Развитие органов сложный процесс, использующий реципрокные сигналы между клетками и окружающими тканями, чтобы управлять спецификацией, дифференцировкой, ростом и морфогенезом. Во время эмбрионального развития развивается кровеносная система из эмбриональной мезодермы посредством процесса, известного как васкулогенез: миграция и слипание популяции клеток эндотелиальных предшественников (Eilken and Adams, 2010; Geudens and Gerhardt, 2011). Эмбриональная кровеносная система далее развивается за счёт ангиогенеза, ремоделирования сосудов и функциональной специализации (Eilken and Adams, 2010). Удивительно, она также дает вторичную сосудистую систему, лимфатическую (Sabin, 1902; Oliver and Srinivasan, 2010). Предшественники lymphatic endothelial cell (LEC) специфицируются из венозных blood endothelial cells (BECs) в определенных местоположениях и впоследствии мигрируют прочь от эмбриональных вен, чтобы сформировать лимфатические сосуды (Sabin, 1902). Возникающая лимфатическая сеть является иерархической сетью, представленной инициальными или абсорбтивными сосудами и крупными собирающими сосудами, приспособленными для транспорта лимфы, которая действует скоординированным способом, чтобы возвратить лимфу в кровоток. Лимфатические сосуды также важны для абсорбции жирных кислот и трафика иммунных клеток (see Box 1). Ряд болезненных состояний ассоциирован с дисфункцией лимфатических сосудов (rev. Alitalo, 2011), и это позволяет понять роль лимфатических сосудов в болезнях человека. Наше понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования и морфогенеза развивающейся лимфатической сети существенно продвинулось в последнее время.

Box 1. Lymphatic vessel form and function

The cellular architecture of lymphatic vessels underlies the primary function of the network. Lymphatic capillaries, or initial lymphatic vessels, absorb the interstitial fluid and protein (lymph) that is exuded from blood capillaries (Delamere and Cuneo, 1903). The ECs that make up these vessels contain specialised 'button-like' junctions (Baluk et al., 2007) and adhere to the ECM via anchoring filaments, both of which enable these vessels to sense interstitial pressure and open to absorb lymph (Leak and Burke, 1968). The deeper, collecting lymphatic vessels contain valves that maintain the unidirectional flow of lymph and are lined with vascular smooth muscle cells that rhythmically contract to drive lymph flow (Kampmeier, 1928; Smith, 1949). Draining lymph is returned to the venous vasculature via connections between the major lymphatic trunks and the subclavian veins, thereby maintaining fluid homeostasis. Lymphatic vessels are punctuated by lymph nodes that house immune cells, including antigen-presenting cells, T and B lymphocytes, and macrophages. The flow of lymph through lymph nodes enables the constant surveillance of lymph, is important for the effective mounting of immune responses and facilitates immune cell trafficking. Specialised lymphatic vessels in the intestine (lacteals) are essential for the absorption of fatty acids.

Overview of lymphatic vascular development

Mouse

Самыми первыми доказательствами лимфангиогенеза у эмбрионов мыши является начало экспрессии транскрипционного фактора PROX1 в субпопуляциях венозных BECs, расположенных на дорсолатеральной стенке парных передних cardinal veins (CVs) приблизительно на эмбриональный день (E)9.5 (Wigle and Oliver, 1999; Francois et al., 2008). PROX1-позитивные LEC предшественники покидают стенку вен во многих местах по всему эмбриону и мигрируют прочь (начиная ~E10.0-E11.5) в дорсолатеральном направлении, чтобы сформировать лимфатические мешки и поверхностные лимфатические сосуды (Fig. 1A) (Wigle and Oliver, 1999; Oliver, 2004; Francois et al., 2012; Yang et al., 2012; Hagerling et al., 2013). Это событие было первоначально предположено в начале 19-го ветка Florence Sabin (Sabin, 1902) и недавно оценено с помощью экспериментов по отслеживанию клонов у мышей (Srinivasan et al., 2007). На E14.5, подкожная сеть лимфатических сосудов генерируется с помощью процесса, предположительно использующего ангиогенные выросты и ремоделирование из лимфатических мешков и поверхностных сосудов. lPROX1-позитивные клетки наиболее многочисленны в передней части CVs, чем в задней, в соответствии с повышенными количествами предшественников LEC, мигрирующих прочь от переднего региона (van der Putte, 1975; Wigle and Oliver, 1999; Karkkainen et al., 2004; Francois et al., 2012). В конечном счете, мышиные эмбрионы прогрессивно развивают лимфатические сосуды спереди кзади (van der Putte, 1975; Wigle and Oliver, 1999; Yang et al., 2012; Hagerling et al., 2013). Fig. 1.

