Потеря слуха крупная эпидемиологическая проблема во всем мире, которая касается сотен миллионов людей, снижая качество их жизни. Существуют две основные формы потери слуха: кондуктивная и нейросенсорная. Sensorineural hearing loss (SNHL) всегда связана с повреждениями сенсорных волосковых клеток во внутреннем ухе. SNHL варьирует от лёгкой до выраженной, это делает возможным успех кохлеарных имплантов, которые функционируют благодаря оставшимся слуховым нейронам. Несмотря на массивные улучшения, кохлеарные импланты неспособны полностью восстановить нормальный слух (Roehm and Hansen, 2005; Chang and Fu, 2006; Bent et al., 2009; Gifford and Revit, 2010; Peterson et al., 2010; Renton et al., 2010; Colletti et al., 2011). Полное восстановление слуха возможно лишь при регенерации поврежденного органа Корти (Puligilla and Kelley, 2009).

Орган Корти состоит из волосковых клеток, поддерживающих клеток и нейронов, все они необходимы для правильного формирования и поддержания слуха. У пациентов с кратковременной потерей слуха, возможно, что только волосковые клетки нуждаются в замене; однако у пациентов с долговременной потерей слуха может быть потерян весь орган Корти (Izumikawa et al., 2008). Независимо от этого, необходима терапия способности восстанавливать критические стадии развития Кортиева органа in vivo, манипулируя с нативными стволовыми клетками и клетками, подобными стволовым, или индуцируя постмитотические клетки внутреннего уха в направлении каждой из индивидуальных клеточных судеб (Kopecky et al., 2011). Чтобы достичь этого, необходимо выяснить более критически молекулярную сеть эмбрионального развития, которая первоначально формирует Кортиев орган. Многие ранние ступени развития, которые определяют слуховые плакоды, спецификацию оси внутреннего уха, формирование паттерна Кортиева органа и даже популяции нейросенсорных предшественников, всё ещё плохо поняты.

Размер инициальной популяции предшественников Кортиева органа неизвестен; однако конечным продуктом развития являются около 15000 волосковых клеток у человека, разделенных в три ряда наружных волосковых клеток и один ряд внутренних волосковых клеток, окруженных несколькими типами поддерживающих клеток. Эта организация униформна вдоль нескольких миллиметров Кортиева органа, который делает два полных оборота от основания к верхушке, формируя карту распределения звуковых частот вдоль его длины. Стереотипичный паттерн Кортиева органа у всех млекопитающих указывает, что развитие осуществляется под тонким генетическим контролем, а не является стохастическим процессом. Кстати, многочисленные исследования выявили, что этот процесс развития нуждается в диффундирующих факторах, чтобы определить границы Кортиева органа (Morsli et al., 1998; Pirvola et al., 2000; Pauley et al., 2003; Pan et al., 2011; Groves and Fekete, 2012) и набор транскрипционных факторов, которые, во-первых, детерминируют пролиферацию популяций предшественников, во-вторых, дифференцируют субпопуляции пула предшественников в волосковые клетки, в-третьих, формируют межклеточные взаимодействия, чтобы стабилизировать судьбы волосковых клеток и поддерживающих клеток и, наконец, обеспечить долговременную поддержку жизнеспособности этого ломкого и сложного Кортиева органа (Fritzsch et al., 2011). Каждая из этих ступеней взаимосвязана со ступенями, в результате чего у модельных мышей мутации вышестоящих генов продуцируют куммулятивные эффекты нижестоящих аномалий. Поэтому наиболее важной ступенью не только для собственно развития внутреннего уха, но и также для регенерации его волосковых клеток, является очень сложная модуляция пролиферации развития уха.

