Хрусталики позвоночных хорошо приспособлены для исследований скоординированного роста клеток, дифференцировки и морфогенеза, поэтому эксперименты возможны в любом возрасте, а потеря ткани не угрожает жизни. Образование хрусталика начинается в группе эмбриорнальных эктодермальных клеток, детерминированными стать презумптивной хрусталиковой эктодермой (PLE). PLE располагается поверх формирующегося зрительного пузырька, который выпячивается наружу от вентральной части промежуточного мозга. Когда PLE и зрительный пузырек контактируют др с др., PLE утолщается в плакоду. Как внешние, так и внутренние факторы руководят быстрой инвагинацией этой плакоды в хрусталиковую ямку, это происходит одновременно с превращением зрительного пузырька в бокал. Затем хрусталиковая ямка отделяется от поверхности эктодермы, создавая полый хрусталиковый пузырёк, представленный клетками предшественниками. Клетки на задней стороне пузырька, ближайшей к сетчатке первыми становятся постмитотическими. Эти дифференцирующиеся клетки быстро удлиняются в хрусталиковые волокна, которые д. стать стержнем зрелого хрусталика. Образование первичнызх волокон смещает пролиферирующие клетки предшественники кпереди, где они сливаются в anterior epithelial layer (AEL). Непосредственное соседство (juxtaposition) переднего и заднего компартментов хрусталика переориентирует последующую дифференцировку так, чтобы она осуществлялась по окружности. Во время вторичного формирования волокон клетки AEL становятся постмитотическими внутри germative зоны, проходящей по экватору или переходной зоне, затем удлиняются и экспрессируют маркеры терминальной дифференцировки внутри компартмента клеточных волокон.

Один из путей сигнальной трансдукции, как известно, регулирующий рост и дифференцировку клеток прешественников хрусталика. это передача сигналов Notch (Jia et al., 2007; Ogino et al., 2008; Rowan et al., 2008). Передача сигналов Notch обеспечивает межклеточные коммуникации посредством лигандов и рецепторов на соседних клетках. Имеются два типа лигандов, Deltalike или Jagged, которые кодируют белки, связывающие Notch рецепторы посредством внуклеточных DSL и EGF-подобных доменов. Среди лигандов, Dll1, Dll3, Dll4 и Jag1 экспрессируются в пренатальных хрусталиках мышей (Lindsell et al., 1996; Bao and Cepko, 1997). Осложнением для расшифровки молекулярных механизмов передачи сигналов Notch является присутствие 4-х генов Notch у млекопитающих (Notch1–4), из которых Notch1, Notch2 и Notch3 транскрибируются во время развития хрусталика (Lindsell et al., 1996; Bao and Cepko, 1997). Независимо от того, какой лиганд или рецептор взаимодействуют др. с др. после соединения, Notch внутриклеточный домен (NotchIC) высвобождается в результате серии протеолитических расщеплений. NotchIC затем транслоцируется в ядро и образует комплексы с белками Rbpj и MAML транскрипционных факторов, которые непосредственно активируют ни жестоящие гены (rev. Fortini, 2009; Kopan and Ilagan, 2009).

Поскольку как и во многих др. тканях передаче сигналов Notch выполняет множественные роли во время развития хрусталика. У эмбрионов лягушек клетки зрительного пузырька экспрессируют Delta, который активирует Notch внутри хрусталиковой плакоды, вызывая Su(H)/Rbpj-обеспечиваемую активацию транскрипции Foxe3 (Ogino et al., 2008). Foxe3 экспрессируется в хрусталиковой плакоде, пузырьке и AEL, где он является существенным для роста и дифференцировки хрусталика (Blixt et al., 2000; Medina-Martinez et al., 2005). Напротив, у мышей Jag1, Notch2 и Rbpj необходимы для роста и дифференцировки клеток хрусталиковых предшественников (Jia et al., 2007; Rowan et al., 2008; Le et al., 2009; Saravanamuthu et al., 2009), хотя Cre-вызываемая делеция Jag1 или Rbpj не приводит к супрессирующему эффекту Foxe3 и к достоверному снижению пролиферации в AEL. Конечным результатом в данном случае является прогрессивная потеря AEL и компартментов переходной зоны с возможной афакией хрусталика (Jia et al., 2007; Rowan et al., 2008; Le et al., 2009). Напротив, эктопическая экспрессия Notch1IC вызывает аномальную экспансию AEL и переходной зоны, а также эктопическую экспрессию Foxe3 (Rowan et al., 2008). Итак, эти исследования показывают, что передача сигналов Jag1-Notch-Rbpj является критической для роста клеток предшественников хрусталика мышей, особенно во время вторичного образования волокон. Однако неясно, является ли передача сигналов Notch активной во время индукции хрусталика у мышей и образования пузырька, как это имеет место в глазах лягушек.