Три недавних исследования с использованием высоко разрешающей техники конфокальной микроскопии целых эмбрионов описали пути миграции LECs во время развития лимфатической сети у эмбрионов мыши и открыли ранее не обнаруженные морфогенетические события во время выхода предшественников LEC из вен (Francois et al., 2012; Yang et al., 2012; Hagerling et al., 2013). первое исследование Francois с коллегами подтвердило, что внутри стенки CV, PROX1-позитивные клетки предшественники LEC собраны на определенных территориях вдоль передне-задней оси вен, названы pre-lymphatic clusters (PLCs). Наблюдения в живую этого процесса выявили, что PROX1-позитивные клетки предшественники динамически агрегируют в PLCs и далее увеличивают уровни своих Prox1 (Francois et al., 2012). В том же исследовании было предположено, что эти клетки затем выходят из вен в виде потоков или кластеров из немногих клеток, но также посредством механизма вспучивания (ballooning) из PLCs, при этом клетки коллективно мигрируют из PLCs , чтобы сформировать маленькие мешочки, которые позднее сливаются, чтобы давать лимфатические мешки. Открытые точки соединений между лимфатическими мешочками и CVs были обнаружены в этом исследовании, предоставляя объяснение, почему клетки крови обнаруживаются внутри ранних развивающихся лимфатических мешочков (Francois et al., 2012). Дополнительные наблюдения показали с помощью иммуноокрашивания целых эмбрионов, что изолированные одиночные клетки и небольшие кластеры клеток видны впереди врастающих сплетений лимфатических сосудов (Fig. 1A, arrowheads), подтверждая, что некоторые клетки могут отрываться и мигрировать впереди этих отрастаний от вен. Сигналы, ответственные за управление сборки PLCs ещё предстоит описать и необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять относительный вклад всучивания PLC и врастания клеток во время выхода из CVs.

Во втором исследовании высокого разрешения конфокальная и электронная микроскопия проиллюстрировали, что предшественники LEC покидают CV (начиная со ст. E10.0) в виде взаимосвязанных групп клеток посредством механизма отрастания, это гарантировало, что целостность вен будет сохранена (Yang et al., 2012). Yang et al. предположили, что целостность вен достигается во время выхода предшественников LEC благодаря присутствию 'zipper-like' соединений, содержащих VE-cadherin (vascular endothelial cadherin; известный также как cadherin 5 - Mouse Genome Informatics), которые соединяют предшественники LEC с CV, когда они активно отпочковываются (Yang et al., 2012). Исходя из изображений фиксированных выборок, эти клетки, по-видимому, мигрируют в виде потока дорсолатеральным способом (Fig. 1B). В дополнение к их расположению в CVs, предшественники LEC обнаруживаются внутри venous intersomitic vessels (vISVs), а врастающие популяции предшественников LEC, как было установлено, сливаются вместе на ст. ~E10.5? чтобы сформировать рудиментарные сходные с капиллярами сплетения вдоль передне-задней оси эмбриона (Francois et al., 2012; Yang et al., 2012). Yang et al. предположили, что дальнейший морфогенез этих сплетений ведет к образованию лимфатических мешочек-подобных структур, которые постепенно становятся всё более определенными на E12.5 (Yang et al., 2012). В то время как LYVE1 и PROX1 экспрессируются предшественниками LEC внутри вен, обнаруживается экспрессия только podoplanin в предшественниках LEC, которые полностью отсоединились от CV, подтверждая, что выход из стенок вен тесно ассоциирован с индукцией программы дифференцировки LEC (Francois et al., 2012; Yang et al., 2012). Было также предположено, что, хотя большинство PROX1-экспрессирующих предшественников LEC в конечном итоге покидает вены и вносит вклад в развивающуюся лимфатическую сеть, сохраняется субпопуляция в венах и формирует лимфовенозные клапаны; они развиваются посредством интеркаляции происходящих из лимфатических мешков LECs с субпопуляцией PROX1-позитивных венозных BECs в месте соединения яремной и подключичной вен (Srinivasan and Oliver, 2011).

