the community needs more rhombomere-specific flippase transgenic mice, which can be used in conjunction with subdomain-specific Cre-recombinasetransgenic mice in the intersectional fate-mapping strategy. In this way, individual Hox genes could be inactivated in single neuron types or subpopulations and their function tested for cell-autonomous effects. The intersectional strategy could also use inducible transgenic effector molecules to abolish Hox function in specific postmitotic neuron populations allowing in this way further elucidation of their roles in the processes of migration, axonal pathfinding and differentiation, and ultimately circuit formation.

Characterization of the Regulatory Elements and Cellular Interactions That Control the Switch From Early AP Hox Gene Expression Patterns to Later, Neural Cell Population-Specific HoxGene Expression Patterns

Hox gene inter-regulatory interactions such as the cross-repressive interactions and auto-regulatory feedback loops demonstrated in the studies above, illustrate how Hox gene expression can be sculpted into regional and temporal patterns at the transcriptional level. This is a key aspect of how Hox genes define neuron populations and control their connectivity to define neural circuits. Deciphering the molecular events that transform Hox gene expression from a regional patterning mechanism to a neuron type-patterning mechanism is an important step toward understanding the development and evolution of hindbrain and spinal cord circuitry. To this end, more extensive studies using both transgenic approaches in mice and gain- and loss-of-function experiments in chicken embryos, with appropriate spatial and temporal targeting, are required. Although bioinformatics is creating increasingly sophisticated approaches for the identification of cis-regulatory elements, and the automatization of genomic interrogation is increasing the throughput of regulatory element mapping, the fact that this transition occurs at early development stages, with a high spatial resolution involving relatively few cells, means that painstaking functional assessment through experimental embryology will continue to be a necessary approach. So far, only a few transcription factors have been identified that regulate Hox genes. Moreover, the involvement of epigenetic modifications, chromosome structure and noncoding RNAs broadens the regulatory arena and is likely to present interesting examples of multilevel regulatory interactions (Soshnikova, 2013). An intriguing possibility is that epigenetic events such as the histone modifications seen in Hox promoters in embryonic stem (ES) cells (Azuara et al., 2006; Bernstein et al., 2006; Zhao et al., 2007), and which provide a permissive situation for future transcriptional regulation, could be pivotal for facilitating decisive shifts in expression pattern modes (Mazzoni et al., 2013).

Complete Assessment of Hox Gene Expression in Identified Neuron Populations During Phases of Migration and Differentiation

To date, only a few sensorimotor systems and neuron types have been investigated, and the expression of only a few of the relevant Hox genes has been assessed in most of these. Although studies published so far establish clearly the importance of Hox genes in regulating neuronal migratory patterns and differentiation, this is hardly more than a scratch in the surface considering the full gamut of Hox genes and the diverse neural cell populations present in the hindbrain and spinal cord. Many of the neuronal subpopulations can only be identified definitively through anatomical (tracing) or molecular (transgenic reporter line) approaches. Thus, one of the implicit challenges here lies in the proper labeling of neuron subpopulations and their isolation from each other. Once this is accomplished, there are multiple approaches available for assessing Hox gene expression, including in situ methods (in situ hybridization, immunohistochemistry) as well as more invasive methods for obtaining mRNAfrom single or small numbers of cells. Such approaches in combination with advances in increasing the throughput and sensitivity of nucleic acid sequencing are rapidly making it possible to generate gene expression profiles from few cells.

Obtaining robust cell type-specific gene expression profiles is also an important step in parallel endeavours to generate specific neuron and glia cell types from animal and human stem cells, including ES cells and induced pluripotent stem cells (iPS) cells. To this end, comprehensive knowledge of the differentiation programs involved, including the identity of transcription factors and the timing of their expression, are essential for developing suitable in vitro differentiation protocols. In this connection, Hox genes are likely to be important components of protocols designed to promote the differentiation of specific spinal cord and hindbrain neuron types (Pattyn et al., 2003; Samad et al., 2004; Jung et al., 2010; Huber et al., 2012; Misra et al., 2012; Philippidou et al., 2012; Lacombe et al.,2013).

Selective Manipulation of Hox and TALE Gene Expression in Identified Neural Cell Populations Using Conditional Transgenics to Distinguish Direct, Cell-Autonomous Effects From Indirect Cell Non-autonomous Effects

This is a daunting task because it needs to be performed with respect to multiple phenotypic characters including neuronal migration, the differentiation of the full spectrum of neuronal attributes, and the selective formation of synaptic connections, for each neuron population, probably at different time points, before a complete picture of Hox gene actions can be obtained.

Full Cataloging of Direct Downstream Targets of Hox Genes in Identified Neuron Populations

This is strongly linked to challenge (4), in that once the times and places of Hoxgene actions are described, the downstream targets that they activate need to be identified and tested for functional involvement in the different features of neuronal differentiation and circuit formation. Here again, it will be necessary to use multiple approaches that culminate in functional assays in the developing brain. An illustration of the power of combining sequencing, targeted mutation and functional assays in the developing brain is the recent identification of an EMX2 binding site that regulates the expression of the human teneurin-1 gene (Beckmann et al., 2011).

Hox genes and region-specific sensorimotor circuit formation in the hindbrain and spinal cord Maria Di Bonito, Joel C. Glover, Michуle Studer Developmental Dynamics 242:1348-1368, 2013.

Hox genes and region-specific sensorimotor circuit formation in the hindbrain and spinal cord
Maria Di Bonito, Joel C. Glover, Michуle Studer
Developmental Dynamics 242:1348-1368, 2013.