Развитие черепно-лицевого скелета базируется на сложных паттернах генной экспрессии и на функциональном давлении ряда критически важных органов. Скоординированное развитие множественных тканей является критическим в черепно-лицевом развитии, так что нарушение регуляции развития одной ткани может влиять на развитие др. Сюда входят взаимодействия между относительно независимыми онтогенетическими модулями, такими как глаз или головной мозг и черепно-лицевой скелет (Kish et al., 2011; Richtsmeier and Flaherty, 2013), а также более непосредственные взаимодействия, необходимые для базового морфогенеза (напр., эпителиально-мезенхимные). Напр., минерализация кости во время эндохондральной и внутримембранозной оссификации тесно связана с разветвлением и ростом кровеносных сосудов (ангиогенезом) (Marks and Odgren, 2002), делая вариации в ангиогенезе в качестве возможной основы для вариаций остеогенеза. Сюда входят эволюционные вариации, такие как уменьшение размера лицевой кости во время эволюции человека. Кроме того, нарушение регуляции ангиогенеза может вносить вклад в важные для медицины условия, включая постнатальные результаты сосудистых нарушений (Dietrich and Antoniades, 2012) и постнатально индуцированные черепно-лицевые дисморфии, такие как гипоплазия средины лица и краниосиностозы (Percival, 2013). Однако, чтобы определить эффект изменчивости ангиогенеза на черепно-лицевой скелетный фенотип, необходимо идентифицировать лежащие основе механизмы такой ассоциации.

По сравнению с эрндохондральной оссификацией длинных костей, внутримембранозная оссификация плохо изучена (Abzhanov et al., 2007; Karaplis, 2008), включая механизмы, которые лежат в основе известных пространственно-временных ассоциаций между ангиогенезом и внутримембранозным остеогенезом. Отсутствие фундаментальной информации об онтогенетических взаимодействиях между кровеносными сосудами и минерализацией внутримембранозных костей вносит вклад в наше неадекватное понимание формирования черепа. Из-за относительно небольшого количества исследований, концентрирующихся на ангиогенезе и внутримембранозных костях, информация, полученная в исследованиях эндохондральных костей, и distraction остеогенез составляют основу для выдвижения простых гипотез о роли, которую ангиогенез играет во время внутримембранозного образования кости.

Внутримембранозные кости, которые включают многие черепно-лицевые кости и ключицу, оссификация непосредственно из преостеогенных конденсаций мультипотентных мезенхимных клеток, тогда как прехондрогенные конденсации дифференцируются в хрящевую модель прежде наступления эндохондральной оссификации. Существенное расхождение в паттернах генной экспрессии внутри преостеогенных и прехондальных конденсатов (Eames and Helms, 2004), включая экспрессию Wnt (Karaplis, 2008), связано с различиями в судьбах мезенхимных клеток. Во время оссификации внутримембранозных конденсатов и эндохондральных хрящей, отмечаются метаболические и морфогенетические различия между этими двумя способами остеогенеза (Hall, 2005), но сходные паттерны экспрессии генов, ассоциированных с клеточной дифференцировкой, указывают на строгий параллелизм в регуляции образования костей (Eames and Helms, 2004). Используя то, что известно о эндохондральном остеогенезе для разработки модели внутримембранозного остеогенеза логично, но эти модели необходимо протестировать.

Этот обзор сконцентрирован на взаимоотношении между ангиогенезом и остеогенезом в надежде разработать простую гипотезу о роли, которую ангиогенез играет во время внутримембранозного образования кости. Во-первых, рассмотрены ассоциация сосудистой сети с костными мезенхимными конденсатами и процесс внутримембранозной оссификации. Во-вторых, обсуждаются потенциальные регуляторные основы ангиогенеза во время внутримембранозного остеогенеза. В-третьих, суммируются причины, почему сосудистая сеть является критической для внутримембранозного остеогенеза. Наконец, предлагается модель ассоциации между ангиогенезом и внутримембранозным остеогенезом.

VASCULATURE AND MESENCHYMAL CONDENSATIONS

Внутримембранозные кости и хрящевые зачатки, которые минерализуются во время эндохондральной оссификации, происходят из конденсатов мультипотентных мезенхимных клеток. Мезенхимные предшественники черепно-лицевого комплекса возникают или как клетки цефалического нервного гребня из нейроэктодермы или как клетки из параксиальной мезодермы (Fig. 1) (Jiang et al., 2002; Noden and Trainor, 2005; McBratney-Owen et al., 2008; Yoshida et al., 2008). Независимо от клеточного происхождения, кости основания черепа и каудальной части свода оссифицируются эндохондрально, тогда как кос лица и ростральной части свода черепа оссифицируются внутримембранозно (Fig. 1) (Depew et al., 2002).

Происходящая из мезодермы сосудистая сеть обнаруживается внутри популяций из рыхлых мезенхимных клеток, включая рыхло упакованную мезенхиму, происходящую из клеток нервного гребня (Yoshida et al., 2008). Однако, прехондрогенные и преостеогенные мезенхимные конденсаты, формируемые из этих популяций, не располагают какой-либо васкулатурой с момента их инициальной конденсации и вплоть до оссификации (Eames et al., 2003). Стержневой регион, который включает образование мезенхимных конденсатов и тонкий слой окружающей рыхлой мезенхимы становится безсосудистым у эмбрионов кур (Drushel et al., 1985; Feinberg et al., 1986) и в зачатках конечностей мышей (Eshkar-Oren et al., 2009). Лишенные сосудов конденсаты конечностей дифференцируются в хрящ, тогда как окружающий снабженный сосудами регион дифференцируется в мышц и др. ткани. Отсутствие сосудов может быть необходимо для агрегации мезенхимных клеток в плотные гомогенные конденсаты (Yin and Pacifici, 2001) или чтобы предоставить позиционные сигналы для дифференцировки хондроцитов (Caplan et al., 1983; Drushel et al., 1985) путем уменьшения факторов, присутствующих вблизи сосудов (Yin and Pacifici, 2001) или увеличения гипоксии (Eshkar-Oren et al., 2009). После дифференцировки прехондрогенных конденсатов в хрящевые модели, возникающий в результате хрящ остается без сосудов благодаря экспрессии анти-ангиогенных факторов, которые препятствуют инвазии сосудов, хотя они могут содержать сосудистые каналы (Kuettner et al., 1983).