Пролиферация это акт проведения клеток через чрезвычайно обширно и тонко регулируемый клеточный цикл. Он регулируется посредством множественных КПП (checkpoints) клеточного цикла и посредством как генетического, так и эпигенетического механизмов. Предприняты попытки манипуляций в Кортиевом органе многих видов с помощью или экзогенных митогенов, таких как EGFs и FGFs (Zheng et al., 1997; Montcouquiol and Corwin, 2001; Witte et al., 2001) или непосредственной регуляции клеточного цикла (Chen et al., 2003; Mantela et al., 2005; Sage et al., 2006; Oesterle et al., 2011). Разные исследования оказались способны вызывать продолжительную пролиферацию клеток эмбриональных предшественников или вызывать повторно позднюю пролиферацию или поддерживающих клеток или, в редких случаях, волосковых клеток (Liu et al., 2012). Ни один из методов неспособен сообразно достичь долговременного успеха, т.к. распространенным исходом было, что волосковые клетки, сформированные после манипуляций с пролиферацией, погибали (Chen et al., 2003; Mantela et al., 2005; Sage et al., 2006; Weber et al., 2008; Oesterle et al., 2011). Др. манипуляции оказались просто неэффективными после определенной ст. развития (White et al., 2006). Вообще-то узел, интегрирующий многие из этих вышестоящих сигналов (т.e., EGFs и FGFs), который заставлят действовать совместно как важный контроль клеточного цикла (т.e., Cyclins, pRB, и E2Fs) может смягчать эти побочные эффекты и д. вызывать позднюю индукцию пролиферации клеток Кортиева органа. В самом деле, Myc узел находится выше многих генов, регулирующих клеточный цикл, и возможно сможет предоставить информацию о недостаточно изученном балансе между пролиферацией и дифференцировкой во время развития (Conacci-Sorrell and Eisenman, 2011; Young et al., 2011). В отличие от др. проанализированных протоонкогенов или регуляторных генов клеточного цикла (Pauley et al., 2006; Laine et al., 2007; Rocha-Sanchez et al., 2011), Myc's являются bHLH транскрипционными факторами, которые специфически соединяются с E-boxes, которые являются частью промоторов генов мишеней. Три транскрипционных bHLH фактора, Neurogenin1, Neurod1 и Atoh1, являются важными для дифференцировки нейронов и волосковых клеток уха (Fritzsch et al., 2010) и эти класса II bHLH гены соединяются с почти идентичным классом E-boxes как и Mycs. Более того, непосредственно ниже стоящие по отношению к Myc, являются Inhibitors of DNA binding (Ids), которые, как известно, непосредственно ингибируют транскрипционные факторы класса II bHLH (Fritzsch et al., 2006; Jones et al., 2006) посредством взаимодействий с E-белками, необходимыми для связывания E-box класса II bHLH факторов (Bhattacharya and Baker, 2011). Кроме того, два гена, Eya1 и Six1, оказываются достаточными для формирования нервных и волосковых клеток в дополнение к экспрессии bHLH (Ahmed et al., 2012a, 2012) и также могут регулировать экспрессию Myc. Т.о., Mycs, по-видимому, является ключевым узлом, который обеспечивает баланс между пролиферацией и дифференцировкой и поэтому манипуляции с Mycs могут не только влиять на уровень пролиферации в ухе, но и также на начало дифференцировки.

