ДНК обёрнута вокруг гистоновых октамеров, чтобы сформировать нуклеосом стержневые частицы, которые являются основой повторяющихся единиц хроматина. Одиночная нуклеосома состоит из приблизительно двух витков ДНК, обёрнутой вокруг октамера из стержневых гистоновых белков, формируемых парами H2A-H2B димеров и тетрамером H3-H4. Хотя упаковка ДНК в хроматин делает возможной компакцию крупных геномов, это также наделяет подлежащие последовательности ДНК недоступными для большинства процессов, включая связывание транскрипционных факторов. Поэтому необходимы механизмы, участвующие в контроле упаковки хроматина, с целью модуляции доступности ДНК. Такие вариации в состоянии хроматина являются жизненно важными в дополнение к разным паттернам генной экспрессии, которые определяют более 300 типов клеток, которые формируют тело человека из плюрипотентной стволовой клетки в терминально дифференцированные клетки, каждая из которых содержит одну и ту же последовательность ДНК.

Гистоны являются предметом ряда пост-трансляционных модификаций, включая ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинирование, которые могут изменять свойства или взаимодействующих партнеров нуклеосом. Кроме того, у млекопитающих три из 4-х субъединиц гистоновых складчатых доменов из близких октамерных нуклеосом - H2A, H2B и H3 - разнообразятся на ряд гистоновых вариантов (Table 1). Разные свойства этих вариантов делают возможной дальнейшую диверсификацию состояний хроматина, которые жизненно важны для регуляции качественных особенностей клеток в ходе развития животных. Table 1.

Summary of human core histone variants and associated factors

'Канонические' гистоны, которые откладываются replication-coupled способом, экспрессируются с тандемных рядов генов и наивысшие уровни приходятся на S фазу, это делает возможным их быстрое отложение позади репликационной вилки. Эта связанная с S-фазой экспрессия канонических гистонов частично находится под жестким контролем посредством уникального 3' конца мРНК, который вместо poly(A) хвоста, содержит последовательность в 26 bp, которая образует структуру шпильки, распознаваемую stem-петлёй связываемого белка (Whitfield et al., 2000). Напротив, гены для гистоновых вариантов обычно обнаруживаются в виде одиночной или нескольких копий и варианты экспрессируются и инкорпорируются в хроматин во время клеточного цикла независимым от репликации способом. Вплоть до недавнего времени гистоновые варианты привлекали мало внимания по сравнению с гистоновыми модификациями. Однако обнаружение, что локальное замещение канонического гистона на вариант изменяет состояние хроматина, привело к возобновлению интереса. В самом деле, гистоновые варианты играют жизненно важную роль в развитии. Напр., мужской пронуклеус подвергается инкорпорации по всему геному гистонового варианта H3.3 при оплодотворении (Loppin et al., 2005), а в терминально дифференцированном состоянии уровни гистона H3.3 возрастают ~90% от общего содержания H3 в зрелых кортикальных нейронах, будучи экспрессируемыми независимо от клеточного цикла (Pina and Suau, 1987).

Концепция ядерного репрограммирования была распознана более 50 лет тому назад, но стала предметом нового интереса с появлением induced pluripotent stem cells (iPSCs) (Gurdon et al., 1958; Takahashi and Yamanaka, 2006). Однако отдача и эффективность репрограммирования всё ещё дебатируются.

Histone variants are deposited by distinct replication-independent pathways

Механизм независимого от репликации отложения гистоновых вариантов (Fig. 1) является важным для понимания того, как они могут менять состояние и функцию хроматина при выборе клетками судьбы. Поскольку инкорпорация специфического варианта с отличающимися свойствами, независимое от репликации отложение гистонов обладают потенциалом стирать существующие пост-трансляционные модификации, это подчеркивает динамическую природу хроматина. Гистоны участвуют как высоко щелочные (basic) белки, чтобы сделать возможной компакцию очень сильно кислой молекулы ДНК. Соответственно, гистоны могут легко устанавливать нежелательные взаимодействия с нуклеиновыми кислотами и др. компонентами клеток. Чтобы избежать этого гистоны экскортируются шаперонами, которые заслоняют позитивный заряд, чтобы обеспечить корректный перенос на ДНК. Обычно каждый вариант имеет преданный себе шаперон, а понимание их взаимодействия, скорее всего, прольёт свет на функцию варианта. Fig. 1.

cenH3 and its chaperones

Центромеры, которые являются местами прикрепления микротрубочек веретена во время митозов, характерны для эукариотических хромосом. Являются ли центромеры почкующихся дрожжей генетически определяемыми по ~120 bp последовательности ДНК (Bloom and Carbon, 1982), центромеры растений и животных значительно крупнее и более сложны, обычно состоят из набора коротких тандемных повторов, таких как в 171 bpα-сателлитных повторов в центромерах человека (Yang et al., 2000). Однако, учитывая образование человеческих неоцентромер в эктопических местах, которые не обнаруживают четкого сходства с α-сателлитными повторами, становится ясно, что только последовательность ДНК не может объяснить эпигенетической стабильности центромер у высших эукариот (Warburton, 2004). Вместо этого последовательность ДНК становится четким идентификатором, присутствия определенного гистонового H3 варианта, cenH3 (CENP-A у млекопитающих), это почти универсальное свойство центромер (Earnshaw and Rothfield, 1985; Palmer et al., 1987). Ранние работы пытались различить расположение человеческого CENP-A с помощью экспрессии гена под контролем зависимого от репликации промотора H3, однако этот подход оказался неспособным обеспечить глобальное неправильное включение белка, тогда как использование независимого от репликации промотора приводило к мечению центромер (Shelby et al., 1997). С тех пор независимая от репликации природа сборки cenH3 нуклеосом, как было установлено, почти универсальна, при этом человеческий CENP-A откладывается во время или слегка предшествуя G1 фазе клеточного цикла (Shelby et al., 2000; Jansen et al., 2007; Hemmerich et al., 2008). Даже при быстрых синцитиальных делениях у ранних эмбрионов Drosophila, которые лишены G1 и G2 фаз в клеточном цикле, отложение cenH3 (Cid у Drosophila) происходило во время анафазы короткого, 20-минутного S/M клеточного цикла (Schuh et al., 2007).