Места образования внутримембранозной кости оказываются также ассоциированными с безсосудистыми зонами, но они недостаточно изучены. Безсосудистая зона окружает мезенхимные конденсаты склер у эмбрионов кур при их инициальном образовании (Jourdeuil and Franz-Odendaal, 2012), мезенхимные конденсаты фронтальной кости кур перед оссификацией (Thompson et al., 1989), мандибулярные конденсаты кур (Eames and Helms, 2004), и мандибулярные конденсаты крыс перед оссификацией (Zernik et al., 1990). Мезенхимные конденсаты фронтальных костей эмбрионов кур окружены тонким безсосудистым слоем рыхлой мезенхимы (Thompson et al., 1989), сходных с теми, что наблюдаются в конденсатах зачатков конечностей. Даже в тех немногих исследованиях упоминаются ассоциации сосудистой сети с преостеогенными мезенхимными конденсатами, очень вероятно, что безсосудистые регионы окружают преостеогенные конденсаты у птиц и млекопитающих. Однако, даже в случае прехондрогенных конденсатов механизмы, лежащие в основе становления безсосудистой зоны, остаются неясными (Eshkar-Oren et al., 2009). Принимая доказательства зон, лишенных сосудов, окружающих безсосудистые преостеогенные конденсаты, мы предполагаем, что отсутствие сосудов необходимо для роста конденсата и последующей внутримембранозной оссификации, как и в случае дифференцировки и оссификации прехондрогенных конденсатов. Неизвестно, ведут ли те же самые молекулярные сигналы к отсутствию сосудов в преостеогенных и прехондрогенных конденсатах.

INTRAMEMBRANOUS OSTEOGENESIS

Большинство информации касательно внутримембранозного остеогенеза получено в исследованиях, сконцентрировавшихся на лобной и теменных костях, чьи мезенхимные конденсаты инициируются на надбровных дугах. Инициальная оссификация этих конденсатов осуществляется, когда презумптивные костные клетки быстро пролиферируют и мигрируют в направлении от конденсатов. Исследования с использованием DiI окрашивания предоставляют доказательства, что костные примордиальные клетки, происходят из конденсатов скорее, чем рекрутируются из др. мезенхимных популяций, окружающих головной мозг (Yoshida et al., 2008; Ting et al., 2009). Исследования с окрашиванием на osteopontin (Iseki et al., 1997), экспрессию ALP (Ting et al., 2009) и экспрессию BSP (Rice et al., 2000) в целом подтвердили паттерн презумптивных костных клеток, разрастающихся в направлении от мезенхимных конденсатов, особенно в направлении верхушки головы. Во время более ранних дней эмбриогенеза остеогенез костей свода и в нормальных регуляторных условиях, эти разрастания конденсатов определяются первичным регионом дифференцировки остеобластов и остеогенеза, а также ранней формой развивающейся кости.

После периода быстрой экспансии конденсации и инициальной минерализации, рост костей свода в направлении др. др. управляется с помощью пролиферации и дифференцировки преостеогенных мезенхимных клеток в виде остеогенного фронта вдоль фиброзных швов (Iseki et al., 1997; Liu et al., 1999; Rice et al., 2003), тогда как более рано оссифицированные части утолщаются и формируют трабекулярную структуру (Yoshida et al., 2008). Дифференцированные остеобласты сначала образуют костные остроконечные шипы (spicules), которые развиваются и в конечном итоге сливаются вместе, чтобы сформировать трабекулы, которые оказываются взаимно соединенными, чтобы сформировать перепончатую ретикулофиброзную кость (Kanczler and Oreffo, 2008). Как впервые было описано 100 лет назад (e.g., Thoma, 1913; Murray, 1985) и подтверждено изображениями из недавних исследований (Fig. 2), первоначально ретикулофирозная кость в плоской внутримембранозной кости может быть описана как костная сетка или сеть, заполняемая по ходу оссификации. Figure 2.

В отличие от эндохондральной оссификации, где инициальная минерализация происходит внутри хрящевой модели, имеющей грубую форму взрослой кости (Caplan et al., 1983; Colnot et al., 2004), инициальная стадия внутримембранозного остеогенеза это минерализация коллагенового каркаса, продуцируемого дифференцирующимися остеобластами внутри быстро увеличивающейся популяции мезенхимных клеток. Лишь после стадии завершения экспансии мезенхимных клеток, в точках, где оссификация в самом ходу в некоторых частях кости, начинается рост костей свода, напоминая более традиционное описание радиального роста из центра (Lana-Elola et al., 2007; Yoshida et al., 2008).

Внутримембранозная оссификация костей, не образующих свод, (напр., кости лицевого скелета) описана дольно слабо. Напр., инициальная оссификация зубной пластинки у крыс описывается как дуга, окружающая Меккелев хрящ (Zernik et al., 1990). Неизвестно, играет ли хрящ регуляторную роль в оссификации внутримембранозной зубной пластинки или служит в качестве морфологической матрицы. Распространяются ли клетки из инициального мандибулярного мезенхимного конденсата наружу, когда начинается оссификация как в случае конденсатов костей свода, неизвестно.

ANGIOGENESIS AND INTRAMEMBRANOUS OSSIFICATION

Критическая роль ангиогенеза во время эндохондральной оссификации длинных костей хорошо известна и её важность во время внутримембранозной оссификации в целом принимается. Мы использовали исследования для выяснения роли ангиогенеза во время эндохондрального остеогенеза и distraction остеогенеза для подтверждения имеющейся информации о роли ангиогенеза во время внутримембранозной оссификации. Поскольку intusucceptive ангиогенез (Levin et al., 2007) может давать сосуды, ассоциированные с разивтием черепно-лицевых костей (De Spiegelaere et al.,2010), недавнее гистологическое исследование подтвердило идею, что врастающий (sprouting) ангиогенез, процесс, базирующийся на вытягивании разрастающихся сосудов прочь от уже существующих сосудов, является преимущественной формой ангиогенеза, ассоциированного с остеогенезом (Maes et al., 2010).

