Isl1 and Ldb Co-regulators of transcription are essential early determinants of mouse limb development  Developmental Dynamics Volume 241, Issue 4, pages 787–791, April 2012 | |
|
Background: The developing limb has served as an excellent model for studying pattern formation and signal transduction in mammalians. Many of the crucial genes that regulate growth and patterning of the limb following limb bud formation are now well known. However, details regarding the control of limb initiation and early stages of outgrowth remain to be defined. This report is focused on genetic events that pave the way for the establishment of a hindlimb bud. Results: Fgf10 and Tbx are crucial for early phases of limb bud initiation. Here we show that in the absence of Isl1 or of Ldb1/2, there is no hindlimb bud development. Fgf10 expression in the bud mesenchyme is dependent on Isl1 and its Ldb co-regulators. Conclusions: Thus, Isl1 and the Ldb co-regulators of transcription are essential early determinants of mouse limb development. Isl1/Ldb complexes regulate Fgf10 to orchestrate the earliest stages of hindlimb formation. Developmental Dynamics 241:787–791, 2012. Published 2012 Wiley Periodicals, Inc. Рисунки к статье |
После гаструляции возникает параксиальная, промежуточная и латеральная пластинка сегментов и мигрирует из мезодермы через примитивную полоску. Конечности развиваются из клеток латеральной пластинки мезодермы (Capdevila and Izpisua Belmonte,2001; Zeller et al.,2009). Эти клетки образуют выпячивания непосредственно под эктодермой и образуют конечности-формирующие регионы, которые закладываются c помощью точно скоординированного паттерна экспрессии членов семейства Hox генов (Burke et al.,1995). Tbx транскрипционные факторы важны для спецификации качественных особенностей конечностей. Tbx4 ассоциирует с развитием задних конечностей (Gibson-Brown et al.,1996), тогда как Tbx5 участвует в развитии передних конечностей (Chapman et al.,1996). Вслед за экспрессией Tbx экспрессируется Fgf10 в латеральной пластинке мезодермы в проспективной мезенхиме зачатков конечностей. In vitro анализ идентифицировал Fgf10 в качестве непосредственно мишени для Tbx5 (Agarwal et al.,2003). Fgf10 является существенным как для инициации зачатков конечностей, так и для поддержания роста (Ohuchi et al.,1997; Min et al.,1998; Sekine et al.,1999). Потеря функции Fgf10 устраняет развитие передних и задних конечностей (Min et al.,1998; Sekine et al.,1999). Fgf10 индуцирует экспрессию Fgf8 в эктодерме. Рост и развитие зачатков конечностей позвоночных зависит от реципрокных взаимодействий между Fgf10 в мезенхиме и группой Fgf сигналов, включая Fgf4, Fgf8, и Fgf17, в лежащем поверх апикальном эктодермальном гребне (AER) (Crossley et al.,1996; Vogel et al.,1996; Ohuchi et al.,1997; Lewandoski et al.,2000; Moon and Capecchi,2000; Sun et al.,2002).