Hagerling с коллегами (Hagerling et al., 2013) использовали ультрамикроскопию, чтобы исследовать лимфатического развитие на эмбрионах мышей. Это исследование процесса разрешением в одиночную клетку позволило построить современную модель. Было установлено, что индивидуальные инициальные клетки LECs обнаруживают как определенную морфологию веретена, так и отличающийся профиль экспрессии белков, когда они отделяются от CV. Было предположено, что две основные популяции инициальных LECs возникают из вен прежде чем срастись билатерально и внести вклад в дорсальный peripheral longitudinal lymphatic vessel (PLLV), а также в вентральный primordial thoracic duct (pTD; структура, обозначаемая как яремный лимфатический мешок в предыдущих исследованиях) в близи от CV. PLLV, как полагают, дает в конечном итоге поверхностные LECs и может частично возникать из superficial lateral venous plexus (sVP), ранее недооцененный источник эмбриональных LECs.

Итак, эти исследования, построенные на ряде предыдущих анализов (Wigle and Oliver, 1999; Karkkainen et al., 2004) и существенно расширенные модели, которые были лишены наглядных клеточных деталей. Все последовательно предлагали механизм врастания, использующий прогрессивную миграцию индивидуальных и групп предшественников LEC от CV, чтобы сформировать лимфатические мешки (or pTD) и поверхностные лимфатические сосуды. Однако имеются различия в предлагаемых моделях, показывающие необходимость в дальнейшем детальном анализе. Модель, суммирующая эти события представлена на Fig. 1A.

Zebrafish

Хотя лимфа у рыб описана столетие тому назад (Hewson and Hunter, 1769), лимфатическая сосудистая система рыбок данио впервые описана в 2006 (Kuchler et al., 2006; Yaniv et al., 2006). Использование рыбок данио чрезвычайно помогло нашему пониманию клеточных событий и генетических путей, важных для развития лимфатических сосудов. В частности, новая информация получена из наблюдений вживую клеточных процессов, быстрых генных нокдаунов и открытия генов. У рыбок данио большинство исследованных лимфатических сосудов составляют туловищную лимфатическую сеть, которая состоит из thoracic duct (TD), intersomitic lymphatic vessels (ISLVs) и dorsal longitudinal lymphatic vessels (DLLVs) (Fig. 1C,D) (Kuchler et al., 2006; Yaniv et al., 2006; Hogan et al., 2009a). Процесс эмбрионального лимфангиогенеза стартует ~32 ч после оплодотворения (hpf). На этой стадии, дорсальная аорта (DA), posterior cardinal vein (PCV), arterial intersomitic vessels (aISVs) и dorsal longitudinal anastomosing vessel (DLAV) уже сформированы за счет процесса васкулогенеза и первичного (артериального) ангиогенного разрастания (sprouting) (Fig. 1C) (Isogai et al., 2003). Лимфангиогенез связан со вторичным (венозным) ангиогенным врастанием, когда BECs начинают прорастать дорсально от PCV. Приблизительно половина венозных врастаний подвергается анастомозам с межсомитными артериями, чтобы дать venous intersomitic vessels (vISVs); в среднем, каждое второе венозное отрастание (Bussmann et al., 2010) становится лимфатическим предшественником, мигрирующим в horizontal myoseptum (HM) на ст. 48 hpf , чтобы сформировать parachordal lymphangioblast (PL). PLs остаются в HM вплоть до ~60 hpf и затем они мигрируют вентрально, чтобы дать TD и вентральную часть ISLV , или дорсально, чтобы сформировать DLLV и дорсальную половину ISLV (Yaniv et al., 2006; Hogan et al., 2009a). Время провести параллели с потоками лимфатических предшественников от CV у мышей (Karkkainen et al., 2004; Srinivasan and Oliver, 2011; Francois et al., 2012; Yang et al., 2012; Hagerling et al., 2013) , но существуют анатомические отличия между этими моделями, особенно отсутствие промежуточного лимфатического мешка у рыбок данио и драматические отличия в общих количествах LEC (Kuchler et al., 2006; Yaniv et al., 2006; Hogan et al., 2009a). Необходимо также отметить, что большинство обычно изучаемых регионов у эмбрионов мышей (яремная область) и рыбок данио (туловище) не являются анатомическими гомологами.