Ранее мы исследовали эффект N-Myc во внутреннем ухе, используя Pax2-Cre, чтобы вызывать кондиционные делеции N-Myc (Kopecky et al., 2011). Параллельное исследование (Dominguez-Frutos et al., 2011) подтвердило, что N-Myc мутанты обнаруживают сильное уменьшение в размере, аномальный морфогенез, включая укорочение улитки со многими рядами волосковых клеток, слиянием utricle, saccule, и основания улитки и потерю горизонтального канала (Kopecky et al., 2011). N-Myc и L-Myc в основном экспрессируются совместно и обнаруживаются со стадии (E) 8.5 эмбриогенеза (Dominguez-Frutos et al., 2011). N-Myc и L-Myc в последствии ограничиваются просенсорной, а затем экспрессируются исключительно в сенсорном эпителии (Dominguez-Frutos et al., 2011; Kopecky et al., 2011). Несмотря на аберрантную морфологию Pax2-Cre N-Myc мыши с кондиционным нокаутом (CKO) формируют волосковые клетки как улитки, так и вестибулярные волосковые клетки; однако, кохлеарные волосковые клетки прогрессивно теряются, начиная приблизительно с постнатального дня (P) 14, тогда как вестибулярные волосковые клетки сохраняются вплоть до 9 мес. возраста (Kopecky et al., 2011). Эти мыши были глухи и страдали от частично скомпенсированной атаксической походки (Kopecky et al., 2012a). Стало очевидным, что N-Myc и L-Myc, но не C-Myc строго экспрессируются во внутреннем ухе и что их совместная экспрессия может иметь потенциальную перекрывающуюся функцию во время развития. Более того, экспрессия и N-Myc и L-Myc в волосковых клетках после рождения связана с поздней потерей кохлеарных волосковых клеток, подтверждая существование поздно начинающегося эффекта N-Myc и L-Myc на долговременное поддержание волосковых клеток; наблюдение, которое оказало достоверное влияние (Kopecky et al., 2011). Поэтому мы тестировали эту гипотезу с помощью knocking out N-Myc и L-Myc в волосковых клетках, используя ранее описанные Atoh1-Cre (Matei et al., 2005) и Pax2-Cre (Ohyama and Groves, 2004). Atoh1 активация была более продолжительной, чем у Pax2. Atoh1 специфически экспрессируется в дифференцированных волосковых клетках, тогда как Pax2 экспрессируется в просенсорном регионе отической плакоды начиная с E8.5. Задержанная делеция N-Myc и L-Myc в волосковых клетках с использованием Atoh1-Cre должна была протестировать, происходит ли потеря волосковых клеток, наблюдаемая у Pax2-Cre N-Myc CKO мышей в результате эффекта позднего начала Mycs особенно в волосковых клетках. Однако, поздняя экспрессия N-Myc и L-Myc в волосковых клетках не играла непосредственной роли в долговременной жизнеспособности волосковых клеток, т.к. не наблюдалось потери кохлеарных волосковых клеток при задержанных делециях (Kopecky et al., 2012c). Отсутствует также дополнительная потеря кохлеарных волосковых клеток при Atoh1-Cre N-Myc L-Myc к мышей с двойной кондиционной делецией, даже при использовании ототоксических средств (Kopecky et al., 2012c). Это подтверждает, что жизнеспособность кохлеарных волосковых клеток, возможно, обусловлена балансом между пролиферацией и дифференцировкой, который закладывается с помощью очень ранней экспрессии N-Myc и L-Myc во время развития. Мы проверяли эту гипотезу с помощью knocking out N-Myc и/или L-Myc с Pax2-Cre и затем оценивали важные маркеры, как пролиферации, так и дифференцировки в течение всего времени формирования волосковых клеток.

В данной работе мы учитывали относительную компенсаторную способность N-Myc и L-Myc во время развития при кондиционных нокаутах N-Myc и/или L-Myc, используя Pax2-Cre, общую потерю пролиферации у Pax2-Cre N-Myc L-Myc двойных (d) CKO мышей и то, как потеря N-Myc и L-Myc влияет на баланс между пролиферацией и дифференцировкой. Наши данные показали, что функция L-Myc может быть компенсирована за счет N-Myc, но L-Myc не может компенсировать функцию N-Myc. Однако, Pax2-Cre N-Myc L-Myc dCKO мыши имели более тяжелый кохлеарный фенотип, чем это описывалось ранее для Pax2-Cre N-Myc одиночных CKO мышей и не было выживших, это ограничивало постнатальные исследования долговременной жизнеспособности волосковых клеток.

DISCUSSION

N-Myc Can Partially Compensate for the Loss of L-Myc Whereas L-Myc Cannot Compensate for N-Myc Loss

