Zic (zinc finger of the cerebellum) гены представляют собой семейство транскрипционных факторов, обнаруживаемых как у позвоночных, так и беспозвоночных (reviewed in Ali et al., 2012), которые родственны Drosophila Zic гомологу, odd-paired (opa) (Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980; Benedyk et al., 1994). Среди видов пз, человек и мышь имеют пять Zic genes (Zic1-5); др. виды имеют больше (рыбки данио, 8 Zic генов; лягушки, 6 Zic генов) ил меньше (куры, 4 Zic генов) Zic генов. Структурно, ZIC белки характеризуются регионом цинковые пальчики, который содержит 5 тандемных доменов C2H2 цинковых пальчиков (Aruga, 2004; Merzdorf, 2007; Ali et al.,2012). Аминокислотная последовательность цинкового пальчика 2 - 5 почти идентична среди Zic1-5 для данного вида, тогда как последовательность вне этого региона может быть довольно изменчивой (Aruga, 2004; Grinberg and Millen, 2005).

Zic гены участвуют во многих процессах развития. Функция Zic генов была изучена преимущественно во время нейрального развития, где их роли связаны с контролем формирования нейрального паттерна , генерацией нервного гребня, развитием мозжечка и образованием нервной трубки (Aruga, 2004; Merzdorf,2007). Однако, Zic гены также участвуют в миогенезе сомитов (Pan et al., 2011), лево-правосторонней асимметрии (Herman and El-Hodiri, 2002) и развитии сетчатки. Точная роль Zic генов in vivo до конца неизвестна. In vitro, ZIC2 ингибирует передачу сигналов WNT/β-catenin путем непосредственного взаимодействия с TCF4 (Pourebrahim et al., 2011), и ZIC белки взаимодействуют с GLI транскрипционными факторами, чтобы или супрессировать или усиливать GLI-обусловленную трансактивацию (Koyabu et al., 2001; Mizugishi et al., 2001; Pan et al., 2011). У Xenopus, Zic как активируют, так и ингибируют передачу сигналов WNT/β-catenin (Merzdorf and Sive, 2006; Pourebrahim et al., 2011; Fujimi et al., 2012), а у рыбок данио Zic гены регулируют экспрессию shh и nodal и модулируют Hedgehog-обусловленную экспрессию генов (Maurus and Harris, 2009; Sanek et al., 2009).

Принимая во внимание важность экспрессии Zic генов в нервной трубке, а также способность Zic генов модулировать передачу сигналов WNT и SHH, ключевых путей, участвующих в формировании дорсо-вентрального паттерна внутреннего уха (Riccomagno et al.,2002, 2005), неожиданно привлекла мало внимания экспрессия и функция Zicгенов в и около развивающегося внутреннего уха. Одно из ранних исследований установило, что Zic2 является одним из первых генов, активируемых при регенерации сенсорного эпителия внутреннего уха кур после воздействия шумами (Gong et al., 1996). Имеются противоречивые данные относительно локализации экспрессии Zic генов во время развития внутреннего уха (Warner et al., 2003; McMahon and Merzdorf, 2010). Хотя некоторые паттерны экспрессии Zic были описаны у мышей (reviewed in Merzdorf, 2007; Ali et al., 2012), кстати, экспрессия Zic в развивающемся внутреннем ухе мышей не была исследована. Мы предприняли обширный сравнительный пространственно-временной анализ экспрессии Zic мРНК в отических регионах эмбрионов кур и мышей на ранних ст. развития внутреннего уха.