Недавнее создание новых, мощных трансгенных линий, которые метят венозную и лимфатическую сосудистую системы у рыбок данио открыли ранее не охарактеризованные лимфатические сосудистые ложа и способы эмбрионального лимфангиогенеза (Flores et al., 2010; Okuda et al., 2012). Эти лимфатические сосуды включают facial lymphatics (FLs) [также наблюдаемые ранее (Yaniv et al., 2006; Bussmann et al., 2010)] (Fig. 1C, left panels), lateral lymphatics (LL) и intestinal lymphatics (IL), которые соединены с TD (Okuda et al., 2012) (Fig. 1D). Интересно, что образование FLs происходит др. способом по отношению к сети лимфатических сосудов туловища. FLs состоят из трех первичных сосудов: lateral facial lymphatic (LFL), medial facial lymphatic (MFL) и otolithic lymphatic vessel (OLV) (Fig. 1C, left panels). Клеточные механизмы, с помощью которых развиваются FLs , напоминают те, с помощью которых развиваются яремные лимфатические сосуды у мышей: промежуточный facial lymphatic sprout (FLS), отчасти напоминает промежуточный лимфатический мешок, формируемый сначала из common cardinal vein (CCV) и затем, по-видимому, ремоделируемый в лимфатические сосуды (Yaniv et al., 2006; Okuda et al., 2012). Далее клетки продолжают отрастать от CCV, но от разных частей, наиболее передняя CCV является источником, из которого формируется FLS; они будут соединяться с отростками, исходящими из FLS, чтобы сформировать индивидуальные лицевые лимфатические сосуды, используя клетки предшественники из множественных венозных источников. После созревания FLs, первоначальное соединение с CCV теряется и FL система формирует соединения с TD посредством jugular lymphatic vessel (JLV) (Okuda et al., 2012) (Fig. 1C, left panel).

Evolutionary comparisons

Анатомы идентифицировали неожиданный уровень морфологической дивергенции в разных системах лимфатических сосудов позвоночных (see Box 2) и было предположено, что врожденные отличия между гомеостазом жидкости у наземных по сравнению с водными позвоночных, скорее всего, отвечают за такие различия (Kampmeier, 1969). В самом деле, рыбки данио, по-видимому, лишены как лимфатических узлов, так и лимфатических клапанов, двух определяющих признаков зрелой лимфатической сосудистой системы млекопитающих (Kampmeier, 1969; Steffensen and Lomholt, 1992; Dahl Ejby Jensen et al., 2009). Лягушки и рептилии имеют дополнительные структуры, сокращающиеся лимфатические сердца, важные для продвижения лимфы, подчеркивающие анатомическую дивергенцию лимфатических систем в ходе эволюции. Однако, несмотря на анатомическую и функциональную дивергенцию, ясно, что крупные лимфатические сосуды у мышей и рыбок данио развиваются за счет очень сходных клеточных процессов дорсального отрастания от эмбриональных вен, миграции и ремоделирования (Kuchler et al., 2006; Yaniv et al., 2006). Более того, генетика рыбок данио может быть использована для понимания образования лимфатических сосудов применительно к развитию млекопитающих (Alders et al., 2009; Hogan et al., 2009a; Bussmann et al., 2010; Lim et al., 2011; Cha et al., 2012).

Box 2. Evolutionary divergence in lymphatic vascular systems

Lymphatic systems are found exclusively in vertebrates, yet different organisms have adopted a surprising level of morphological divergence during evolution to provide adequate functions within different environments (reviewed by Kampmeier, 1969; Isogai et al., 2009). As early as the 18th century, advances in understanding the mammalian lymphatic vasculature were made by Olaus Rudbeck and Thomas Bartholin (reviewed by Lord, 1968). In 1769, Hewson and Hunter described the lymphatic system in fish, turtle and birds (Hewson and Hunter, 1769). Some major points of evolutionary divergence are highlighted below: Fish. In teleosts, lymph flow is thought to occur as a result of the contraction of skeletal muscles (Kampmeier, 1969). The lymphatic system in teleosts lacks lymphatic valves and lymph nodes (Hewson and Hunter, 1769). Amphibians. Frogs have an additional level of complexity to their lymphatic vasculature: lymphatic hearts, which develop from an intermediate lymph sac (Ny et al., 2005; Peyrot et al., 2010). These help pump lymph through the body and probably evolved because of the change from an aquatic to a terrestrial environment (Knower, 1908). Reptiles. Reptilian lymphatic networks resemble those of amphibians, but possess only posterior lymph hearts (Hoyer, 1934). Birds. Birds have primitive lymphatic valves to facilitate lymph flow but have no lymph hearts (Clark, 1915). Interestingly, work in chick has suggested that LECs arise from venous and somitic origins, adding further complexity to our understanding of lymphatic development (Wilting et al., 2006). Mammals. All mammals have a complex lymphatic vasculature with highly developed lymphatic valves, nodes and hierarchical vessel subtypes (Sabin, 1902; Delamere and Cuneo, 1903).