Некоторые члены семейства LIM-homeobox (Lhx) генов транскрипционных факторов существенны для развития конечностей. Более ранние исследования показали, что Lhx гены Lhx2, Lhx9 и Lmx1b играют ключевые роли в формировании паттерна и роста конечностей (Cohen et al.,1992; Diaz-Benjumea and Cohen,1993; Ng et al.,1996). Формирование ранних зачатков конечностей сопровождается экспрессией Lhx2 и Lhx9. Isl1, дополнительный Lhx ген, экспрессируется специфически в ранних зачатках задних конечностей эмбрионов мышей, при этом пик наивысшего уровня экспрессии на ст. E9.5, который быстро снижается во время последующих 24 ч развития конечностей (Sun et al.,2007; Tzchori et al.,2009). Одновременное удаление частично перекрывающихся генов Lhx2 и Lhx9 ведет к тяжелому нарушению развития конечностей, которое в дальнейшем усиливается за счет одновременного нокдауна важного Ldb1 ко-регулятора гена активности гена Lhx в мезенхиме зачатков конечностей (Tzchori et al.,2009). В данном исследовании мы проанализировали роль Lhx транскрипционного аппарата во время инициации развития конечностей в мезенхиме возникающих зачатков конечностей. Мы показали, что Ldb1-Isl1 комплекс является важным для развития задних конечностей и действует выше Fgf10 в мезенхиме зачатков конечностей. Это сравнимо с недавними находками Kawakami et al. (2011) , которые показали, что Isl1 регулирует инициацию задних конечностей выше Fgf10. DISCUSSION Наш анализ был облегчен тем фактом, что Ldb1 и Ldb2, обязательные ко-регуляторы активности генов Lhx, экспрессируются во время развития зачатков конечностей (Tzchori et al.,2009). Генетический и молекулярный анализ подтвердил идею, что белки Ldb1 и Ldb2 функционально перекрываются, при этом Ldb1 обнаруживает более высокие уровни экспрессии по всему эмбриону. Ldb2 нулевые мыши были плодовиты и фенотипически нормальны, тогда как Ldb1 нулевые эмбрионы погибали вскоре после имплантации (Mukhopadhyay et al.,2003). Для полного устранения активности Ldb в развивающихся конечностях, мы прибегли к условной инактивации Ldb1 на Ldb2 нулевом фоне (Table 1). Floxed Ldb1 (Tzchori et al.,2009) был инактивирован в мезенхиме зачатков конечностей путем выключения T-Cre трансгена, который экспрессируется в мезодерме, исходящей из первичной полоски, источнике мезенхимы для зачатков конечностей the limb bud mesenchyme (Perantoni et al.,2005; Verheyden et al.,2005).Возникающие в результате мутантные эмбрионы не развиваются после ст. E14.5. У контрольных эмбрионов зачатки задних конечностей становились обнаружимыми на ст. E10. У Ldb1/2 двойных мутантов, мы оказались неспособны наблюдать развитие задних конечностей на этой стадии. Образование зачатков передних конечностей не затрагивалось, но дальнейшее развитие передних конечностей тяжело нарушено (Fig. 1a,b). Окрашивание скелета у E14.5 мутантов подтвердило, что структуры задних конечностей не развиваются. (Fig. 1c,d).
Развитие передних конечностей не останавливается, но сильно повреждается инактивацией облигаторных Ldb ко-регуляторов активности генов Lhx. Ранее нами было отмечено, что не все клетки мезенхимы в ранних зачатках передних конечностей экспрессируют T-Cre. Как следствие, часть этой мезенхимной ткани избегает эффекта от удаления Ldb1 (Tzchori et al.,2009). Задние конечности развиваются приблизительно на 24 ч позднее (Capdevila and Izpisua Belmonte,2001), на этой стадии развития эмбрионов достаточные уровни Cre энзима могут накапливаться в мезенхиме зачатков задних , подавляя большую часть или всю активность Ldb1.
Используя сходный подход мы получили мышей, лишенных активности гена Isl1 в мезенхиме зачатков задних конечностей за счет T-Cre обусловленной инактивации гена Isl1 (Table 1). Из всех Isl1 мутантных эмбрионов (n>20) менее 30% доживало до ст. E10.5,тогда как гетерозиготы по Isl1 выглядели нормальными. E9-E10.5 Isl1 мутантные эмбрионы были достоверно меньше контрольных и лишены зачатков задних конечностей (Fig. 2). Развитие зачатков их передних конечностей было неотличимо от контроля, принимая во внимание тот факт, что Isl1 избирательно экспрессируется в зачатках задних конечностей. expressed in the hindlimb bud.