DISCUSSION

Distinct Spatiotemporal Expression of Zic Genes During Inner Ear Development in the Chick and Mouse

Проведен тщательный анализ экспрессии Zic генов в развивающемся внутреннем ухе кур и мышей. Zic гены мышей (Zic1-5) и кур (Zic1-4), как было установлено, экспрессируются в виде сходных паттернов во время развития внутреннего уха, в дорсальной части нервной трубки и во всей мезенхиме, соседствующей с развивающимся внутренним ухом, но не в отическом эпителии. Каждый ген Zic обнаруживает уникальный паттерн экспрессии на каждой изученной стадии развития, но часто обнаруживаются локальные перекрывания экспрессии многих Zic генов. Время экспрессии также отличается, так экспрессия Zic1-5 у мышей и Zic1-3 у кур выявляется в самые ранние временные точки, проанализированные в этом исследовании (E9.5 у мышей, HH ст 13 у кур), но слабая экспрессия куриного Zic4 не обнаруживалась вплоть до HH ст. 18, при этом наблюдалась наиболее сильная экспрессия на HH ст. 24. На ст. E9.5, экспрессия Zic1 и Zic2 у мышей наблюдалась как в дорсальной части нервной трубки, так и в мезенхиме, окружающей отический эпителий, в то время как мезенхимная экспрессия Zic3-5 у мышей и Zic1-3 у кур обнаруживалась только после начала экспрессии в нейроэпителии. Различия в пространственно-временной экспрессии Zic генов указывает на то, что каждый Zic ген может играть отличающуюся роль во время развития внутреннего уха. Zic2, который экспрессируется в мезенхиме, окружающей весь отический эпителий у мышей и у кур, может быть важными для общего роста и формообразования всего развивающегося внутреннего уха. Др. Zic гены, которые экспрессируются в разных регионах периотической мезенхимы, могут быть ответственны за рост и морфологические изменения, ассоциированные со специфическими структурами внутреннего уха.

Identity and Possible Roles of Zic-Positive Cells in Critical Tissues During Inner Ear Development

Neural crest

Наш анализ идентифицировал Zic-позитивные клетки вне нервной трубки, по соседству с отическим эпителием. Мы рассмотрели возможность, что эти клетки мигрирующие клетки краниального нервного гребня. Однако несколько линий доказательств говорят против этого. Предыдущая работа на эмбрионах кур показала, что Zic1-позитивные клетки в туловище вне нервной трубки оказывались не меченными с помощью HNK-1, маркера мигрирующих клеток нервного гребня (Sun Rhodes and Merzdorf, 2006). Кроме того, время, локализация и экспрессия маркера нервного гребня в этих клетках не коррелировали с миграцией клеток краниального нервного гребня. У мышей клетки краниального нервного гребня формируются и начинают мигрировать на ст. 5 сомитов (Chan and Tam, 1988) и заканчивают миграцию на ст. 14 сомитов (Serbedzija et al., 1992), тогда как у эмбрионов кур клетки нервного гребня мигрируют со ст. HH 9+ до HH ст. 11 (Tosney, 1982). Клетки Zic+ были обнаружены в мезенхиме у значительно более зрелых эмбрионов: ст. 22-24 сомитов (E9.5) и у более старых мышей и на ст.HH 18 и старше у эмбрионов кур. Во-вторых, исследования с мечением DiI у эмбрионов кур и отслеживание клонов у эмбрионов мышей показали, что клетки нервного гребня из ромбомера 5 мигрируют рострально и каудально вокруг отоциста и достигают второй и третьей бранхиальных дуг, тогда как клетки из ромбомера 6 мигрируют каудально вокруг отоциста прежде чем достигнуть третьей бранхиальной дуги (Sechrist et al., 1993; Trainor et al., 2002). Срезы, в которых были обнаружены Zic+ клетки в мезенхиме находились посредине пути через отоцист в регион, куда клетки нервного гребня не мигрируют. Наконец, мы использовали экспрессию Sox10 в качестве маркера мигрирующих клеток нервного гребня у мышей (Bronner, 2012). Sox10 экспрессия не обнаруживалась вне отического эпителия в срезах, через медиальную часть отоциста на ст. E10.5, но обнаруживалась в срезах на более передних или более задних уровнях отоциста. Zic1-4+ клетки на ст. E10.5 обнаруживались вне нервной трубки на срезах через медиальные части отоциста, подтверждая, что эти Zic-экспрессирующие клетки не происходят из нервного гребня.