Acquiring LEC identity and the induction of sprouting

Molecular mechanisms of LEC specification

Первым молекулярным показателем компетентности LEC у мышей является экспрессия семейства SOXF транскрипционного фактора SOX18 в дорсолатеральной части стенки CV (Francois et al., 2008) (Fig. 2). Инактивация SOX18, с помощью генного нокаута или за счет присутствия точковой мутации, дающей доминантно-негативный белок, нарушает развитие лимфатических сосудов (Francois et al., 2008; Hosking et al., 2009). SOX18 соединяется с цис-действующими регуляторными регионами гена Prox1 и активирует его транскрипцию (Francois et al., 2008). PROX1 давно считался основным регулятором судьбы LEC и служил как наиболее реальный маркер качественных особенностей LEC (Wigle and Oliver, 1999; Rodriguez-Niedenfuhr et al., 2001). PROX1 является критическим для лимфатического развития; нокаутные по Prox1 мыши неспособны формировали лимфатическую суть, а проспективные предшественники LEC сохраняют экспрессию гена маркера BEC, неспособны покидать вены (Wigle and Oliver, 1999; Wigle et al., 2002; Yang et al., 2012). PROX1 также достаточен для спецификации LEC судьбы; как in vitro, когда Prox1 вносится в BECs (Hong et al., 2002) , так и in vivo, когда эктопически экспрессируется в BECs с промотора Tie1 (Kim et al., 2010). Функция Sox18 остается не исследованной в лимфатическом развитии рыбок данио, но Prox1a (PROX1 гомологи удвоенные у рыбок данио) скорее всего играют роль в лимфатическом развитии у рыбок данио, поскольку его экспрессия коррелирует с ролью в эндотелии вен во время инициализации дорсальных отрастаний, а нокдаун Prox1a может приводить к отсутствию TD (Yaniv et al., 2006; Del Giacco et al., 2010; Tao et al., 2011; Cha et al., 2012). Fig. 2.

Процесс спецификации судьбы LEC у мышей также использует активность COUP-TFII (NR2F2 - Mouse Genome Informatics), транскрипционный фактор orphan ядерного рецептора. COUP-TFII экспрессируется во всех венах и является непосредственным партнером по связыванию PROX1 (Lee et al., 2009; Yamazaki et al., 2009). COUP-TFII работает совместно с PROX1, чтобы инициировать экспрессию известных генов мишеней и также выполняет самостоятельную роль в инициации экспрессии PROX1 в венах (Srinivasan and Oliver, 2011). Уровень кооперативного контроля ранней индукции судьбы LEC является интригующим и остается непонятным, могут ли COUP-TFII и SOX18 также кооперировать во время этого процесса. Важно, что ключевые транскрипционные факторы выполняют разные и комбинаторные функции в ходе всего эмбрионального и пост-эмбрионального лимфангиогенеза. SOX18 экспрессируется только во время инициальной стадии индукции экспрессии PROX1 и возможно не играет роли в поддержании качественных характеристик LEC (Francois et al., 2008). PROX1 необходим как для спецификации LEC, так и для поддержания характеристик LEC у взрослых (Johnson et al., 2008), но COUP-TFII, хотя и важен для спецификации, не нужен для поддержания характеристик после ранних эмбриональных стадий (Johnson et al., 2008; Lin et al., 2010). У рыбок данио и Xenopus, как было установлено, COUP-TFII важен для формирования лимфатической сети (Aranguren et al., 2011). Транскрипционные взаимодействия важны для развития лимфатических сосудов (Oliver and Srinivasan, 2010).

Сигналы, ответственные за раннюю поляризацию экспрессии генов во время спецификации в венах, остаются загадочными. Исследования выявили роль передачи сигналов Notch, стоящей выше PROX1 во время лимфангиогенеза млекопитающих in vitro и при нео-лимфангиогенезе у взрослых, но роль этого пути в контексте эмбриональной индукции судьбы LEC, остается неясной (Kang et al., 2010; Niessen et al., 2011; Zheng et al., 2011). У рыбок данио в отсутствие Delta-like ligand 4 (Dll4), клетки, которые покидают вены во время вторичного отрастания, все приобретают качественные особенности BEC и дают исключительно vISVs (Geudens et al., 2010). Однако, нокаут Rbpj (Suh) у мышей, который кодирует первичный медиатор канонической передачи сигналов Notch, в лимфатических предшественниках (Prox1:CreERT2) не обнаруживает дефектов спецификации LEC (Srinivasan et al., 2010). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить степень функционирования Notch во время индукции LEC судьбы in vivo.