Попытки понять, как cenH3 откладывается в центромерах были сфокусированы на очистке комплексов, содержащих растворимый cenH3. В Drosophila S2 клетках был идентифицирован тримолекулярный комплекс, содержащий cenH3, гистон H4 и гистоновый шаперон RbAp48 (Furuyama et al., 2006). Когда воссоздали этот комплекс, то этот комплекс оказался достаточным для сборки хроматина без добавления компонентов, подтверждая, что доставка cenH3 в центромеры не зависит от процесса сборки. Однако, механизм, с помощью которого cenH3 локализуется в центромерах пока остается неизвестным. Глобальное неправильное включение cenH3 наблюдается вследствие избыточной экспрессии, подтверждая пассивный механизм заполнения пустоты для включения новых нуклеосом, содержащих cenH3 в центромеры, напр., в анафазе во время митозов у ранних эмбрионов Drosophila (Schuh et al., 2007; Krassovsky et al., 2012). Альтернативно, механизм прямого рекрутирования может использовать существующие cenH3-содержащие нуклеосомы, чтобы рекрутировать новые cenH3 посредством дополнительных факторов. В самом деле, дальнейшие исследования на клетках человека идентифицировали CENP-A-специфический шаперон, HJURP, который необходим для включения CENP-A в центромеры и является гомологом cenH3-ассоциированного белка Scm3 почкующихся дрожжей (Dunleavy et al., 2009; Foltz et al., 2009). Как HJURP распознает центромеры неясно, но структурный анализ показывает, что и Scm3 и HJURP блокируют ДНК-связывающий регион cenH3 (Hong et al., 2013). Это подтверждает, что специфичное для центромер отложение cenH3 предопределяется посредством шаперонов у организмов, которые экспрессируют HJURP и Scm3.

H3.3 and its chaperones Hira, Daxx and ATRX

У молчащих клеток отсутствие независимой от репликации сборки нуклеосом д. быть результатом прогрессивной потери нуклеосом в результате процесса, такого как транскрипция, которые вызывает изгнание нуклеосом. Недавнее исследование показало, что гистоновый вариант H3.3 предоставляет собой источник замещения субъединиц H3, которые синтезируются в ходе клеточного цикла (Ahmad and Henikoff, 2002). H3.3 отличается от канонических зависимых от репликации гистонов H3.1 и H3.2 только по 4-5 позициям аминокислот. Напр., позиция 31 N-терминального хвоста является аланиновым остатком в H3.1 и H3.2, но серином в H3.3, который может быть фосфорилирован во время митоза (Hake et al., 2005). Др. отличия лежат внутри спирали α2 и специфицируют независимую от репликации сборку; мутирование этих остатков в каноническом H3 к тому, что найден у H3.3 делает возможны некоторые отложения вне S фазы (Ahmad and Henikoff, 2002). Различия в природе отложений могут быть объяснены различиями в гистоновых шаперонах. С помощью очистки растворимых комплексов сборки нуклеосом, идентифицируется отличающийся аппарат сборки; используя HeLa клетки, канонический H3.1 очищен совместно с CAF1 для независимого от репликации отложения, тогда как H3.3 очищается совместно с HIRA, шапероном, участвующим в независимом от репликации отложении (Tagami et al., 2004). Недавно идентифицирован Daxx/ATRX в качестве дополнительного H3.3 шаперона (Elsaesser and Allis, 2010). Кристаллическая структура высокого разрешения Daxx в комплексе с H3.3-H4 димером выявила, что Daxx конкурирует за основные гистон-ДНК контакты способом, сходным со взаимодействием между шапероном HJURP и CENP-A (Elsasser et al., 2012; Hong et al., 2013). Этот структурный анализ объясняет специфичность для Daxx по связыванию H3.3, при этом H3.3-специфичный остаток Gly90 является основным вкладчиком в специфичность (Elsasser et al., 2012). ATRX является членом семейства SNF2 ATФ-зависимых ремодельеров хроматина и он существует совместно с Daxx (Xue et al., 2003). ATRX относится к подсемейству Rad54, при этом Rad54 является ДНК транслоказой, которая лишена активности ремоделировать хроматин. У Drosophila, у которой отсутствует очевидный аналог Daxx, гомолог ATRX, как было установлено, соединяется с нуклеосомами, свободными от ДНК и кооперирует с Hira, чтобы откладывать H3.3-содержащие нуклеосомы вследствие транскрипционной активации с помощью теплового шока, это подтверждает, что вообще-то транслокация ATRX ДНК функционирует, чтобы временно поддерживать ДНК, подвергшуюся действию превентивных ложных факторов связывания, т.к. это позволяет эффективную замену нуклеосом и поддержание плотности нуклеосом (Schneiderman et al., 2012).

Изучение геномной локализации H3.3 затрудняется отсутствием специфических антител, которые могли позволить различать между H3 и H3.3. Превалирующим мнением стало то, что H3.3 является характеристикой активных генов, при этом оборот гистонов происходит прежде всего как следствие транскрипции (Ahmad and Henikoff, 2002; Schwartz and Ahmad, 2005). Однако, недавние успехи с использованием иммунопреципитации хроматина в комбинации с высокопроизводительным секвенированием (ChIP-seq) мышиных эмбриональных стволовых клеток (ESCs) показали, что H3.3 действительно наиболее распространен в геноме, обнаруживаясь в сайтах связывания транскрипционных факторов, из которых приблизительно половина зависит от Hira в ESCs (Goldberg et al., 2010). H3.3 был также обнаружен во многих молчащих промоторах генов, но не внутри тела соотв. гена и в ESCs многие молчащие промоторы, как было установлено, подвергаются раундам абортивной транскрипции (Guenther et al., 2007). Это указывает на то, что инкорпорация H3.3 возникает в результате действия РНК полимеразы (Fig. 1), абортивного или процессивного, вообще-то как следствие вытеснения нуклеосом с помощью полимеразы и затем последующего замещения H3.3-содержащими нуклеосомами. Однако, всё ещё открыт вопрос, необходим ли H3.3 для поддержания этого равновесного состояния для будущей активации гена.