Черепно-лицевые кости, как известно, хорошо снабжены сосудами (Brookes and Revell, 1998), но лишь одно исследование остеогенеза на лобной кости кур выявило ассоциацию ангиогенеза с внутримембранозным остеогенезом костей свода черепа (Thompson et al., 1989). Согласно этому исследованию, во время периода развития непосредственно перед инициальной оссификацией лобной кости, мелкокалиберные капилляры движутся в тонкий безсосудистый слой рыхлой мезенхимы, окружающей мезенхимные конденсаты. Эти мелкие сосуды затем проникают в конденсат в месте или вблизи сайта инициальной оссификации в надбровных дугах. Спустя короткое время, самая ранняя минерализованная кость оказывается ассоциированной с обширной внутренней и внешней васкуляризацией, в то время как каскад инвазии сосудов и оссификации продолжается по фронту экспансии кости, перемещаясь во всех направлениях. Внутри самой ранней оссифицированно йи зрелой кости лба кур, слой остеобластов соседствует с крупнокалиберными капиллярами (Thompson et al., 1989).

Это описание подтверждает сходство паттерна инвазии сосудов в мезенхимные конденсаты свода и в хрящевую модель длинных костей во время инициальной оссификации. Во время эндохондральной оссификации длинных костей сосудистая сеть проникает в безсосудистый буферный слой клеток рыхлой мезенхимы, окружающей средину диафизов хрящевой модели непосредственно перед инициацией ангиогенеза и минерализации костных хомутков (collar) внутри надхрящницы (Mackie et al., 2008; Takimoto et al., 2009; Nakamura et al., 2010). Эта инвазия сосудов в надхрящницу необходима для дифференцировки остеобластов внутри неё, её превращения в надкостницу и для последующей сосудистой инвазии в середину диафизов хрящевой модели за счет эндотелиальных врастаний, происходящих из надхрящницы (Zelzer et al., 2002; Colnot et al., 2004; Takimoto et al., 2009). Хондрокласты обнаруживаются уже сидящими на кончиках внедряющихся капилляров во время остеогенеза (Fig. 3B), это позволяет эндотелиальным клеткам прокладывать свои пути через гипертрофический хрящ (Lewinson and Silbermann, 1992; Streeten and Brandi, 1990). Кроме того, врастания капилляров дают эндотелиальные клетки, обнаруживаемые в тесной близи с преостеобластами во время первой стадии эндохондрального остеогенеза (Maes et al., 2010). После оссификации в середине диафизов, онтогенетический каскад гипертрофии хондроцитов, сосудистой инвазии, формирования остеоида и кальцификации перемещается в направлении концов кости (Caplan et al., 1983). После образования пластинок эпифизного роста, каскад сохраняется постнатально в качестве основы для увеличения длины длинных костей, процесс, который прекрасно описан (Fig. 3A) (Bloom and Fawcett, 1994; Kronenberg, 2003; Mackie et al., 2008; Amizuka et al., 2012). Хотя существует сходство инвазии сосудов в окружающую, безсосудистую, рыхлую мезенхиму и ассоциации проникающих сосудов с минерализацией между остеогенезом свода (calvarial) и длинных костей, фундаментальные различия в остеогенезе эндохондральных и внутримембранозных костей указывают на потенциальные различия в роли ангиогенеза во время формирования костей двух типов. Эти наблюдения позволили нам предложить самостоятельную модель внутримембранозной оссификации. Figure 3.

DISTRACTION OSTEOGENESIS

Хотя фундаментально отличающийся от инициального остеогенеза, обычно увеличивающий мезенхимные конденсаты, distraction остеогенез (остеогенез при растяжении фрагментов кости), для которого внутримембранозная оссификация является преимущественным способом оссификации (Aronson et al., 1990; Delloye et al., 1990), предоставляет др. точку отсчета (reference point) для нашей модели внутримембранозного остеогенеза. Во время дистракционного остеогенеза после инициального разделения, формируется костная мозоль из ригидной соединительной ткани в ответ на воспаление ткани. Центральная фиброзная промежуточная зона продуцирует фибробласты, хондроцито-подобные клетки и клетки промежуточной морфологии формируются, когда растягивающие силы прилагаются к мозоли (Fig. 4) (Choi et al., 2002; Al-Aql et al., 2008). Появляются сосудистые врастания на обеих сторонах фиброзной промежуточной зоны, внутри которой остеобласты начинаю откладывать остеоид вдоль коллагеновых пучков, формируя зону микроколон (microcolumn) (особенности линейной кости). Между образованием зоны microcolumn и фиброзной промежуточной зоны находится зона пролиферирующих клеток, наз. фронтом первичной минерализации, который также покрывается врастающей сосудистой сетью (Fig. 4). Формируются сосудистые синусы за счет сосудистых врастаний в местах, из которых начинается образование кости (Choi et al., 2002). После прекращения растягивания, микростолбы остеодидов и кости растут в направлении др. др. , заполняя фиброзную промежуточную зону. Ремоделирование области кости является последней ступенью в этом процессе. Figure 4.

Во время дистракционного остеогенеза обнаруживается достоверное увеличение кровоснабжения и скорости кровотока в месте образования кости. Сосуды униформного диаметра распространяются от поверхности сечения кости в направлении др. др. вдоль коллагеновых волокон, но не вступают в фиброзную промежуточную зону (Aronson et al., 1990; Delloye et al., 1990; Aronson, 1994; Choi et al., 2000). Как раз впереди фронта минерализации в фиброзной промежуточной зоне параллельные капилляры, которые устанавливают тесные временные и пространственные взаимоотношения с местами новой минерализации в дистракционной щели. После прекращения растягивания эти сосуды выстраиваются вдоль коллагеновых волокон и растут в направлении др. др. и встречаются непосредственно перед тем, как щель будет полностью заполнена остеогенной тканью (Choi et al., 2002). У крыс, подвергшихся дистракционному остеогенезу, воздействие ангиогенным ингибитором ведет к неспособности объединения разделенных костей, отсутствию как оссифицированной кости, так и кровеносных сосудов между исходными частями после разреза кости, и к снижению экспрессии ряда генов, включая те, что ассоциированы с остеогенезом. Дополнительные эксперименты, в которых не было механического растяжения, приводили к тому, что фиброзная ткань была лишена признаков васкулатуры между разделенными фрагментами кости (Fang et al., 2005). Это указывает на то, что добавление натяжения, ведет к экспрессии ангиогенных факторов и к последующей сосудистой инвазии в направлении фиброзной промежуточной зоны и необходимо для внутримембранозной оссификации во время дистракционного остеогенеза.