И N-Myc и L-Myc экспрессируются совместно строго во внутреннем ухе, начиная с E8.5 (Dominguez-Frutos et al., 2011; Kopecky et al., 2011). Домены экспрессии N-Myc и L-Myc в основном перекрываются, подтверждая, что существует возможно перекрывание между этими двумя экспрессирующимся Myc генами в ухе. Путем скрещивания Pax2-Cre N-Myc ^f/+ L-Myc ^f/+ с N-Myc ^f/f L-Myc ^f/f, получены 4 уникальных фенотипа, контрольный, нокаутный полностью по L-Myc, нокаутный полностью по N-Myc и нокаутный по обоим. При оценке L-Myc нокаутов отсутствовали очевидные морфологические аномалии, т.к. эти мыши развались почти точно также как и контрольные, даже если были N-Myc гетерозиготными (Fig. 1). Однако в отсутствие L-Myc в Pax2-экспрессирующих регионах на P0, внутренне ухо, почки и мозжечок имели слегка уменьшенные размеры. Более того, функциональные исследования L-Myc CKO мышей на ст. P21 обнаружили легкое уменьшение слуховой и вестибулярной функции (Fig. 5). Напротив, N-Myc CKO мыши имели тяжелые морфологические аномалии в ходе всего развития и редуцированные размеры и обнаруживали полную потерю слуха. Поскольку эти аномалии ухудшались в отсутствие N-Myc и L-Myc, то очевидно, что потеря только L-Myc имеет лишь минимальный эффект на общее развитие и функционирование, тогда как потеря N-Myc сильно изменяет формирование внутреннего уха. Т.о., N-Myc, по-видимому, играет значительно более распространенную роль в развитии внутреннего уха, тогда как L-Myc, по-видимому, играет только вспомогательную функцию, которая может быть в основном перекрыта экспрессией N-Myc. Неонатальная гибель dCKO шей указывает, что определенные критические аспекты развития не перекрываются, подтверждая ограниченную, но существенную функцию L-Myc, которую предстоит определить, поскольку она маскируется с помощью N-Myc когда этот ген экспрессируется нормально.

Proper Timing and Expression Levels of bHLH Transcription Factors Necessary for Differentiation Are Dependent on Proliferation

Роль Mycs во всем теле и их интерактивные каскады, регулирующие пролиферацию, древние (Young et al., 2011) и хорошо изучены (Conacci-Sorrell and Eisenman, 2011). Однако Mycs минимально исследованы во внутреннем ухе. Важно, что наши данные подтвердили, что изменения пролиферации посредством Mycs ведут к нарушениям клеточной дифференцировки. В отсутствие N-Myc и L-Myc, пролиферация сильно снижается и нижестоящие Id2 и CyclinD1 также снижаются. В противоположность первоначальным ожиданиям, что это подавление Id2 может приводить к растормаживанию класса II bHLH транскрипционных факторов (Fritzsch et al., 2006), этот эффект оказался под угрозой из-за подавления экспрессии Neurod1 и Atoh1. Neurod1 экспрессируется начиная с E9.5 в отическом пузырьке, но ограничивается вестибуло-кохлеарным ганглием на ст. E10.5 и становится важной для дифференцировки нейронов и взаимодействует с Atoh1, необходимым для формирования волосковых клеток (Jahan et al., 2010). Уровни Neurod1 никогда не достигают контрольных уровней у dCKO мышей. Atoh1, который необходим для дифференцировки волосковых клеток и формирует петлю обратной связи с Neurog1 (Bermingham et al., 1999; Matei et al., 2005; Raft et al., 2007; Kirjavainen et al., 2008; Pan et al., 2011), подавляется вплоть до ст. E13.5 у dCKO мышей, после чего Atoh1 слегка возрастает, но всё ещё остается ниже контрольных уровней. Это временное подавление активности Atoh1 совпадает с пониженными уровнями нижестоящих генов поддержания волосковых клеток Pou4f3 и Barhl1. Pou4f3 (Xiang et al., 2003; Clough et al., 2004; Chellappa et al., 2008; Masuda et al., 2012) и Barhl1 (Chellappa et al., 2008) , как известно, играют роль в долговременном поддержании волосковых клеток (Pauley et al., 2008). Ранее было показано, что уровень и время Atoh1 (Jahan et al., 2010; Pan et al., 2012) и экспрессия Pou4f3 и Barhl1 все они необходимы для собственно образования и поддержания волосковых клеток. Промоторный регион Pou4f3только частично охарактеризован, но известно, что он содержит многие сайты связывания, включая некоторые E-boxes (Masuda et al., 2011). Поскольку мы не можем сказать с определенностью, происходит ли прогрессивная потеря волосковых клеток после инициального их образования в результате задержки активации Atoh1 или последующей редукции Pou4f3 и Barhl1, но очевидно, что при изменении N-Myc и L-Myc, молекулярные пути инициации и поддержания дифференцировки нарушены, демонстрируя, что в ухе, пролиферация и дифференцировка взаимосвязаны, минимум посредством Myc узла, возможно путем ограничения уровней экспрессии Pou4f3 и Barhl1, критических генов для долговременного поддержания волосковых клеток. Гибель кохлеарных волосковых клеток должна также в принципе разрушать эндокохлеарный потенциал (Cable et al., 1993; Tran, 2002) приводя к неспособности образования ductus reuniens. Вполне возможно, что это приведет к изменению эндокохлеарного потенциала, чтобы почти сравняться с вестибулярным endopotential, придающий силу потере волосковых клеток.