Periotic mesenchyme

Мы исследовали экспрессию Brn4 и Tbx1, маркеров конденсирующейся мезенхимы и периотической мезенхимы, в регионах, где мы обнаружили Zic-экспрессирующие клетки. Регион экспрессии Tbx1 перекрывается с регионами экспрессии Zic1 и Zic2, но регион экспрессии Brn4 лишь слегка перекрывается с регионами экспрессии Zic1 и Zic2. Это указывает на то, что большинство Zic1+ и Zic2+ клеток в вентральной части мезенхимы являются Tbx1+ периотическими мезенхимными клетками и немногие из этих клеток являются Brn4+ клетками конденсирующейся мезенхимы. Экспрессия Tbx1 и Brn4 регулируется с помощью передачи сигналов SHH (Riccomagno et al., 2002), а Zic гены регулируют передачу сигналов SHH in vitro (Koyabu et al., 2001; Mizugishi et al., 2001; Pan et al., 2011), так что экспрессия Zic генов в тех же самых регионах, где экспрессируются Tbx1 и Brn4, может означать, что Zic гены участвуют в SHH-зависимой экспрессии Tbx1 и Brn4. Альтернативно экспрессия Tbx1 и Brn4 может быть независимой от экспрессии Zic, указывая тем самым на др. роль Zic генов. Zic гены, подобно Tbx1 и Brn4, могут быть необходимы для собственно передачи сигналов между эпителием и мезенхимой. Потеря или Brn4 (Brn4-/-) или Brn4 и одиночного аллеля Tbx1 (Brn4-/-;Tbx1+/-) в периотической мезенхиме у мышей приводит к неправильному закручиванию ушной улитки (Braunstein et al., 2008). Потеря одного или нескольких Zic генов в периотической мезенхиме д. приводить к сходным дефектам в структурах внутреннего уха, при этом затрагиваемые специфические структуры будут зависеть от того, какой ген Zic потерян.

Мы также проверяли экспрессию Axin2 в мезенхиме. Наиболее дорсальная экспрессия Axin2 перекрывается с экспрессией Zic1-4, тогда как вентральная экспрессия перекрывается с экспрессией Zic1 и Zic2. Экспрессия Axin2 индуцируется с помощью передачи сигналов WNT, действуя как часть негативной петли обратной связи для ограничения степени и продолжительности передачи сигналов WNT (Jho et al., 2002). Передача сигналов WNT из дорсальной части заднего мозга и передача сигналов SHH от хорды и вентральной пластинки нервной трубки формирует паттерн отоциста вдоль дорсо-вентральной оси и являются критическими для развития дорсальных (WNT) и вентральных (SHH) структур внутреннего уха (Riccomagno et al., 2002, 2005). In vitro, ZIC2 соединение с TCF4 ингибирует передачу сигналов WNT (Pourebrahim et al., 2011), так что комбинация экспрессии Axin2 и экспрессии Zic может избирательно модулировать передачу сигналов WNT из дорсальной части заднего мозга в отоцист, а также ограничивать вентральные WNT сигналы вблизи источника SHH. Необходимы дополнительные эксперименты, чтобы определить, насколько хорошо эксперименты по совместному мечению определяют, являются ли Zic+ мезенхимные клетки Axin2⁺/Tbx1⁺/Brn4⁺/Sox10^-, как ожидалось.