Др. исследования показали, что натяжение поперек швов между растущими внутримембранозными костями ведет к активации определенных генных продуктов, включая ангиогенный и остеогенный fibroblast growth factor 2 (FGF-2), ведущий к добавлению кости по краю шва костей свода черепа (Yu et al., 2001; Opperman and Rawlins, 2005). Это означает, что дистракционный остеогенез может служить хорошей моделью внутримембранозной оссификации, происходящей на швах, и что ингибирование ангиогенеза может снижать скорость оссификации.

Хотя это и не обсуждается в деталях, но имеются сходные ассоциации между кровеносными сосудами и формированием костей во время заживления усталостных переломов костей (Wohl et al.,2009), ещё одна модель не эндохондрального образования кости (Tomlinson et al., 2013). Изучение заживления усталостных переломов хотя и более сходное с ремоделированием кости, чем с формированием кости, предоставлет ещё одну ценную модель, где ангиогенез необходим для активности остеобластов.

Во время дистракционного остеогенеза, ангиогенез необходим для оссификации и непосредственно предшествует во времени и в пространстве появлению дифференцированных остеобластов и минерализованной кости, т.к. это происходит в эпифизных ростовых пластинках эндохондральных длинных костей. Это совпадение показывает, что ангиогенез, скорее всего, предшествует и необходим для остеогенеза внутримембранозных костей. Однако инициация внутримембранозной оссификации в развивающей голове и организме и внутримембранозная оссификация при дистракционном остеогенезе могут быть фундаментально отличными процессами.

REGULATION OF INTRAMEMBRANOUS ANGIOGENESIS

Поскольку гипоксия хондроцитов является основой для экспрессии генов, ассоциированных с ангиогенезом эндохондральной хрящевой модели и поскольку гипоксия способствует ангиогенезу во многих др. контекстах, то разумно предположить, что гипоксия безсосудистых мезенхимных конденсатов является главной регуляторной основой ангиогенеза, ассоциированного с внутримембранозным остеогенезом. Vascular endothelial growth factor (VEGF) является важным регулятором ангиогенеза при эндохондральной оссификации с самого раннего образования зачатков конечностей и в течение всего эпифизного роста длинных костей. Экспрессия VEGF в конденсирующейся мезенхиме зачатка конечности помогает предопределять регионы васкуляризации вокруг растущих прехондрогенных конденсатов (Eshkar-Oren et al., 2009). Сосуды привлекаются к хрящевой модели кости перед её инициальной оссификацией за счет высоких уровней экспрессии VEGF в надхрящнице и соседней мезенхиме (Towler, 2008; Zelzer et al., 2002; Takimoto et al., 2009). Экспрессия VEGF гипертрофическими хондроцитами является критической для инвазии сосудов и последующей оссификации в инициальном месте в средине диафиза (Zelzer et al., 2002) и для эпифизной ростовой пластинки (Gerber et al., 1999). Делеция одиночного аллеля VEGF ведет к эмбриональной гибели у мышей, тогда как потеря определенных изоформ ведет к серьезным скелетным дефектам заднечерепных и свода черепа костей, связанных с задержкой инвазии сосудов (Zelzer et al., 2002). Однако, VEGF обеспечивает не только ангиогенез, но и дифференцировку хондроцитов, дифференцировку остеобластов и привлечение остеокластов (Zelzer and Olsen, 2004; Dai and Rabie, 2007), демонстрируя его сложную регуляторную роль во время остеогенеза.

Hypoxia inducible factor (HIF), обычно активируется в регионах гипоксии (Pugh and Ratcliffe, 2003), но также активируется благодаря зависимым от кислорода механизмам (Chun et al., 2002; Patel et al., 2010), он индуцирует экспрессию VEGF и, как известно, непосредственно регулирует остеобласты в эндохондральной кости (Towler, 2008; Rankin et al., 2011). Усиление экспрессии HIFα в остеобластах у ранних постнатальных мышей ассоциирует с увеличением экспрессии VEGF, увеличением плотности сосудов в их длинных костях, а также увеличению скорости роста длинных костей, приводя к увеличению объема бедренной кости и количества трабекул (Wang et al., 2007). Однако, как было установлено, и др. факторы (Towler, 2008), включая bone morphogenetic proteins (BMPs) (Langenfield and Langenfield, 2004; Towler, 2008) и fibroblast growth factor (FGFs) (Saadeh et al., 2000; Takai et al., 2007) также могут активировать экспрессию VEGF, связанную с оссификацией (Kawaguchi et al., 2001; Liu et al., 2007). Кроме того, ряд генетических факторов независимо реагирует на гипоксию в культуре ткани, включая angiopoietins, FGFs и гены, участвующие в метаболизме матрикса (Pugh and Ratcliffe, 2003). Продукция про-ангиогенных факторов является одним из способов, с помощью которого клон клеток остеобластов может регулировать активность эндотелиальных и др. сосудистых клеток. Необходимы дальнейшие экспериментальные исследования, чтобы определить какие гены, экспрессируемые остеобластами во время внутримембранозного остеогенеза играют роль в регуляции миграции и активности сосудистых клеток.

Факторы, не связанные с гипоксией, также играют существенную роль в ангиогенезе, ассоциированном с эндохондральной оссификацией. Напр., отсутствие витамина D полностью связанное с рахитом ведет к отсутствию нормальной сосудистой инвазии в гипертрофический эпифизный хрящ, а также к снижению роста кости и снижению уровня минерализации (Hunter et al., 1991). Тогда как более высокие, чем в норме уровни витамина D вряд ли способствуют ангиогенезу в регионах хряща без гипоксии, повышенная гипоксия не может вызывать ангиогенез в эпифизах в отсутствие витамина D.