N-Myc and L-Myc Regulate the Development of the Inner Ear Through a Partially Understood Molecular Network

В отсутствие N-Myc и L-Myc, количество аномалий как конечный продукт развития внутреннего уха, два из которых это снижение пролиферации и прогрессивная потеря волосковых клеток; эти аномалии, скорее всего, связаны со взаимодействием между пролиферацией и дифференцировкой. Однако значительно более сложная картина возникает, когда рассматриваются остальные морфологические и нейросенсорные аномалии, ассоциированные с dCKO мышами. Кроме того, долговременная жизнеспособность, уменьшение высоко частотного конца базальной "hook" области улитки и трансформация верхушки в необычную организацию с волосковыми клетками смешанного вестибулярного и кохлеарного фенотипа указывают, что Myc bHLH транскрипционные факторы, скорее всего, затрагивают не только пролиферацию, но и играют роль в процессе выбора клетками судьбы, возможно путем взаимодействия с передачей сигналов Atoh1, гена, как известно, непосредственно влияющего на тип клеточной дифференцировки при взаимодействии с Neurod1 (Jahan et al., 2010).

Альтернативно, укороченное развитие может приводить к изменению взаимодействия пролиферирующих и постмитотических клеток, это приводит к наблюдаемым изменениям в базальной и апикальной частях Кортиева органа. Для выбора возможных механизмов, с помощью которых возникают некоторые из этих аномалий, мы оценивали некоторые гены кандидаты. Fgf8 экспрессируется в проспективной отической плакоде на ст. E8 и в вентральной части отической плакоды на ст. E9 и является важным для индукции отической плакоды, т.к. его потеря дает аномальную морфологию отических плакод (Ladher et al., 2005; Hertzano et al., 2010). Его более поздняя экспрессия во внутренних волосковых клетках (Jacques et al., 2007; Jahan et al., 2010, 2012). Fgf8 постепенно подавляется у dCKO, как показывают данные qRT-PCR (Table 1), а также полученные ранее с помощью гибридизации in situ у Pax2-Cre N-Myc ^f/f мышей (Kopecky et al., 2011). Др. ген, Pax2, экспрессируется со ст. E8.5 в отической плакоде и в медиальных сенсорных и не сенсорных компонентах улитки при рождении. Pax2 первоначально предопределяет пре-отическое поле и индуцируется с помощью передачи сигналов Fgf и зависит от Shh (Riccomagno et al., 2005; Bouchard et al., 2010). Мыши dCKO обнаруживают сильно сниженные уровни Pax2. Др. ген, рано экспрессирующийся в отической плакоде, это Gata3 в его отсутствие отоцист остается кистозным (Karis et al., 2001; Duncan et al., 2011). В отсутствие N-Myc и L-Myc, Gata3 подавляется. Др. ген, Sox2 экспрессируется в вентральной нейральной области на ст. E9.5 и позднее в волосковых клетках и поддерживает клетки улитки (Dabdoub et al., 2008; Nichols et al., 2008). Sox2 мутанты не формируют определенный просенсорный домен и обнаруживают дезорганизацию волосковых клеток. Sox2 ингибирует экспрессию Atoh1, но способствует экспрессии Prox1 (Kiernan et al., 2005; Dabdoub et al., 2008; Mak et al., 2009). В отсутствие N-Myc и L-Myc, Sox2 также подавляется, указывая на изменения в детерминации судеб сенсорного эпителия. Эти данные подтверждают, что просенсорная спецификация изменяется как прямое следствие отсутствия транскрипционных факторов Myc. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить взаимодействие Mycs с промоторными регионами этих разных факторов, чтобы понять основы того, как наблюдаемые молекулярные изменения сказываются на наблюдаемых морфологических изменениях. Кроме того, т.к. это, по-видимому, является клеточно-автономным эффектом, то для уверенности необходимо использовать индуцибельные специфичные для уха Cre линии или как минимум повсеместно экспрессирующиеся Cre, чтобы протестировать, как время делеции Myc влияет на экспрессию этих генов. Пока такие линии отсутствуют.