Чтобы протестировать специфические потребности в передаче сигналов Notch во время индукции и морфогенеза хрусталиков у мышей, мы делетировали Jag1 или Rbpj вовремя превращения плакоды в пузырёк. Для этого мы использовали AP2α-Cre мышей (Macatee et al., 2003), у которых активность Cre инициируется в хрусталиковой эктодерме раньше, чем у Le-Cre трансгенных мышей (Ashery-Padan et al., 2000; Song et al., 2007). Мы не обнаружили очевидной потребности в Jag1 или Rbpj во время индукции хрусталиков. Вместо этого мы установили, что ранняя потеря Jag1 или Rbpj влияет на отделение хрусталикового пузырька от поверхностной эктодермы, тогда как избыточная экспрессия активированного Notch1 (NotchIC) также задерживает закрытие и отделение пузырька. Поскольку AP2α/Tcfap2a экспрессируется в др. тканях тела (Zhang et al., 1996; West-Mays et al., 1999; Macatee et al., 2003), то обусловленная AP2α-Cre делеция Rbpj приводит к аномалиям эмбрионального кардиального тракта оттока и печени. В целом мы пришли к заключению, что в глазах грызунов передача сигналов Notch не нужна для индукции хрусталика, хотя соотв. величина сигнальной активности важна во время образования хрусталикового пузырька.

DISCUSSION

Notch Signaling During Lens Induction and Specification

В данной работе мы задались вопросом, необходима ли передача сигналов Jag1-Notch на очень ранних стадиях развития хрусталика у мышей, чтобы убедиться, что глаза мышей и лягушек используют сходные или различающиеся механизмы образования хрусталика. Мы по отдельности удаляли активность Jag1 и Rbpj с помощью рекомбинации Cre-loxP и не установили очевидной функции передачи сигналов Notch во время спецификации хрусталика и образования пузырька. У Xenopus, сигнал Delta2 испускается зрительным пузырьком, чтобы активировать Notch и инициировать формирование хрусталика. Активированный Notch образует комплекс с Su(H), который способствует транскрипции Foxe3 в хрусталиковой плакоде (Ogino et al., 2008). Следовательно, в зрительном пузырьке у мышей ожидалась Delta-подобная активность, чтобы инициировать развитие хрусталика у мышей. Удивительно, но не обнаружено доказательств экспрессии Delta-подобной мРНК (Dll1, Dll3 или Dll4) на этой стадии раннего развития глаз или очевидных мышиных ортологов для Delta2 лягушек в мышином геноме. У крыс в зрительном пузырьке и хрусталиковой плакоде Dll1 безусловно отсутствует, хотя активно транскрибируется соседней зрительной ножкой и клетками промежуточного мозга (Bao and Cepko, 1997). Экспрессия Jag1 мРНК в зрительном пузырьке и хрусталиковой плакоде ранее была описана, указывая на Jag1 как на потенциальный медиатор индукционного сигнала для хрусталика (Bao and Cepko, 1997; Le et al., 2009). Более того, мы не обнаружили какой-либо экспрессии мРНК Jag2 в развивающемся хрусталике (K.W.C. and N.L.B., unpublished observations). Итак, паттерны экспрессии лигандов указывают на мышиный Jag1 как на лиганд, способный инициировать хрусталик индукционный сигнал, правда Jag1 мутанты обнаруживают нормальное развитие хрусталикового пузырька и соотв. активацию Foxe3 и др. факторов детерминации хрусталика.

Однако более убедительным оказалось то, что потеря Su(H) ортолога, Rbpj, не оказывает влияния на индукцию, спецификацию хрусталика или экспрессию в плакоде Foxe3. Хотя возможно, что Jag1 в зрительном пузырьке управляет некоторыми аспектами индукции хрусталика, предполагается, что он действует посредством канонической активности actNotch-Rbpj внутри клеток предшественников хрусталика. Следовательно, потеря активности Rbpj в клетках предшественниках раннего хрусталика д. быть аналогичной генетическому тесту с избыточной экспрессией dnSu(H) в глазах лягушек (Ogino et al., 2008). Пока остается возможным, что наследуемые временные различия в блокировании канонической передачи сигналов Notch не могут быть преодолены при использовании нами AP2α, хотя белки Jag1 или Rbpj быстро удалялись, чем после драматического подавления Hes1. Итак, наши данные указывают на то, что ранняя экспрессия Jag1 и Rbpj не нужна для активации Foxe3 в хрусталиковой плакоде мышей. Несмотря на эти находки стоит протестировать Rbpj-зависимую активацию Foxe3 in vitro, с помощью избыточной экспрессии доминантно негативного Rbpj или Rbpj shRNA конструкции у эмбрионов мыши в культуре целой головы в период индукции хрусталика (Furuta and Hogan, 1998).