В сценарии, где Isl1 и Ldb ко-регуляторы являются частью комплекса, регулирующего ранние события в развитии задних конечностей, следует ожидать очень сходных фенотипов у соотв. мутантов после нокдауна затрагивающего Isl1 и Ldb ко-регуляторы, работающие с тесной взаимосвязи в T-Cre затронутых клетках. Однако Isl1 мутанты значительно меньше, чем Ldb1/2 мутанты и они погибают раньше. В обоих случаях нокдаун вызывался c помощью T-Cre обеспечиваемой эксцизии Isl1 и Ldb1 генов мишеней. Фенотипические расхождения между Isl1 и Ldb1/2 мутантами могут быть объяснены предположением, что floxed Isl1 ген более доступен, чем floxed Ldb1 для T-Cre-обеспечиваемого нокдауна. Такие различия в Cre доступе к индивидуальным floxed генах уже были описаны (Vooijs et al.,2001; Birling et al.,2009). В дополнение или альтернативно различия в полужизни продуктов генов Isl1 и Ldb1 могут влиять на соотв. мутантные фенотипы (Vooijs et al.,2001). Наконец, мы не можем исключить возможность, что Isl1 обладает функциями, независимыми от таковых у ко-регулятора Ldb.
Fgf10 распознается как ключевой регулятор, который необходим для формирования зачатков конечностей (Ohuchi et al.,1997; Min et al.,1998; Sekine et al.,1999). Раннее развитие зачатков задних конечностей укорочено у Ldb1/2, Isl1 и Fgf10 мутантов одинаково. Мы оказались неспособны наблюдать экспрессию Fgf10 в мезенхиме Ldb1/2 и Isl1 мутантных полей зачатков задних конечностей (Figs. 3a,d, 4a,b). Это помещает активность Lhx транскрипционного аппарата в формирующихся зачатках задних конечностей выше Fgf10. В регионе передних конечностей Ldb мутантов, экспрессия Fgf10 тяжело нарушена, тогда как экспрессия сохраняется у Isl1 мутантов (Fig. 3b,d). Наши данные согласуются с исследованиями по инициации задних конечностей Kawakami et al. (2011) которые показали, что Isl1 необходим для активации beta catenin пути выше Fgf10.
Isl1 не экспрессируется в зачатках передних конечностей. Т.о., экспрессия Fgf10 в зачатках передних конечностей регулируется пока с помощью ещё неизвестного Isl1-независимого механизма.
Экспрессия Tbx4 в зачатках задних конечностей, как было исследовано на ст. E10, отмечается как у Ldb, так Isl1 мутантов (Figs. 3c,f, 4c,d). Kawakami et al. (2011) сообщили о достоверной, но не полной редукции экспрессии Tbx4 на ст. E9.5 в латеральной пластинке мезодермы Isl1 мутантов и пришли к выводу, что Isl1 может участвовать в регуляции Tbx4 в области задних конечностей. Сохранение экспрессии Tbx4 у Ldb1 и Isl1 мутантов, которые были неспособны формировать зачатки задних конечностей указывает на то, что Tbx4 не является детерминирующим фактором при инициации зачатков задних конечностей. Тем не менее более ранний нокаут предоставил доказательства, что Tbx4 участвует в развитии зачатков задних конечностей (Naiche and Papaioannou,2003). Пути, которые связывают Ldb1, Isl1 и Tbx4 во время ранней фазы развития зачатков задних конечностей, ещё предстоит определить.
Мы пришли к заключению, что Isl1 обязателен для раннего образования зачатков задних конечностей и что его действие в мезенхиме зачатков устраняется или мутациями Isl1 или путем удаления облигатных Ldb ко-регуляторов этого Lhx гена. Экспрессия Fgf10 в мезенхиме зачатков задних конечностей теряется, если функция Isl1 иди его Ldb ко-регуляторов урезана. Поэтому оба прежде всего ассоциированы с самыми ранними событиями в развитии задних конечностей, которым предшествует индукция Fgf10 в мезенхимных клетках возникающих зачатков конечностей.
|