Очевидно, что др. не генетические и генетические факторы, которые не связаны с гипоксией, важны для нормального ангиогенеза, ассоциированного с остеогенезом. Это особенно верно для внутримембранозной оссификации, для которой предположение о гипоксией управляемом ангиогенезе логично или вероятно, но не проверено. Локальный ангиогенез, скорее всего, является критическим для внутримембранозной оссификации преостеогенных мезенхимных конденсатов, но это не обязательно означает, что гипоксия служит в качестве первичной основы сигналов, которые ведут к ангиогенезу в этом контексте. В то время как гипоксические хрящевые клетки внутри хрящевой модели кости служат для активации ангиогенеза во время эндохондрального роста кости, имеется ли сходная утолщенная масса гипоксических клеток вблизи мест инициальной внутримембранозной оссификации, которая управляет ангиогенезом?

Сравнение экспрессии ангиогенных факторов, часто связанных с гипоксией, между передней конечностью плодов свиньи и нёба показывает, что HIF-α1 изоформа обнаруживается только в эндохондральных костях, тогда как изоформа HIF-α2- и HIF-ассоциированные факторы angiopoietin и VEGF экспрессируются как в внутримембранозно, так и эндохондрально формируемой кости (De Spiegelaere et al., 2010). Помимо этого потенциального отличия в экспрессии HIF, экспериментальное повышение HIFα ведет к усилению сосудистой сети в длинных костях мышей, тогда как кости свода черепа остаются незатронутыми (Wang et al., 2007). Многие из факторов, ассоциированные с активацией ангиогенеза во время эндохондрального остеогенеза, экспрессируются во время внутримембранозного остеогенеза, подтверждая идею, что ангиогенез важен во время внутримембранозного образования кости. Это также подтверждает, что имеется сильное общее сходство в регуляторных механизмах ангиогенеза во время обоих типов остеогенеза. В то время как факторы, подобные VEGF и HIF, ассоциированы с гипоксическими хондроцитами во время эндохондрального роста кости, они также, как известно, активируются с помощью независимых от кислорода факторов в определенных контекстах. Это оставляет открытой возможность, хотя и небольшую, что гипоксия внутри мезенхимных конденсатов не является первичной основой раннего ангиогенеза внутримембранозных костей. Будущие исследования д. сконцентрироваться на генетической регуляции во время внутримембранозного остеогенеза, чтобы проверить это общее предположение и определить сходство в регуляции ангиогенеза, связанной с обеими формами остеогенеза.

THE IMPORTANCE OF VASCULAR PROXIMITY FOR OSTEOGENESIS

Если ангиогенез внутри расширяющейся популяции преостеогенных мезенхимных клеток необходим для внутримембранозного образования кости, как и внутри хрящевой модели кости, то кровеносные сосуды, скорее всего, будут снабжать чем-то регионы минерализации кости, которые иначе будут отсутствовать. Следовательно, изменения пространственного или временного распределения кровеносных сосудов посредством ангиогенеза могут модифицировать расположение или скорость внутримембранозного остеогенеза. Мы исследовали роль близости сосудистой сети к местам образования кости.

Основная роль крови это транспорт кислорода и углекислого газа, которые в основном связаны в гемоглобином эритроцитов (Thiriet, 2008). Принимая во внимание, что ангиогенез часто возникает в регионах гипоксии, то доставка кислорода гипоксичным клеткам, как полагают, является важной ролью новой капиллярной системы, но близость сосудистой сети может также обеспечивать доступ к разнообразным циркулирующим электролитам, белкам, газам. липидам, плюрипотентным клеткам и минералам, включая ионы кальция и фосфатов, необходимые для остеогенеза (Heaney, 2008). Доступ к кислороду и др. факторам, необходимым для повышения клеточной активности, связанной с нормальной оссификацией (Shapiro et al., 1988), обеспечивается сосудистой сетью, которая одновременно служит для снижения продуктов отходов клеток.

Доступ к правильной комбинации циркулирующих гормонов необходим для нормального развития скелета (Karaplis, 2008). Однако гормоны, которые неотъемлемы для постнатального роста костей, могут быть не обязательны для инициальной оссификации. Напр., мыши, лишенные гормона роста (GH), необходимого для роста конечностей до ожидаемой длины, не оказывают модифицирующего влияния на рост кости до возраста в 3 недели (Sims et al., 2000). Др. факторы, циркулирующие в крови, включая разнообразные электролиты, скорее всего, участвуют в нормальной активности клеток, расположенных вблизи мест инициальной оссификации, но остается неясным, доступны ли эти факторы в достаточных концентрациях в локальной внеклеточной жидкости. Сходным образом, некоторые циркулирующие в крови белки (сывороточные белки), скорее всего, используются остеобластами для продукции костного матрикса, но многие матричные белки, скорее всего, продуцируются локально.

CELL PRECURSOR ORIGIN

Сосуды могут также служить в качестве транспортного средства для преостеогенных клеток для достижения регионов, где происходит оссификация. Идентифицирована варьирующая популяция циркулирующих остеогенных клеток предшественников и получены доказательства, что они вносят вклад в формирование кости в месте повреждения ткани, включая переломы костей (Pignolo and Kassem, 2011). Неизвестно, являются ли эти циркулирующие клетки настоящими кость-формирующими клетками во время заживления переломов и нормального ремоделирования кости (Parfitt,2001; Eghbali-Fatourechi et al., 2007; Eriksen et al., 2007), хотя результаты некоторых исследований подтверждают, что надкостница и костный мозг являются наиболее важными источниками остеогенных предшественников (Colnot, 2009; Colnot et al., 2012). Даже если циркулирующие клетки являются основным источником остеобластов во время постнатального роста и развития, они могут не иметь тоже самое значение во время пренатального остеогенеза, т.к. предположены некоторые источники остеогенных клеток для самых ранних стадий минерализации кости.