Neural tube

У эмбрионов кур и мышей все Zic гены (куриные Zic1-4, мышиные Zic1-5) экспрессируются в дорсальной части нервной трубки. Внутреннее ухо располагается по соседству в нервной трубкой и изменения в спецификации и формировании паттерна нервной трубки, как известно, затрагивают развитие внутреннего уха. Передача сигналов из заднего мозга, особенно из ромбомеров 5 и 6, является критической для собственно формирования паттерна и развития внутреннего уха, а также для развития кохлеовестибуляного ганглия, который иннервирует ухо (Bok et al., 2005, 2007; Kil et al., 2005; Choo, 2007; Vazquez-Echeverria et al., 2008; Liang et al., 2010). Дефекты закрытия нервной трубки, включая экзэнцефалию, в или вблизи заднего мозга, наблюдаются у Zic мутантных мышей, включая Zic2^kd/kd (Nagai et al., 2000), Zic3^Bn (Klootwijk et al., 2000) и Zic5^-/- (Inoue et al., 2004) мутантных мышей. У мутантов Zic2^Ku/Ku ромбомеры 3 и 5 меньше, чем в норме и выявляется эктопическая экспрессия follistatin в этих ромбомерах (Elms et al., 2003). В дополнение к эффектам на развитие заднего мозга, мутации в генах Zic затрагивают передачу сигналов от заднего мозга ко внутреннему уху. Экспрессия Wnt3a, сигнальной молекулы из заднего мозга важна для развития внутреннего уха (Riccomagno et al., 2005), она задерживается в дорсальной части заднего мозга Zic2^kd/kd (Nagai et al., 2000) и Zic5^-/-(Inoue et al., 2004) мутантных мышей. Zic гены экспрессируются в нервной трубке и могут влиять на развитие внутреннего уха многими способами, прямо или косвенно. ZIC белки могут непосредственно взаимодействовать с компонентами WNT или BMP путей в нервной трубке, чтобы модулировать передачу сигналов WNT или BMP в развивающееся внутреннее ухо или ZIC белки могут способствовать и ингибировать экспрессию др. факторов в дорсальной части нервной трубки. Косвенно, потеря специфических Zic генов в нервной трубке ведет к дефектам нервной трубки (таким как экзэнцефалия), которые могут изменять позицию нервной трубки по отношению ко внутреннему уху. Это изменение в позиции нервной трубки относительно развивающегося внутреннего уха д. нарушать положение специфических регионов отического эпителия относительно источников передачи сигналов BMP, WNT и SHH, что в принципе д. приводить к порокам развития внутреннего уха.

Investigating the Function of Zic Genes During Inner Ear Development

Участие Zic генов в развитии внутреннего уха было исследовано только на уровне генной экспрессии (данное исследование; Warner et al., 2003). Дальнейшие функциональные исследования необходимы, чтобы изучить роль Zic генов во время развития внутреннего уха. Получены мыши с мутациями в каждом из генов Zic (Ali et al., 2012), не обнаруживали фенотипических отклонений в ухе. Одной из причин этого может быть то, что множественные тяжелые дефекты у постнатальных животных маскируют любые ушные фенотипы. И Zic1 и Zic5 гомозиготные мутанты обнаруживают аномальную походку и позы, характерные для дефектов в вестибулярном регионе внутреннего уха, но эти аномалии были объяснены дефектами мозжечка (Zic1^-/-) или гидроцефалии (Zic5^-/-) (Aruga et al., 1998; Inoue et al., 2004). Однако, большинство мутантов Zic5 не имело каких-либо заметных изменений в морфологии головного мозга, так что случаи аномальной походки и поз не были полностью изучены (Inoue et al., 2004). Др. причина отсутствия фенотипических отклонений во внутреннем ухе может быть связана с тем, что большинство мутантов погибает или во время эмбриональных стадий (все Zic2^Ku/Ku, ~24% Zic3^Bn) или вскоре после рождения (50% Zic1^-/-, все Zic2^kd/kd, некоторые Zic5^-/-) (Aruga et al.,1998; Klootwijk et al., 2000; Nagai et al., 2000; Elms et al., 2003; Inoue et al., 2004), что делает невозможным обнаружение признаков дефектов внутреннего уха, которые нарушают зрелую функцию этого сенсорного органа, такие изменения как походка и поза, аномальное поведение, такое как кружение и изменения в акустической старт-реакции (ABR) (Saul et al., 2008). Исследования с использованием этих мышей, включая записи ABRs у животных, включая гетерозигот, которые доживают до постнатальных стадий, как это делалось у др. мутантов мышей (Bank et al.,2012), сможет предоставить информацию о том, как индивидуальные Zic гены функционируют во время развития внутреннего уха. Далее, генерация компаундных Zic мутантов необходимо для решения вопросов о перекрываемости между генами Zic во время развития внутреннего уха, так мы показали, что Zic гены экспрессируются в перекрывающихся регионах переотической мезенхимы у кур и мышей.