Неожиданно, отложения H3.3 были также обнаружены в теломерах и перицентрических повторах, инкорпорируемые с помощью ATRX и Daxx, которые необходимы для репрессии теломерных содержащих повторы РНК (Drane et al., 2010; Goldberg et al., 2010). Эти наблюдения подтверждают, что концепция H3.3 как метки транскрипционно активного хроматина, должна быть пересмотрена; он возможно функционирует во многих контекстах как замещающий гистон, везде где происходит вытеснение гистонов в геноме и, следовательно, его локализация просто доказательство динамики хроматина.

H2A.Z and the chromatin remodelers Swr1 and INO80

Помимо H3.3, который замещает H3 в тетрамере нуклеосомы, H2A-H2B димеры могут быть замещены несколькими разными вариантами H2A независимо от репликации. Одним из таких вариантов является H2A.Z. Высокого разрешения кристаллическая структура H2A.Z-содержащей нуклеосомы обнаруживает несколько уникальных свойств этого варианта, которые включают расширенный кислый участок на поверхности нуклеосомы, который, как было установлено, имеет функциональное значение (Clarkson et al., 1999; Suto et al., 2000). H2A.Z , как известно, обладает широким набором функций, включая и активацию и репрессию транскрипции, транскрипционную элонгацию и расхождение хромосом. H2A.Z-содержащие нуклеосомы преимущественно занимают позиции, фланкирующие точку старта транскрипции (Barski et al., 2007; Luk et al., 2010). Кроме того, H2A.Z откладывается в крупных массивах гетерохроматина, напр., в субтеломерных повторах, где он не ацетилируется, а почкующихся дрожжей функционирует, чтобы предупредить распространение молчащего хроматина внутрь от теломер (Venkatasubrahmanyam et al., 2007). Принимая во внимание, что октамер содержит две H2A субъединицы, так что замещение H2A на H2A.Z может давать нуклеосомы, содержащие или гомотипические (ZZ) или гетеротипические (ZA) нуклеосомы, которые обладают отличающимся геномным распределением (Weber et al., 2010), не удивительно, что H2A.Z может выполнять разные функции.

Исследования на почкующихся дрожжах идентифицировали Chz1 в качестве шаперона, который преимущественно соединяется с H2A.Z-H2B димерами по сравнению с шапероном Nap1, который формирует мощные взаимодействия с H2A.Z-H2B и H2A-H2B димерами (Luk et al., 2007). Сегодня, два ATФ- зависимых SWI/SNF комплекса, ремоделирующих хроматин, Swr1 и INO80, были идентифицированы, которые действуют участвуют в независимой от репликации замене H2A.Z-H2B димерами димеров H2A-H2B. первый идентифицирован у почкующихся дрожжей, комплекс Swr1, как было установлено, необходим для инкорпорации H2A.Z в хроматин (Krogan et al., 2003). Внедрение Swr1 комплекса в промоторы может быть частично обусловлено bromodomain-содержащей субъединицей Bdf1 из комплекса, которая соединяется с ацетилированным гистоном H3 и хвостом H4 (Altaf et al., 2010). Шапероны Chz1 и Nap1, как полагают, доставляют H2A.Z-H2B димер в комплекс Swr1 (Luk et al., 2007). Кроме того, могут существовать некоторые более генерализованные, по всему геному opportunistic замещения, поскольку гетеротипические нуклеосомы обнаружены диспергированными по всему геному Drosophila (Weber et al., 2010). С помощью экспериментов in vitro Swr1, как было установлено, катализирует однонаправленное, постепенное замещение H2A-H2B димеров на H2A.Z-H2B димеры (Luk et al., 2010). Интересно, что предмет экспериментальных обстоятельств, the комплекс INO80, ремоделирующий хроматин, как было установлено, катализирует противоположную реакцию: замену H2A.Z-H2B димеров на H2A-H2B димеры (Papamichos-Chronakis et al., 2011).

H2A.X

Даже одиночный не репарируемый разрыв double-strand break (DSB) в ДНК может быть летальным и как результат клетки будут использовать механизмы быстрой репарации повреждений. Репарация использует включение варианта гистона H2A.X, который отличается от H2A тем, что содержит мотив на C-терминальной последовательности: SQ(E/D)(I/L/Y). Сериновый остаток внутри этого мотива является предметом быстрого фосфорилирования в ответ на обнаружение DSB, при этом фосфорилирование происходит в течение минут, продуцируя модифицированный гистон, наз. ?H2A.X, и распространяется на расстояние в 1-2 Mb от места повреждения (Rogakou et al., 1998). Ответственные киназы, это phosphoinositol 3-kinase-related kinases: ATM (ataxia telangiectasia mutated) и ATR (ataxia telangiectasia and Rad3 related) у млекопитающих. Хотя фосфорилирование H2A.X не существенно для детекции и репарации DSBs, оно облегчает сборку комплексов репарации ДНК, таких как INO80 хроматин ремоделирующий комплекс, на месте повреждения, а мыши, лишенные H2A.X , обнаруживают повышенную чувствительность к радиации (Celeste et al., 2002; Morrison et al., 2004).

Количественный анализ подтвердил, что на долю нефосфорилированного варианта H2A.X приходится ~2-25% от общего количества гистона H2A у млекопитающих, в зависимости от линии исследуемых клеток. У почкующихся дрожжей, которые лишены канонического H2A, H2A.X составляет ~90% от H2A в нуклеосомах (Baxevanis and Landsman, 1996; Rogakou et al., 1998). Потребность нем для репарации ДНК связана с пролиферативной способностью клеток, при этом репарация ДНК в окончательно детерминированных клетках прежде всего сконцентрирована на транскрибируемых регионах, чтобы избежать аномальной экспрессии генов (Nouspikel and Hanawalt, 2002). Эта пониженная способность может участвовать в регуляции доступности H2A.X, а исследования показали, что некоторые виды микроРНК усиливают свою активность во время гематопоэтической дифференцировки, чтобы репрессировать трансляцию H2A.X (Lal et al., 2009).