Во время самых ранних стадий минерализации эндохондральной кости, включая образование костных collar и оссификацию средины диафиза, было предположено, что остеобласты дифференцируются из локальных мезенхимных клеток, окружающих середину диафиза (Caplan et al., 1983) и/или соседней надхрящницы (Kronenberg,2003). Т.к. оссификация распространяется на более внутренние части кости и в направлении будущих эпифизов, то рождаемые кровью клетки выступают как предшественники остеобластов (Collin-Osdoby, 1994), хотя локальные хондроциты (Boyde and Shapiro, 1987) и локальные эндотелиальные клетки также предполагаются в качестве источников (Trueta, 1963; Hansen, 1993). Источник остеобластов может отличаться от места к месту вместе с различиями в способности или вероятности клеток к де-дифференцировке или трансформации (Hall, 2005).

Недавние успехи в окрашивании клеток позволили исследователям идентифицировать популяции клеток, из которых происходят остеобласты во время инициальной оссификации. Используя X-gal окрашивание почечных эксплантов хрящевых моделей костей конечностей мыши, было продемонстрировано, что надхрящница эксплантированной кости является источником кортикальных и трабекулярных остеобластов на самых ранних стадиях эндохондральной оссификации, хотя ассоциированные эндотелиальные клетки возникают вне эксплантированной кости (Colnot et al., 2004). Этот результат недавно подтвержден на мышах in vivo (Maes et al., 2010). Надхрящница является первичным источником остеобластов в этом случае и локальные эндотелиальные клетки, по-видимому, имеют др. источник, чем остеобласты, но вероятность, что некоторые остеобласты возникают из локальных хондроцитов, остается.

Во время инициальной внутримембранозной оссификации было предположено, что локальные мезенхимные клетки дифференцируются в остеогенные клетки, чтобы давать ретикулофиброзную (woven) кость, которая позднее ремоделируется (Collin-Osdoby, 1994). DiI окрашивание мезенхимных конденсатов лобной кости мыши на день эмбриогенеза 13.5 (E13.5) показало, что клетки, происходящие из этого конденсата, заполняют весь домен лобной кости на ст.t E17.5 и E18.5 (Yoshida et al., 2008). Следовательно, апикальная экспансия презумптивной кости от надбровных дуг использует клетки исходного мезенхимного конденсата скорее, чем рекрутирует существенные количества клеток из кровотока или из популяций подлежащей мезенхимы. В культурах костей свода черепа, ограниченных у мышей сагитальным швом, имплантационные эксперименты показали, что мезенхимные клетки, пролиферирующие на остеогенном фронте являются предшественниками остеобластов для увеличения кости, хотя очень небольшие количества могут происходит из мезенхимы шва (Lana-Elola et al., 2007). Поскольку небольшие количества мезенхимы шва оказываются включены в оссифицирующую кость, то небольшое количество циркулирующих предшественников остеобластов могут также вносить вклад в оссификацию костей свода черепа.

Остеокласты обнаруживаются во время инициального остеогенеза, они, скорее всего, возникают порождаемых кровью моноцитов (Caplan et al., 1983). Предшественники остеокластов, которые имеют гематопоэтическое происхождение, как известно, циркулируют в крови с моноцитами (Fujikawa et al., 1996), обеспечивая первичный пул остеокластов для резорбции кости, связанной с ремоделированием кости (Eriksen et al., 2007). Остеокласты важны для раннего ремоделирования кости, т.к. они предоставляют механизм для удаления кости, что является фундаментальной частью изменений в форме кости, необходимых для нормального роста. Напр., резорбция остеокластами внутри костей свода черепа необходимая ступень для изменения изгиба свода черепа и генерального ремоделирования костей всего черепно-лицевого комплекса (Enlow, 2000). Если хондрокласты и остеокласты дифференцируются из одной и той же популяции предшественников (Hall, 2005), то циркулирующие предшественники моноциты также являются источником и хондрокластов, которые предшествуют эндотелиальным клеткам во время ангиогенеза в хрящевую модель эндохондральной кости (Lewinson and Silbermann,1992; Streeten and Brandi, 1990).

REGULATORY INTERACTIONS BETWEEN ENDOTHELIAL AND OSTEOGENIC CELLS

Растущая сосудистая сеть не только предоставляет источник циркулирующих факторов и клеток в ранее безсосудистые места, но и их мигрирующие эндотелиальные клетки являются активной частью регуляторной сети, лежащей в основе образования и ремоделирования кости, включая остеобласты, остеокласты, макрофаги и стромальные клетки. Эндотелиальные клетки, известные своей близостью к дифференцирующимся остеобластам во вновь оссифицируемой кости, как известно, отвечают на факторы, продуцируемые остеобластной линией клеток (see Regulation of Intramembranous Angiogenesis section), и продуцируют факторы, которые могут регулировать дифференцировку, метаболизм и жизнеспособность остеобластного клона клеток (Collin-Osdoby, 1994; Brandi and Collin-Osdoby,2006).

Многие из потенциальных регуляторных взаимодействий между факторами, продуцируемыми эндотелиальными клетками и костными клетками, остаются не исследованными, хотя добавление эндотелиальных клеток к мезенхимным стволовым клеткам усиливает образование искусственно преобразованной кости, преимущественно из-за факторов, экспрессируемых эндотелиальными клетками (Grellier et al., 2009; Usami et al., 2009). Имеются доказательства, что эндотелием экспрессируемый endothelin-1 может влиять на пролиферацию и дифференцировку клеток остеогенных предшественников (Von Schroeder et al., 2003). Гипоксия, VEGF, и осциллирующие сдирающие стрессы, как известно, активируют экспрессию BMP-2 в сосудистых эндотелиальных клетках (Bouletreau et al., 2002; Sorescu et al., 2003), который может индуцировать дифференцировку остеобластов (Yamaguchi et al., 2000), а также активировать экспрессию VEGF и ангиогенез во время эндохондральной оссификации (Towler, 2008). Фактически, сосудистые гладкомышечные и эндотелиальные клетки были идентифицированы в качестве главного источника BMP-2 во время дистракционного остеогенеза (Matsubara et al.,2012), подтверждая, что сосудистая экспрессия этого или др. факторов может составить существенную регуляторную основу для нормальной активности остеобластов. Необходима дальнейшая проверка эффектов этих и др. факторов, продуцируемых эндотелиальными клетками, на дифференцировку и активность остеобластов во время остеогенеза, чтобы определить их значение и специфицировать их роль в оссификации внутримембранозных и эндохондральных костей.