Attempts to Reconcile the Disparate Results of Earlier Zic Gene Expression Studies

Поскольку результаты, полученные McMahon и Merzdorf (McMahon and Merzdorf,2010) были совершенно отличными от тех, что были описаны нами ранее (Warner et al., 2003), особенно в отношении экспрессии Zic1, мы повторили и расширили исследования генов Zic в развивающемся внутреннем ухе кур. Четвертый Zic ген, Zic4, был идентифицирован у эмбрионов кур (McMahon and Merzdorf, 2010) и паттерн его экспрессии также был исследован. Кроме того, мы хотели сравнить экспрессию Zic генов в отическом регионе кур с паттерном экспрессии Zic генов в отическом регионе мышей, который ранее не был описан. К нашему удивлению паттерн экспрессии Zic1 в развивающемся внутреннем ухе кур, описанный здесь, не согласовался с нашим более ранним исследованием; однако, паттерны экспрессии Zic2 и Zic3, описанные здесь согласовались с нашими более ранними исследованиями (Warner et al.,2003). Наши находки по паттернам экспрессии Zic1-4 в нервной трубке развивающихся кур в данном исследовании согласовались с нашим более ранним исследованием экспрессии Zic1-4 у развивающихся эмбрионов кур после ст. HH 18 (McMahon and Merzdorf, 2010). Однако мы обнаружили экспрессию Zic1 и Zic2 в периотической мезенхиме на ст. HH 18, тогда как McMahon and Merzdorf наблюдали экспрессию только Zic2 в периотической мезенхиме (McMahon and Merzdorf, 2010). Объяснить это можно тем, что на ст. HH 18, мы определяли экспрессию в периотической мезенхиме в срезах, проведенных через всё ухо, что позволило нам исследовать паттерн экспрессии в местах, которые не были различимы на целых животных в исследовании McMahon and Merzdorf (2010). Это поставило перед нами вопрос о различиях в экспрессии Zic1 в развивающемся внутреннем ухе кур, наблюдаемом в данном исследовании в противовес нашему более раннему исследованию (Warner et al., 2003). Все пробы (данного и предыдущего исследований; Warner et al., 2003) исследованы, чтобы подтвердить их идентичность. В данном исследовании пробы были разработаны, чтобы находить последовательности вне региона цинковые пальчики, где имелась низкая гомология между генами Zic (Fig. 3). Как куриные Zic2, так и Zic3 пробы были использованы в данном исследовании по поиску сходных регионов как Zic2, так и Zic3 проб из нашего предыдущего исследования (Warner et al., 2003). Zic2 зонды каждый находил разные части 3' нетранслируемой области (UTR) мРНК. Сходным образом, Zic3 зонды находили перекрывающийся регион 3' UTR, с зондом, используемым в данном исследовании, расширяясь также в часть 3' кодирующего региона мРНК и далее в 3' UTR. Zic1 зонд, использованный в нашем более раннем исследовании был нацелен на регион цинкового пальчика Zic1, и это, скорее всего, вызвало отличие от раннего исследования. Зонд, использованный в данном исследовании нацелен на 3' UTR в Zic1 и не включает регион цинкового пальчика.

Мы полагаем, что это более детальное и тщательное исследование разрешает различия между этими двумя более ранним исследованиями, подтверждая находки в лаб. Merzdorf по отсутствию экспрессии Zic1 в развивающемся внутреннем ухе эмбрионов кур, подтверждая паттерны экспрессии, найденные нами в развивающемся внутреннем ухе кур для Zic2 и Zic3, и расширяя исследование экспрессии генов Zic кур на развивающийся отический регион и нервную трубку, характеризуя паттерн экспрессии Zic4. Мы также расширили исследование экспрессии в отической, периотической ткани и нервной трубке Zic генов у мышей, предваряя такую экспрессию у Zic мутантных эмбрионов и животных.

Spatiotemporal expression of zic genes during vertebrate inner ear development Andrew P. Chervenak, Ibrahim S. Hakim, Kate F. Barald . Developmental Dynamics 242:897-908, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

Spatiotemporal expression of zic genes during vertebrate inner ear development
Andrew P. Chervenak, Ibrahim S. Hakim, Kate F. Barald
. Developmental Dynamics 242:897-908, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.