Не смотря на большое количество работ, сфокусировавшихся на роли γH2A.X в репарации ДНК, сравнительно мало известно о том, как H2A.X инкорпорируется в хроматин. Геномное картирование H2A.X в покоящихся T клетках показало, что этот вариант относительно редко распределяется по всему геному (Seo et al., 2012). С помощью совместной очистки H2A.X-ассоциированных белков, было установлено, что гетеродимерный комплекс FACT (facilitates chromatin transcription) катализирует независимый от репликации двунаправленный обмен H2A-H2B димеров с H2A.X-H2B димерами (Heo et al., 2008). Принимая во внимание известные роли FACT в транскрипции (Belotserkovskaya et al., 2003), остается неизвестным, существуют ли альтернативные шапероны для H2A.X, которые могли бы объяснить его распределение по всему геному. Вполне возможно, что H2A.X может включаться зависимым от репликации способом. это могло бы объяснить униформное распределение по геному.

MacroH2A

У позвоночных наблюдается дальнейшая эволюция H2A, учитывая macroH2A, который содержит в ~25 kDa C-терминальный глобулярный домен в дополнение к каноническому складчатому домену в гистоне (Costanzi and Pehrson, 1998). Исследования иммунофлюоресценции в клетках самцов мышей выявили крапчатую локализацию macroH2A, но клетки самок также были крупными, с четкими macroH2A-позитивными регионами, которые локализовались совместно с неактивной X (Xi) хромосомой (Costanzi and Pehrson, 1998). Учитывая, что множественные типы факультативного гетерохроматина присутствуют на X хромосоме, дальнейший анализ показал, что macroH2A ко-локализуется с регионами, маркированными Xist РНК и H3K27me3 (Chadwick and Willard, 2004).

В дополнение к продукции Xi, macroH2A инкорпорируется в хроматин в регуляторные регионы генов плюрипотентности после дифференцировки, где они участвуют в обеспечении молчания (Pasque et al., 2012). MacroH2A, как полагают, участвует в молчании частично за счет взаимодействия с poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1), истощение которой ведет к реактивации X-сцепленного репортерного гена (Ouararhni et al., 2006; Nusinow et al., 2007). PARP1 обычно ассоциирована с активными промоторами, где она замещает линкерный гистон H1 и катализирует перенос ADP-ribose единиц на белки мишени, включая саму себя, приводя к их высвобождению из хроматина. Глобулярный домен macroH2A ингибирует эту каталитическую активность (Ouararhni et al., 2006; Nusinow et al., 2007). В каталитически неактивном состоянии, как было установлено, экстенсивное связывание PARP1 репрессирует экспрессию генов, вообще-то посредством димеризации, подтверждая, что macroH2A может рекрутировать PARP1 на Xi хромосому и затем ингибировать каталитическую активность PARP1, чтобы сохранять высокую плотность связывания PARP1 (Wacker et al., 2007). Однако необходимом отметить, что др. исследование оказалось неспособным выявить ингибирующую функцию macroH2A в отношении активности PARP1 (Timinszky et al., 2009). Предложены альтернативные механизмы macroH2A-зависимой репрессии, при которых macroH2A д. увеличивать защиту нуклеосом ДНК от переваривания экзонуклеазами, подтверждая, что macroH2A может стабилизировать нуклеосомы и ингибировать связывание транскрипционного фактора (Angelov et al., 2003; Chakravarthy et al., 2012).

ATRX является ещё одним с macroH2A-ассоциированным белком, но в отличие от случаев с H3.3, Daxx не был идентифицирован в качестве взаимодействующего партнера (Ratnakumar et al., 2012). В эритролейкемических клетках человека потеря ATRX ведет к повышению уровней macroH2A в теломерах и α-globin локуса, подтверждая, что транслокация ATRX избирательно удаляет macroH2A или, напротив, она редуцирует уровни H3.3, обнаруживаемые в теломерах в отсутствие ATRX способствуя включению macroH2A. Имеются ли специфические шапероны гистонов, ответственные за приток macroH2A в и из хроматина, неизвестно.

The role of histone variants in pluripotency and reprogramming

Включение вариантов гистонов обеспечивается одним из возможных механизмов по созданию дифференциальных доменов хроматина (Fig. 2), посредством или комбинации измененной структуры нуклеосом или вовлечения транс-действующего фактора. Однако, специфические роли независимых от репликации гистоновых вариантов помимо простого замещения гистонов, которые теряются и всё менее ясные, особенно в отношении некоторых вариантов, существуют, по-видимому, перекрывающиеся роли с их каноническими аналогами. Напр., у Drosophila, H3.3 существенно заменяем H3 во время развития (Hodl and Basler, 2012). Сходным образом, у млекопитающих включение H3 нарушается благодаря истощению его шаперона, CAF1, при этом H3.3 может компенсировать и оказывается включенным в фокусы репликации посредством Hira (Ray-Gallet et al., 2011). Хотя H3.3 безусловно обладает ролью в поддержании плотности нуклеосом, существует, по-видимому, не только этот гистоновый вариант, который является просто заполнителем пробелов. H3.3, по-видимому, участвует в активации генов, т.к.истощение H3.3 в клетках мышей ведет к снижению индуцируемой интерфероном транскрипции (Tamura et al., 2009). Fig. 2.

Histone variants in ESCs and in germline maintenance

Чтобы подчеркнуть важность в процессах развития, было продемонстрировано, что гистоновые варианты необходимы для самообновления ESC. Недавнее исследование с использование ChIP-seq картировало H2A.Z на энхансерах и промоторах в ESCs мышей (Hu et al., 2012). После деплеции H2A.Z, авт. установили снижение доступности хроматина в этих местах, при этом снижение связывания как активирующих, так и репрессивных комплексов и снижение связывания транскрипционного фактора плюрипотентности Oct4 (также известного как Pou5f1) с его сайтами связывания в генах плюрипотентности. Истощение H2A.Z также ведет к снижению эффективности самообновления, это, скорее всего, обусловлено снижением связывания Oct4 (Fig. 3). Fig. 3.