Эндотелиальные клетки могут также регулировать остеокласты во время раннего остеогенеза. Активная зависимая от времени и места регуляция перемещений остеокластов через слой эндотелиальных клеток, скорее всего, необходима для доставки остеокластов в соотв. места (Parfitt, 2000; Brandi and Collin-Osdoby, 2006). Эндотелиальные клетки, как известно, продуцируют факторы, которые могут регулировать клетки клона остеокластов, включая macrophage-colony stimulating factor, и давать приют др. молекулам (Brandi and Collin-Osdoby, 2006). Независимо от точного способа, с помощью которого эндотелиальные клетки участвуют в межклеточной регуляторной сети остеогенеза, но тесная близость их с остеобластами и остеокластами действительно гарантирует, что они взаимодействуют с этими клетками, помимо того, что предоставляют возможность доставки факторов из кровоснабжения.

PERSPECTIVES

Хотя развитие эндохондральных длинных костей изучено лучше всего, черепно-лицевые эндохондральные элементы могут быть более подходящими намёками для модели внутримембранозного остеогенеза. Немногие сравнение краниальной и посткраниальной эндохондральной оссификации подтверждают в основном консервативный паттерн экспрессии генов (Eames and Helms, 2004) , т.е. временную задержку в предшественниках основания черепа по сравнению посткраниальными предшественниками, приводящую к задержке оссификации (Balczerski et al., 2012). Хотя любые различия между черепно-лицевыми и посткраниальными эндохондральными костями могут быть относительно незначительными, вполне возможно, что некоторые из этих различий имеют основой клеточное происхождение и локализацию внутри черепно-лицевого контекста, которые общи для внутримембранозных и эндохондральных костей черепа. Дальнейшие исследования по регуляции раннего черепно-лицевого остеогенеза, включая изучение роли ангиогенеза, д. быть сфокусированы на внутримембранозных и эндохондральных костях, чтобы определить, является ли внутримембранозный остеогенез более сходным в черепно-лицевым эндохондральным остеогенезом, чем с посткраниальным эндохондральным остеогенезом.

A MODEL OF ANGIOGENESIS DURING INTRAMEMBRANOUS OSTEOGENESIS

Ангиогенез в средину диафизов и эпифизы длинных костей и в сайты distraction во время дистракционного остеогенеза необходим для инициации минерализации в этих местах. Это взаимоотношение и отмеченные ассоциации между растущими капиллярами, остеобластами и минерализацией в лобной кости кур (Thompson et al., 1989) строго подтверждают, что ангиогенез необходимое предварительное условие для оссификации во время внутримембранозного остеогенеза. Базируясь на представленных данных мы предложили модель ассоциации между ангиогенезом и остеогенезом внутримембранозных (Fig. 5). Посольку большая часть информации о преостеогенной мезенхимной экспансии и внутримембранозном остеогенезе получена в исследованиях костей свода черепа, то возможно, что эта модель не объясняет остеогенез внутримембранозных лицевых костей. Поэтому ожидания модели д. быть проверены и на костях помимо свода черепа. Figure 5.

Непосредственно перед инициальной оссификацией данного безсосудистого преостеогенного мезенхимного конденсата, мы ожидаем, что капилляры вступают в окружающий слой безсосудистой рыхлой мезенхимы и оказываются в тесной близи к конденсату (Fig. 5A). Затем эти капилляры будут вступать в преостеогенный конденсат вблизи места и во время инициальной оссификации (Fig. 5B). Это движение сосудистой сети в непосредственную близость с и и сосудистая инвазия конденсата, скорее всего, базируются на снижении экспрессии пока неидентифицированных анти-ангиогенных факторов и на усилении экспрессии про-ангиогенных факторов (т.e., VEGF, HIF). Пока мы ожидаем, что сосудистая сеть первоначально приближается только к инициальным сайтам оссификации, как это происходит во время эндохондральной оссификации, отсутствие признаков, аналогичных костным манжеткам (collar) характерно ддля внутримембранозных костей.

Как только происходит оссификация в месте инициальной инвазии кровеносных сосудов, капилляры продолжают расти кнаружи от сосудов уже внутри оссифицирующегося конденсата скорее, чем от сосудов вне его, чтобы обеспечить кровоснабжением быстро увеличивающуюся популяцию мезенхимных клеток (Fig. 5C). Радиографические изображения Thorotrast-заполненных капилляров в теменных костях свода у плодов человека обнаруживают радиирующие кнаружи сосуды подобно спицам из центра оссификации в направлении краев кости (Fig. 6) (Brookes and Revell, 1998), подтверждая идею, что ангиогенез внутри развивающейся внутримембранозной кости исходит из центральных точек сосудистой инвазии. мы ожидаем, что про-ангиогенные факторы, первыми экспрессирующиеся в мезенхимных клетках вблизи инициального сайта оссификации будут следующими экспрессирующимися мезенхимными клетками, которые обеспечивают увеличение костных предшественников. Доказательства тесной ассоциации между преостеобластами и врастающими капиллярами во время эндохондрального остеогенеза (Maes et al., 2010) подтверждают, что растущие сосуды и мигрирующие преостеобастные клетки расширяющегося мезенхимного конденсата могут удерживаться по соседвтсву др. с др., сохраняя ассоциацию во время ранних стадий внутримембранозного остеогенеза. Figure 6.

Мы полагаем, что минерализация внутримембранозной кости впервые появляется вблизи капилляров, растущих через увеличивающийся конденсат, поскольку они могут непосредственно ассоциировать с мигрирующими преостеобластами и являются источником факторов, необходимых для оссификации. Затем мы ожидаем, что оссификация будет продолжаться в места, помогая заполнению не оссифицированных частей кости, т.к. начинается процесс ремоделирования и созревания кости (Fig. 5D). Как только мезенхимный конденсат заканчивает период своей быстрой экспансии, то растущие капилляры и фронт минерализации кости окажется уже вблизи презумптивных швов (Fig. 5E). Это д. инициировать хорошо известный процесс роста кости по краю швов, во время которого ангиогенез также, скорее всего, играет важную роль. Наконец, как только происходит оссификация краёв шва, то ранее оссифицированные части кости и сосудистая сеть в ней продолжают созревать, а продолжающийся ангиогенез может играть непрерывную роль в этом процессе.