Roles for Jag1-Rbpj Mediated Notch Signaling in Lens Vesicle Separation and Closure

У позвоночных ножка хрусталика является побочным продуктом плакодного морфогенеза в хрусталиковый пузырёк. Обычно временная хрусталиковая ножка исчезает за счёт апоптоза на ст. E11 у мышей (Silver and Hughes, 1973; Schook, 1980; Mohamed and Amemiya, 2003). Здесь мы установили, что раннее удаление функции Jag1 или Rbpj в формирующемся хрусталике выявляет ранее неизвестную потребность в передаче сигналов Notch во время морфогенеза хрусталика. На первый взгляд, наблюдаемая высокая пропорция апоптических клеток, по-видимому, противоречит сохранению хрусталиковой ножки, обнаруживаемой у мутантов Ap2?Cre;Jag1CKO/CKO. Если каноническая передача сигналов Notch обычно индуцирует гибель клеток ножки, то должно быть меньше апоптических клеток у Jag1 мутантов. Более того, избыточная экспрессия Notch1ICD также приводит к сохранению соединения между хрусталиком и поверхностной эктодермой с одновременно задержкой взрыва апоптоза.

Как может передача сигналов Notch контролировать регрессию хрусталиковой ножки? Мы предполагаем, что без Jag1, чтобы инициировать передачу сигналов Notch, переход от хрусталиковой ямки к пузырьку осуществляется с более высокой скоростью, тем самым нарушается локализация апоптоза в хрусталиковом шарнире. Поскоьку межклеточные контакты оказываются измененными, то последующий апоптоз, будцчи индуцированным, ведет к образованию более маленьких хрусталиковых пузырьков с тонкой, удлиненной хрусталиковой ножкой. Эти сохраняющиеся структуры сохраняют эпителиальные характеристики, но не содержат клеток предшественников хрусталика, поскольку они являются Cdh1⁺, но Foxe3-neg. Мы также установили, что аномальные ножки обладают слабой структурной целостностью, имеют центральное отверстие, которое позволяет Crystallin⁺ хрусталиковым волокнам проникать необычным образом в переднюю камеру или окружающую мезенхиму.

Избыточная передача сигналов Notch также задерживает формирование хрусталикового пузырька, давая малой глубины, утолщенные хрусталиковые ямки. Хотя первоначально существует нормальная пропорция апоптических клеток у Notch1IC GOF мутантов, они случайно расположены вокруг хрусталиковой плакоды и ямки. В коненом итоге они появляются вокруг хрусталикового пузырька; однако он неспособен отделяться от поверхностной эктодермы (Rowan et al., 2008, and this study). Интересно, что возникает волна апоптоза в центре хрусталикового пузырька мутантов Notch1ICD GOF на ст. E11.5–E12.5, указывая, что хотя и существует временная задержка, изменения формы или контракции клеток предшественников хрусталика всё ещё запускают апоптоз, который должен обычно возникать в шарнире. Латентный апоптоз, купированный с аномальной морфологией ткани приводит к фенотипу открытого хрусталикового пузырька, напоминая хрусталики у пациентов с Peter's Anomaly (Rowan et al., 2008).

Поскольку каждая хрусталиковая ямка и клетки пузырька экспрессируют Jag1, Rbpj и Hes1 белки, мы пришли к заключению, что существует, скорее всего, повсеместная передача сигналов Notch для общения между клеткаим предшественниками. При такой ситуации стехиометрический баланс сигнальных уровней среди клеток предшественников хрусталика д. быть критическим. Мы далее предположили, что взаимодействие и интеграция Notch пути с др. сигнальными путями, напр., передачей сигналов Wnt, может косвенно изменять временные параметры морфогенеза хрусталикового пузырька. Это может осуществляться посредством пространственных или временных альтераций обычного апоптоза, разъединяющего соедеинение между пузырьком и поверхностной эктодермой. В будущем было бы интересно исследовать эту идею, поскольку разрушение pygo2 в соседней мезенхиме неавтономно блокирует морфогенез хрусталикового пузырька (Song et al., 2007). Важно также исследовать морфологию и целостность цитоплазматических отростков, охватывающих хрусталиковую ямку и хрусталиковый пузырек/бокал или возможность того, что Notch путь регулирует (прямо или косвенно) изменения формы цитоскелета клеток хрусталика посредством Cdc42 или Shroom3-обусловленных путей (Chauhan et al., 2009; Plageman et al., 2010).