Природа расширения доступности хроматина с H2A.Z включениями неизвестна. Возможно, что H2A.Z нуклеосомы от природы нестабильны, но данные in vitro по использованию воссозданных массивов нуклеосом дают противоречивые результаты, вообще-то как результат отличающихся последовательностей ДНК или пост-трансляционных модификаций (Bonisch and Hake, 2012). Ацетилирование H2A.Z строго коррелирует с активным хроматином и является возможным кандидатом, вызывающим расширение доступности подлежащей ДНК, т.к. нейтрализация заряда может редуцировать сродство нуклеосом к ДНК (Thambirajah et al., 2006; Bonisch and Hake, 2012). Альтернативно, присутствие H2A.Z и/или модификация могут рекрутировать транс-действующие факторы, которые модулируют доступность хроматина.

Скрининг генов, необходимых для самообновления ESC и поддержания экспрессии Oct4, идентифицировал ремодельер хроматина Chd1 (Gaspar-Maia et al., 2009). Истощение Chd1 ведет к потере открытого хроматина, несмотря на отсутствие достоверных изменений в экспрессии генов, при этом наблюдается увеличение в гетерохроматине метки H3K9me3. Хотя это исследование не показало, что H3.3 играет роль в этом процессе, Chd1, как было установлено ранее, участвует в Hira-зависимом отложении H3.3 у Drosophila (Konev et al., 2007). Сегодня нет доказательств роли Chd1 млекопитающих в отложении H3.3 , хотя вполне вероятно, что Chd1 млекопитающих способствует самообновлению ESC путем инкорпорации H3.3 в ключевые сайты, чтобы поддерживать доступность хроматина посредством усиления динамики. Это согласуется с наблюдением, что хотя Hira-нулевые ESCs способны к самообновлению, они обнаруживают ускоренную дифференцировку после удаления leukemia inhibitory factor (LIF), подтверждая, что инкорпорация H3.3 необходима для полного поддержания плюрипотентной природы ESCs (Meshorer et al., 2006). Подчеркивая роль хроматиновых ремодельеров и H3.3 в поддержании доступности подлежащей ДНК в недифференцированном состоянии для будущей активации генов, хроматиновый ремодельер Chd2, управляемый транскрипционным фактором MyoD (также известном как Myod1), как было установлено, включает H3.3 в миогенные промоторы перед дифференцировкой в миобласты мыши (Harada et al., 2012). Принимая во внимание, что существуют, по крайней мере, девять Chd белков у млекопитающих, это может означать, что разные ремодельеры хроматина работают на специфических мишенях или в онтогенетических процессах, чтобы инкорпорировать H3.3; напр., Chd7 прежде всего обнаруживается в энхансерных элементах в ESCs мышей (Marfella and Imbalzano, 2007; Schnetz et al., 2010).

H3.3, как было установлено, играет ключевую роль в гаметогенезе. Во время первой мейотической профазы, синапсы формируются между аутосомами при подготовке к рекомбинации. Однако половые хромосомы частично избегают этого процесса и являются транскрипционно молчащими. Это молчание использует замещение нуклеосом по всем хромосомам и включение H3.3 (van der Heijden et al., 2007). Неизвестно, насколько критическая инкорпорация H3.3 для этого молчания, но самцы мышей с генной ловушкой в H3.3A (H3f3a) гене, которые доживают до взрослой стадии, стерильны, подтверждая, что включение H3.3 необходимо во время сперматогенеза (Couldrey et al., 1999).

CENP-A, как было установлено, играет также роль в поддержании зародышевой линии, при этом CENP-A-содержащие нуклеосомы остаются в ассоциации с ДНК в зрелых сперматозоидах млекопитающих, несмотря на то, что по существу, все др. гистоны заменены на протамины (Palmer et al., 1990). Это указывает на возможную основу для наследования позиции центромер и успешного образования кинетохор на отцовских хромосомах, это существенно для собственно сегрегации и жизнеспособности хромосом эмбриона. Механизм, лежащий в основе удержания CENP-A-содержащих нуклеосом, неясен, но вообще-то окружение цетромерного хроматина противодействует замене на протамины или центромерные белки активно блокируют замену. На Drosophila проанализировано эпигенетическое поддержание центромер, при этом сильное истощение Cid (Drosophila cenH3) в спермиях ведет к потере отцовских хромосом во время ранних синцитиальных делений и формирования гиногенетических гаплоидных эмбрионов благодаря неспособности прикрепления к митотическому веретену (Raychaudhuri et al., 2012). Более того, умеренное истощение Cid в спермиях ведет к неспособности восстановления нормальных уровней Cid в центромерах после эмбриогенеза, подтверждая количественный эффект на репопуляцию cenH3-содержащих нуклеосом в центромерах, предопределенную количеством предсуществующих cenH3. необходимо отметить, однако, что у C. elegans и A. thaliana, cenH3, по-видимому, несущественен для формирования функциональных гамет и в случае с C. elegans, cenH3 не сохраняется в спермиях (Gassmann et al., 2012).

У млекопитающих после завершения мейоза геном спермиев и далее компактизируется в 6 раз за счет почти по всему геному замещения нуклеосом протаминами (Wouters-Tyrou et al., 1998). В момент оплодотворения материнский пул H3.3 используется для регенерации хроматина на отцовском пронуклеусе независимым от репликации способом (Loppin et al., 2005; Torres-Padilla et al., 2006; Konev et al., 2007). Хотя эта асимметрия между пронуклеусами самцов и самок может дать соблазнительное механистическое объяснение аллель-специфичной экспрессии импринтированных генов и ранней импринтируемой X-инактивации отцовской Х хромосомы мыши, необходимо отметить, что у человека ~4% генома гаплоидных спермиев содержат нуклеосомы, при этом импринтируемые гены оказываются обогащенными сохранившимися гистонами (Hammoud et al., 2009). Не смотря на потерю почти всех гистонов в конце сперматогенеза H3.3, скорее всего, играет жизненно важную роль после оплодотворения, поскольку потеря отложений H3.3 ведет к продукции гаплоидных эмбрионов Drosophila (Bonnefoy et al., 2007; Konev et al., 2007).