Исследования трехмерных ассоциаций между кровеносными сосудами, первоначально безсосудистой мезенхимной конденсацией и остеобластами в течение самого раннего периода остеогенеза необходимы для выяснения ассоциаций между всеми тремя тканями, участвующими в этой модели (Fig. 5), особенно для морфологически сложных внутримембранозных костей лицевого скелета. Кроме того, результаты таких исследований могут быть использованы для проверки предположения, что проникающие капилляры являются обязательным предварительным условием для внутримембранозного остеогенеза.

Хотя изменчивость структуры артериальной и венозной сети заметна, регион, через который растут сосуды и время роста сосудов довольно стабильны, исходя из типичного времени и места экспрессии про-ангиогенных факторов. Если ангиогенез является обязательным для внутримембранозного остеогенеза, то изменения в регионах роста сосудов внутри преостеогенных мезенхимных конденсаций д. вносить вклад с изменения формы ассоциированной оссифицируемой кости, тогда как изменения во времени или скорости ангиогенеза д. модифицировать минерализации и созревания кости, но это также может вносить вклад в изменение формы. Степень и величина любого возникающего в конечном итоге изменения фенотипа кости, скорее всего, связана со временем и тяжестью нарушения регуляции ангиогенеза, но и также от того, достаточна ли близость сосудов для запуска локальной оссификации. Чтобы ответить на этот вопрос необходимы исследования экспрессии генов и экспериментальные манипуляции,с возможными регуляторными взаимодействиями, чтобы определить сигналы, которые активируют как ангиогенез при дифференцировке остеобластов внутри данной части мезенхимы.

Знание паттернов экспрессии проангиогенных факторов в мезенхимных клетках и в клетках клона остеобластов необходимо, чтобы определить возможный источник сигналов, которые, заставляют расти капилляры в направлении и в инициальные мезенхимные конденсации, а также, как полагают, увеличивать количества мезенхимных предшественников кости. Сравнение совместной экспрессии проангиогенных факторов и факторов, связанных с пролиферацией и дифференцировкой предшественников остеобластов, необходимо для проверки, сходны и/или связаны регуляторные базы для паттернов ангиогенеза и остеогенеза. Хотя ингибирование ангиогенеза в надхрящнице может предотвращать эндохондральную оссификацию, ингибирование перихондрального остеобластогенеза также связано с тяжелыми нарушениями инвазии сосудов (Komori et al., 1997; Otto et al., 1997; Colnot et al., 2005). Это указывает на то, что сигналы для активации ангиогенеза, которые необходимы для оссификации посредством активности зрелых остеобластов, могут быть ассоциированы с дифференцировкой преостеобластов. Поэтому ангиогенез не может быть достаточным для запуска оссификации в мезенхимных конденсациях.

SPECIFIC HYPOTHESES

Мы предлагаем специфическую гипотезу для тестирования. Эта гипотеза представляет точные и неявные допущения для поиска фундаментальных свойств остеогенеза внутримембранозных костей. Мы ожидаем, что эта гипотеза будет подкреплена последующими исследованиями, но любые аспекты, которые не будут подтверждены, откроют важные окна в различиях между ангиогенезом и остеогенезом во внутримембранозном и эндохондральном формировании костей.

Hypotheses

1. Отсутствие сосудов необходимо для экспансии нормальных преостеогенных конденсаций, которые предшествуют внутримембранозной оссификации.
2. Про-ангиогенные сигналы, которые способствуют ангиогенезу в направлении, внутри и через преостеогенные кеонденсации исходят из регионов гипоксии внутри этих конденсаций.
3. Паттерн внутримембранозного остеогенеза, описанный в нашей модели (Fig.5) является аккуратным для костей свода черепа и и морфологически сложных костей лица. Это означает быструю экспансию мезенхимных клеток из инициальных конденсаций в формиы, приблизительно напоминающие взрослую кость в то самое время, когда происходит оссификация.
4. Близость капилляров необходима, но недостаточна для локальной оссификации внутри мезенхимных конденсаций. Вместо этого регуляторные сигналы изнутри мезенхимных конденсатов способствуют как ангиогенезу в кнденсациях. так и дифференцировке остеобласттов внутри них.
5. Вариации в регуляции ангиогенеза могут иметь важное влияние на остеогенез и вызывают важные для эволюции и медицины вариации в фенотипах черепно-лицевого скелета.

While future studies of the association between blood vessels, mesenchymal condensations, and mineralizing bone are likely to reveal covariation between the development of blood vessel networks and craniofacial skeletal phenotypes, it is also critical to study the regulatory interactions between factors carried in the blood or produced by endothelial cells and cells of the osteoblast lineage. Only with a combination of phenotypic, developmental, and regulatory data can the causal basis of the association between blood vessels and mineralizing bone be illuminated. Given the likely role of angiogenesis during intramembranous osteogenesis, alterations in angiogenesis regulation are likely to contribute to craniofacial skeletal variation fundamental to evolutionary change or clinically relevant phenotypes. Modifications to angiogenesis regulation may be associated with changes: in rate of intramembranous ossification and bone maturation; in the shape of craniofacial bones; the relationship of cranial elements to one another; and in the production of craniofacial dysmorphology. To determine the potential impact of causal links between angiogenesis and osteogenesis in these contexts, the basic developmental associations between the two tissues must be illuminated for intramembranous bones. While information gained from the study of endochondral osteogenesis and distraction osteogenesis can provide a useful beginning for understanding intramembranous osteogenesis, verification of these processes is necessary to further elucidate the contribution of intramembranous ossification in development, disease, and evolution.

Angiogenesis and intramembranous osteogenesis Christopher J. Percival, Joan T. Richtsmeier Developmental Dynamics 242:909-922, 2013.

Angiogenesis and intramembranous osteogenesis
Christopher J. Percival, Joan T. Richtsmeier
Developmental Dynamics 242:909-922, 2013.