Heart and Liver Defects in Ap2-Cre-Mediated Deletion of Canonical Notch Signaling

Передача сигналов Notch играет хорошо известную, критическую роль в кардиальном развитии (rev. Jain et al., 2010; MacGrogan et al., 2010), а фенотипы, описанные здесь согласуются с таковыми, описанными ранее (High et al., 2007; Mead and Yutzey, 2011). Однако в нашем исследовании фенотип OFT возникал в значительно более молодом возрасте (E14–E15) , чем у мутантов Wnt1-Cre;DN-Maml (P0–P12), у которых каноническая передача сигналов Notch доминантно блокировалась (High et al., 2007). Это можно приписать разной пространственно-временной активности между Cre драйверами, времени гомозиготного удаления эндогенного Rbpj белка, в противовес доминантному блокированию активных NotchIC/Rbpj/Maml комплексов, или осложнениям, возникающим от одновременного нарушения Notch-зависимых и -независимых функций для Rbpj и/или Maml1. Кардиальные дефекты, наблюдаемые у AP2α;RbpjCKO/CKO мышей сходны с таковыми, наблюдаемыми при Wnt1-Cre обусловленной потере Rbpj (Mead and Yutzey, 2011). Наконец, все изAP2α;RbpjCKO/CKO эмбриорнов имеют расположенные с нарушением границ OFTs и дефекты вентральной перегородки сердца, тогда как лишь 2 из 36AP2α;Hes1CKO/CKO эмбрионов имели нарушения OFT (van Bueren et al., 2010). Rbpj кардиальные фенотипы, наблюдаемые здесь также проявлялись в более моложом возрасте, чем у Wnt1Cre;RbpjCKO/CKO мышей, которые погибали при рождении (Mead and Yutzey, 2011). Менее выраженные фенотипы у кондиционных мутантов Hes1 указывают на то, что Rbpj обычно регулирует дополнительные нижестоящие гены мишени в клетках, происходящих из нервного гребня в кардиальном OFT.

В печени многочисленные исследования тестировали потребность в генах пути Notch с помощью кондиционных мутаций и множественных Cre драйверов, самый ранний из которых (FoxA3Cre) устранял активность гена, начиная со ст. E13.5 (Zong et al., 2009). Кондиционные фенотипы Jag1, Notch2, Rbpj и Hes1 представляют связную картину потребности в передаче сигналов Notch во время дифференцировки клеток печени и морфогенеза канальцев для желчных протоков (Sumazaki et al., 2004; Geisler et al., 2008; Zong et al., 2009; Hofmann et al., 2010; Sparks et al., 2010, 2011). Эти дефекты воспроизводят определенные аспекты Alagille Syndrome, который возникает у индивидов с гаплонедостаточностью по JAG1 или NOTCH2 (Li et al., 1997; Oda et al., 1997; McDaniell et al., 2006). В этом случае мы обнаружили явно уменьшенную печень уAP2α;RbpjCKO/CKO эмбрионов на ст. E12.5. Это раньше, чем какой-либо из известных дефектов печени, описанных для мутаций пути Notch. Малый размер печени у Rbpj кондиционных мутантов может возникать из-за пониженного роста эмбриональных гепатобластов и/или васкуляризации печени. Мы также наблюдали, что мутантные печени были бледными, указывая на потенциальный дефект гематопоэза у плодов. Напротив, E12.5AP2α;Jag1CKO/CKO эмбрионы имели нормальную печень (T.J.M., personal observations). Исходя из предположения, что этот особый Rbpj мутантный2 фенотип является Notch-зависимым, другие лиганды д. использоваться. Наиболее неожиданным, однако, стало отсутствие доказательств Ap2Cre делеции Rbpj в эмбриональной печени. В самом деле, экспрессия AP2α гена была установлена только в эктодермальной ткани, включая производные нервного гребня (Zhang et al., 1996; West-Mays et al., 1999; Macatee et al., 2003; Song et al., 2007). Поэтому мы предположили, что маленькая печень, обнаруживаемая уAP2α; RbpjCKO/CKO эмбрионов является результатом неавтономной потери Rbpj, возникающей в популяции клеток, окружающих формирующуюся печень.

Requirements for Jag1-Rbpj mediated Notch signaling during early mouse lens developmentTien T. Le, Kevin W. Conley, Timothy J. Mead, Sheldon Rowan, Katherine E. Yutzey, Nadean L. Brown Developmental Dynamics Volume 241, Issue 3, pages 493–504, March 2012

Requirements for Jag1-Rbpj mediated Notch signaling during early mouse lens development
Tien T. Le, Kevin W. Conley, Timothy J. Mead, Sheldon Rowan, Katherine E. Yutzey, Nadean L. Brown
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 3, pages 493–504, March 2012