Mycs Are Necessary for the Formation of Therian Novelties in the Cochlea

Сравнительные данные показывают, что среди тетрапод только сумчатые и млекопитающие обладают высоко частотным слухом выше 10 kHz в hook регионе (Muller et al., 2005) и обнаруживают потерю lagena на апикальном кончике кохлеарного протока, вместо того, чтобы обнаруживать свернутую в спираль улитку (Webster et al., 1992; Fritzsch et al., 2011; Duncan and Fritzsch, 2012). Наши данные подтверждают, что Myc-обеспечиваемая пролиферация и регуляция судеб полосковых клеток может играть роль в этом эволюционном процессе. Ясно, что преждевременное окончание пролиферации у dCKO мышей ведет к полной потере базальной hook области, высоко частотной части карты, уникальной для therian Кортиева органа. Сходным образом, обнаруживаются, подобные вестибулярным, трансформации апикального кончика укороченного канала улитки, в виде многочисленных волосковых клеток, сидящих на верхушке periotic мезенхимы, характерной для вестибулярной, вместо periotic пространства, которое являются важным признаком Кортиева органа. Интересно, что диссоциация, scala tympani ведет к похожему на вестибулярный базальный виток у Lmx1a мутантов (Nichols et al., 2008), подобно тому, который, по-видимому, появляется в верхушке dCKO мышей. Необходимы данные, чтобы установить эволюционное использование Mycs в растущей улитке, которая, скорее всего, возникает у родоначальника сумчатых и млекопитающих (therian) после их отщепления от однопроходных животных, которые лишены восприятия высоких частот (Fay, 1988) и сохраняют родоначальную lagenar macula на кончике своего канала улитки (Fritzsch, 1987; Jorgensen and Locket, 1995).

Conclusions

N-Myc and L-Myc are mostly co-expressed in the inner ear. The early conditional embryonic loss of both genes using Pax2-Cre results in a severely disrupted ear representing a more profound phenotype compared to the loss of N-Myc alone. The combined losses of both N-Myc and L-Myc not only reduces proliferation and growth of the ear but also leads to subsequent alteration of differentiation, most notably through the reduction and delay of Atoh1 and downstream hair cell maintenance factors Pou4f3 and Barhl1. Morphologic changes are most striking in the base and the apex of the developing cochlea. Importantly, the loss of L-Myc alone has minimal effect on inner ear development suggesting a greater importance of N-Myc in mammalian inner ear development. The current study in conjunction with previously published studies detailing N-Myc and L-Myc in the inner ear illustrates the importance of proliferation control to proper neurosensory differentiation early in development. Any attempt to form hair cells, regardless of precursor source, may ultimately need to account for the interaction of proliferation genes such as the Mycs with differentiation genes such as Atoh1 and possibly other upstream genes such as Eya1 and Six1. Increased efforts should be made to more fully elucidate the molecular networks balancing these two interdependent processes for a therapeutically safe application in organ of Corti reconstitution.

Correct Timing of Proliferation and Differentiation is Necessary for Normal Inner Ear Development and Auditory Hair Cell Viability Benjamin J. Kopecky, Israt Jahan, Bernd Fritzsch Developmental Dynamics Volume 242, Issue 2, pages 132–147, February 2013

Correct Timing of Proliferation and Differentiation is Necessary for Normal Inner Ear Development and Auditory Hair Cell Viability
Benjamin J. Kopecky, Israt Jahan, Bernd Fritzsch
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 2, pages 132–147, February 2013