Эпигенетическое репрограммирование материнского и отцовского генома происходит после оплодотворения. Гистон H3.3, как было установлено, является существенным для становления гетерохроматина у эмбрионов мышей; эмбрионы, экспрессирующие мутантный H3.3 K27R, неспособны замалчивать перицентромерный гетерохроматин посредством базирующегося на RNAi механизма, при этом эквивалентный мутант H3.1 не обнаруживает фенотипических отклонений (Santenard et al., 2010). Дефект развития частично устраняется за счет микроинъекции двунитчатой РНК, соответствующей основному сателлитному повтору. Возможно, что H3.3 играет значительную роль в ранней дифференцировке эмбрионов, поскольку H3.3, как было установлено, обогащает транскрипционно молчащие бивалентные гены в ESCs (Goldberg et al., 2010). Эти бивалентные гены, маркированы H3K4me3 и H3K27me3, это коррелирует с их 'уравновешенностью' для последующей активации во время дифференцировки (Mikkelsen et al., 2007). Сходным образом, помимо потребности в H3.3 для образования гетерохроматина, H3.3 может быть также необходим для поддержания природы бивалентов из этих ключевых онтогенетических генов, или благодаря меткам H3.3K27me3 или некоему альтернативному способу маркирования хроматина. Отсутствие H3.3 на генах бивалентности д. по теории приводить к их аберрантной экспрессии во время дифференцировки. Это согласуется с ускоренной сначала, но затем ограниченной, дифференцировкой Hira-нулевых ESCs и летальностью нарушений в гене H3f3a у мышей (Couldrey et al., 1999; Meshorer et al., 2006). Это сходно с ролью, выполняемой H2A.Z в организации стадии дифференцировки, поскольку истощение H2A.Z в ESCs ведет к снижению активации онтогенетических генов после дифференцировки, где это необходимо для эффективного соединения транскрипционного фактора retinoic acid receptor alpha со своим сайтом связывания (Hu et al., 2012).

Мышиный H2A вариант H2A.B (также известный как H2A.Bbd), который преимущественно экспрессируется в семенниках и ограниченная экспрессия обнаруживается в головном мозге, также, по-видимому, участвует в становлении места действия для последующей активации генов после оплодотворения (Soboleva et al., 2012; Talbert et al., 2012). Этот вариант лишен кислого участка, обнаруживаемого в каноническом H2A, целью которого является уплотнение хроматина, и это ведет к неспособности формирования экстенсивно уплотняющихся массивов нуклеосом in vitro, сходным образом с ацетилированием нуклеосом (Soboleva et al., 2012). ChIP-seq анализ семенников мышей показал преимущественную локализацию H2A.B в точке страта транскрипции (Soboleva et al., 2012), это привело к предположению, что инкорпорация H2A.B предупреждает молчание и делает возможной быструю активацию генов после оплодотворения. Пока неясно, может ли ограниченный H2A.B, который экспрессируется в головном мозге мышей, иметь сходные распределение и функцию. Идентифицированы и др. специфичные для семенников варианты H2A, H2B и H3 (Table 1), но их функция в процессах регуляции генов неясна.

Nuclear reprogramming

Во время дифференцировки временные сигналы управляют скоординированной активацией и репрессией генов мишеней, приводя к ограничению потенциала клонов и к определенному паттерну экспрессии генов. Спустя длительное время после того, как внешние стимулы удалены, клетки сохраняют паттерны экспрессии генов в течение многих клеточных делений, сценарий обозначаемый как 'клеточная память'. Концепция репрограммирования обозначает способность производить дифференцированные типы клеток, которые детерминированы к определенным клонам и силам клеток возвращаться из созданного к плюрипотентному состоянию. Репрограммирование в основном достигается с помощью экспрессии т. наз. 'Yamanaka факторов' (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) чтобы давать iPSCs или, напротив, переносом ядра в энуклеированную яйцеклетку или ооцит. Репрограммирование поддерживает большие надежды в регенеративной медицине как источник иммуно-толерантных стволовых клеток, напр., при терапии стволовыми клетками после химиотерапии. На уровне хроматина, репрограммирование необходимо для преодоления двух узких мест: (1) активации пока молчащих генов плюрипотентной сети; (2) замалчивание пока активных тканеспецифичных генов.

Во время дифференцировки гены плюрипотентности обычно репрессируются с помощью многих путей. Напр., Oct4 репрессируется с помощью метилирования ДНК и ассоциированных с репрессией пост-трансляционных модификаций гистонов (Feldman et al., 2006). Однако внутри этого окружения репрессивного хроматина репрограммирующие факторы должны соединиться со своими соотв. сайтами мишенями, чтобы реактивировать гены плюрипотентности. Несмотря на этот барьер, очевидно, что имеется достаточное время, все клетки обладают потенциалом быть репрограммированными скорее, чем существует элитное число внутри популяции, которая содержит специальную эпигенетическую конфигурацию (Hanna et al., 2009). В соотв. с этой идеей эпигенетический барьер репрограммирования, эффективности генерации iPSC может быть снижен путем создания доступности хроматина с помощью ингибиторов гистоновых деацетилаз и метилирования ДНК (De Carvalho et al., 2010). Кроме того, ускорение скорости клеточных делений облегчает репрограммирование, вообще-то за счет ремоделирования хроматина по всему геному, которое происходит во время репликации (Hanna et al., 2009).

Гистоновые варианты, как было установлено, облегчают репрограммирование, демонстрируя ключевую роль динамики нуклеосом как в поддержании, так и изменении паттернов экспрессии генов. Недавнее сообщение о репрограммировании ядер млекопитающих, трансплантированных в ооциты Xenopus , показало, что Hira-зависимое отложение H3.3 в Oct4 необходимо для транскрипционного репрограммирования (Jullien et al., 2012). Нарушение репрограммирования в отсутствие Hira и отложений H3.3 не может быть компенсировано повышенным отложением гистонового варианта H3.2, снова подтверждая, что H3.3 выполняет более важную функцию, чем простое заполнение пробела вследствие ремоделирования нуклеосом. Механизм, с помощью которого H3.3 делает ДНК более доступной, неясен, но аналогичная ситуация наблюдается при миогенной дифференцировке, где предварительное отложение H3.3 на регуляторных последовательностях необходимо для последующей активации гена (Harada et al., 2012). Учитывая отсутствие доказательств прирожденной структурной нестабильности H3.3-содержащих нуклеосом, возможно, что специфическая пост-трансляционная модификация или ступень ремоделирования во время отложения увеличивает частоту воздействия на подлежащую ДНК репрограммирующих факторов (Thakar et al., 2009; Skene and Henikoff, 2012). Гипотетическая H3.3-специфическая пост-трансляционная модификация д. или непосредственно увеличивать динамику нуклеосом, такую как нейтрализация заряда посредством ацетилирования, снижающего сродство к ДНК, или косвенно посредством поставки транс-действующего фактора. Однако, учитывая гетерогенную природу репрограммирования, может оказаться более легким вычленение механизма, с помощью которого действует H3.3, используя более канонический путь активации генов. Интересно, напр., что H3.3 необходим для зависимой от интерферона активации транскрипции (Tamura et al., 2009). Роль H3.3 в осуществлении реактивации генов плюрипотентности вообще-то согласуется с наблюдением, что истощение Chd1, ремодельера хроматина, участвующего в отложении H3.3 у Drosophila, ведет к снижению эффективности репрограммирования (Gaspar-Maia et al., 2009). Необходимо отметить, однако, эквивалентная роль для Chd1 млекопитающих в отложении H3.3 не выявлена.

В противоположность H3.3, macroH2A, как было установлено, повышает эпигенетический барьер репрограммирования (Pasque et al., 2011a). Это исследование показало, что эффективность реактивации хромосомы Xi снижена, когда используются более дифференцированные типы клеток в качестве стартовой точки. Устойчивость к репрограммированию не коррелирует с метилированием ДНК или H3K27me3, но с присутствием macroH2A на Xi, а истощение macroH2A повышает реактивацию Xi. Более того, macroH2A, как было недавно показано, располагается на регуляторных регионах генов плюрипотентности, при этом истощение ведет к 25-кратному увеличению эффективности репрограммирования и увеличению реактивации генов плюрипотентности, подтверждая, что macroH2A может выполнять более широкую роль в репрессии в геноме (Pasque et al., 2012). Более того, 5-aza-2?-deoxycytidine (5-AzaC), который ингибирует ДНК метилтрансферазы, как было установлено, увеличивает эффективность репрограммирования, преимущественно с помощью реактивации генов плюрипотентности, которые замалчиваются с помощью метилирования ДНК (De Carvalho et al., 2010), а последующее отложение H2A.Z после воздействия 5-AzaC, как было установлено, необходимо для полной реактивации молчащих генов, это открывает возможность роли H2A.Z в репрограммировании (Yang et al., 2012). В целом реактивация сети генов плюрипотентности, по-видимому, нуждается как в включении, так и потере специфических вариантов гистонов (Fig. 4A).

Репрограммирование также нуждается в замалчивании паттернов экспрессии генов в соматических клетках. в ряде исследований было показано, что iPSCs сохраняют транскрипционную память соматических клеток, из которых они произошли, при этом различия между ESCs и iPSCs общи всем клонам, используемым в качестве стартовой точки репрограммирования, и клон-специфическим различиям (Chin et al., 2009; Ghosh et al., 2010; Polo et al., 2010; Ohi et al., 2011). Существует некоторое противоречие, поскольку степень этих различий, которые могут частично отражать экспериментальные вариации, такие как количество пассажей, дающих iPSCs (Chin et al., 2010; Guenther et al., 2010; Bock et al., 2011). Такая транскрипционная память может объяснить недостатки iPSCs, в частности, их ограниченную способность к дифференцировке, и предпочтение к дифференцировке в ткань происхождения, могут происходить из того факта, что эти персистирующие гены обычно участвуют в регуляции транскрипции и развития органа (Chin et al., 2009; Polo et al., 2010). Источник этой эпигенетической памяти недостаточно охарактеризован, но эксперименты по ядерному переносу у Xenopus показали, что избыточная экспрессия H3.3 повышает память экспрессии MyoD, которая сохраняется около 12 эмбриональных делений, несмотря на отсутствие транскрипции во время этого периода времени (Ng and Gurdon, 2008). Было предположено, что необычно высокое содержание H3.3 в яйцеклетках обеспечивает транскрипционную память (Pasque et al., 2011b). Вообще-то уровни H3.3 определяют баланс между репрограммированием, которое нуждается в H3.3 для реактивации генов плюрипотентности, и памятью паттерна экспрессии соматических клеток, которая д. появляться, когда H3.3 в избытке (Fig. 4B).

Histone variants in human disease

Как и ожидалось для белков с разными функциями, неспособность к отложению гистоновых вариантов связана с определенными болезнями (Table 2). Ниже мы предоставим несколько примеров связи между гистоновыми вариантами и их шаперонами и болезнями человека. Table 2.

Summary of links between histone variants and associated factors with human disease states

Центромеры являются эволюционно стабильными, но неоцентромеры могут формировать эктопические сайты. Большинство описанных неоцентромер у человека спасают ацентричные фрагменты хромосом, которые возникают в результате хромосомных перестроек и ведут к формированию 'маркерных' хромосом, которые лишены нативных центромер. Сегментная триплоидия, вызываемая маркерными хромосомами ведет к ряду болезненных фенотипов, включая лицевые дизморфии и задержку развития (Burrack and Berman, 2012). Кроме того, неоцентромеры были обнаружены в ряде раковых опухолей, некоторые из которых также обнаруживали повышенную экспрессию CENP-A, что может облегчать анеуплоидию и геномную нестабильность (Tomonaga et al., 2003). Это согласуется с тем, что CENP-A шаперон HJURP усиливает свою активность в раках груди одновременно с CENP-A, и это коррелирует с плохим прогнозом (Hu et al., 2010).

ATRX первоначально был идентифицирован как ген, мутантный при β-thalassemia, X-сцепленном синдроме умственной отсталости, и теперь он идентифицирован как компонент ДНК translocase пути отложения ATRX-Daxx-H3.3. Недавнее исследование сообщило, что ATRX соединяется с CpG островками, которые часто обнаруживаются в промоторных регионах, включая промотор для ?-globin (Law et al., 2010). Авт. продолжают предполагать, что неспособность включения H3.3 в промотор ?-globin может вызывать β-thalassemia. Путь отложения ATRX-Daxx-H3.3 также влияет на онкогенез, при этом 43% pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs) имеют мутацию или в ATRX или DAXX (Jiao et al., 2011). Эти наблюдения могут быть объяснены сохранением теломер, которые необходимы для прогрессирования рака, и чтобы предупредить старение. Хотя реактивация теломеразы является наиболее распространенным механизмом, используемым раковыми опухолями, независимый от теломераз механизм, наз. alternative telomere lengthening (ALT) доказан в 4% раков (Heaphy et al., 2011). ALT, как полагают, поддерживает теломеры с помощью гомологичной рекомбинации. Большинство ALT раковых клеточных линий обладает мутациями в ATRX или истощающими ATRX на белковом уровне (Lovejoy et al., 2012). Сегодня неясно, как отсутствие ATRX-зависимого отложения H3.3 на теломерах вносит вклад в инициацию ALT. Однако, принимая во внимание увеличение DNase I чувствительности, наблюдаемой при дефектах включения H3.3 и что линии ALT обнаруживают повышенную геномную нестабильность, вполне возможно, что неспособность замещать нуклеосомы на теломерах ведет к разрывам ДНК, запускающим гомологичную рекомбинацию и инициирующим путь ALT (Ray-Gallet et al., 2011; Lovejoy et al., 2012). Кроме того, специфические мутации в H3.3 (K27M и G34R/V) были найдены в большой фракции детских глиобластом, при которых мутации в ATRX и DAXX также часто обнаруживаются (Schwartzentruber et al., 2012; Wu et al., 2012).

Уровни macroH2A снижены при злокачественных меланомах, а восстановление уровней экспрессии ведут к снижению метастазирования, подтверждая, что macroH2A действует, репрессируя гены, критические для развития злокачественной меланомы (Kapoor et al., 2010). Экспрессия macroH2A также снижена при более быстро пролиферирующих раках лёгких, тогда как он повышен в клетках, подвергающихся старению, и коррелирует с улучшенным исходом (Sporn et al., 2009). Глубокое понимание роли macroH2A в прогрессировании раковых опухолей может предоставить диагностический инструмент для разработки терапевтических стратегий. Работа на Arabidopsis продемонстрировала взаимный антагонизм между метилированием ДНК и присутствием H2A.Z, при этом такой же паттерн наблюдался в нормальных клетках млекопитающих и во время туморогенеза (Zilberman et al., 2008; Conerly et al., 2010). Хотя механизм лежащий в основе этой взаимозависимости неясен, потеря H2A.Z на генах опухолевых супрессоров д. вести к метилированию ДНК и наследуемой репрессии, в соответствии с наблюдением, что отложения H2A.Z необходимы для полной реактивации молчащих генов после обработки 5-AzaC (Yang et al., 2012).

Сегодня относительно мало известно о том, как гистоновые варианты могут менять топологическое состояние хроматина и играет ли это роль в возникновении болезней. Недавнее исследование измеряло топологическое состояние воссозданного массива нуклеосом с каноническим H3 или H3.3 (White et al., 2012). Авт. наблюдали достоверное предпочтение к негативным сверхспиралям (underwound ДНК) при H3.3 по сравнению с каноническим H3. Принимая во внимание, что в нейронах H3.3 прогрессивно накапливается, достигая ~90% от содержания H3 (Pina and Suau, 1987), изучение болезненных состояний базирующихся на хроматине д. прояснить роль топологии ДНК. Напр., Rett синдром нейрологическое нарушение в результате мутаций в MeCP2, белке, которые также накапливается близко к нуклеосомным уровням в нейронах (Skene et al., 2010). Сегодня неизвестно, функционирует ли MeCP2, чтобы регулировать топологические изменения, обусловленные присутствием почти во всем геноме H3.3-содержащих нуклеосом.

Conclusions

We have described mechanisms by which histone variants can be incorporated into the chromatin landscape, in particular how the replication-independent nature of their deposition differs from that of the canonical histones, the expression and incorporation of which are strictly coupled to S phase. This replication-independent deposition has potential for both the maintenance of chromatin integrity following nucleosomal eviction and the generation of additional epigenetic complexity through the specialized functions of histone variants. It is becoming increasingly clear that these histone variants play a greater role than simply buffering nucleosomal density, perhaps through intrinsic structural differences and/or the recruitment of trans-acting factors (Jin et al., 2009; Bonisch and Hake, 2012), with these variants involved in controlling chromatin metabolism for the maintenance of both the pluripotent and differentiated states. Future work will need to better understand the dynamic nature of nucleosomes and how this is used to regulate the accessibility of the underlying ДНК. Techniques such as CATCH-IT (covalent attachment of tags to capture histones and identify turnover) and SNAP tagging (which utilizes a small self-labeling enzyme that can be fluorescently pulse labeled in vivo) will allow the kinetics of chromatin metabolism to be visualized and avoid problems associated with looking simply at steady-state levels (Deal et al., 2010; Ray-Gallet et al., 2011).

A hallmark of pluripotent cells is the rapid turnover of the chromatin, with histone variants playing a vital role in this process. Understanding how reprogramming can re-achieve this highly dynamic state has great potential in generating stem cells for therapeutic strategies or cell lines derived from patients for research on specific diseases. Kinetic experiments will aid in the understanding of the factors involved in histone variant turnover, both at the level of targeting and incorporation, which will be vital for effective reprogramming strategies. Consistent with their pivotal role in the regulation of chromatin, a number of diseases have recently been associated with failure in the incorporation of histone variants. Future challenges lie with the characterization of factors involved in the turnover of these variants and how they can be exploited as therapeutic targets in the treatment of diseases such as pediatric gliomas, which are associated with mutations in H3.3. Overall, an improved understanding of the role of histone variants and an ability to increase or decrease their deposition are likely to aid in the treatment of diseases and the therapeutic application of reprogramming.

Histone variants in pluripotency and disease Peter J. Skene and Steven Henikoff Development 2013 Vol.140, 2513-2524.

Histone variants in pluripotency and disease
Peter J. Skene and Steven Henikoff
Development 2013 Vol.140, 2513-2524.