Molecular mechanisms underlying LEC sprouting

После спецификации LEC предшественники отделяются от вен и начинают мигрировать в виде потоков и кластеров клеток, чтобы дать самые ранние лимфатические структуры. После выхода из вен, LECs приобретают дополнительные специфичные лимфатические маркеры и прогрессивно подавляют маркеры BEC (Wigle et al., 2002; Hagerling et al., 2013). Выход клеток предшественников LEC из вен зависит от лиганда VEGFC (vascular endothelial growth factor C). VEGFR3 (FLT4 - Mouse Genome Informatics), рецептор для VEGFC, экспрессируется всеми эндотелиальными клетками (ECs), но особенно высокие уровни в PROX1-позитивных лимфатических предшественниках и ангиогенных кровеносных сосудах (Kukk et al., 1996; Tammela et al., 2008). Vegfr3-нулевые мыши погибают во время эмбриогенеза, благодаря своей критической роли для VEGFR3 во время сердечно-сосудистого развития (Dumont et al., 1998). Гетерозиготы по мутациям, инактивирующим киназу, как в мышином Vegfr3, так и в VEGFR3человека приводят к драматическим дефектам лимфатических сосудов; Chy мыши обнаруживают лимфатические отеки и хилёзные асциты (выход из сосудов напоминающего молоко chyle в брюшную полость, обусловленный дефектами лимфатических сосудов), возникновение лимфатических отёков наблюдается и у пациентов, несущих инактивирующие VEGFR3 мутации (Irrthum et al., 2000; Karkkainen et al., 2000; Karkkainen et al., 2001) (see also Table 1). Эти фенотипы могут быть обусловлены частично доминантно-негативным эффектом мутантных VEGFR3 рецепторов (Dumont et al., 1998; Karkkainen et al., 2001). VEGFC экспрессируется в яремной мезенхиме, где впервые формируются лимфатические мешки (Fig. 2), а у Vegfc-нулевых мышей, PROX1-позитивные клетки неспособны отрастать от CVs (Karkkainen et al., 2004). Исследования на рыбках данио показали, что Vegfc и Vegfr3 действуют высоко законсервированным образом и регулируют дорсальные отрастания от CV у эмбрионов рыбок данио (Kuchler et al., 2006; Yaniv et al., 2006; Hogan et al., 2009b).

Table 1.

Lymphoedema and developmental genes

Др. пертурбации VEGFC/VEGFR3 пути также влияют на лимфатические разрастания. Jeltsch et al. показали, что избыточная экспрессия VEGFC у мышей индуцирует избыточный лимфангиогенез (Jeltsch et al., 1997), тогда как экспрессия растворимой VEGFR3 ловушки лиганда блокирует лимфангиогенез (Makinen et al., 2001). Многие др. факторы, которые влияют на лимфангиогенез у мышей, известны как модуляторы передачи сигналов VEGFC/VEGFR3. Neuropilins являются VEGFR ко-рецепторами, которые соединяются с VEGFs (Soker et al., 1998; Makinen et al., 1999; Wise et al., 1999). Neuropilin 2 (Nrp2) присутствует на высоких уровнях в рано мигрирующих LECs у эмбрионов мышей (Fig. 1B), а Nrp2 мутантные мыши обнаруживают разрушенные, гипопластичные лимфатические сосуды (Yuan et al., 2002). Потеря функции Nrp2 оказывает ранее и выраженное влияние во время лимфатического развития у рыбок данио и Xenopus, у них описано взаимодействие с дополнительным регулятором раннего лимфангиогенеза, Synectin (также известным как Gipc1), которое способствует отрастанию LEC предшественников от вен (Hermans et al., 2010). Ephrin B2 способен модулировать передачу сигналов посредством VEGFR3, контролируя интернализацию VEGFR3 рецепторных комплексов (Wang et al., 2010); потеря функции ephrin B2 у мышей ассоциирует с дефектами развития лимфатических сосудов (Makinen et al., 2005; Wang et al., 2010). Др. рецептор, β1-integrin, действует путем регуляции c-Src (CSK - Mouse Genome Informatics), чтобы модулировать внутриклеточное фосфорилирование киназного домена VEGFR3. Collagen I может также влиять на это событие передачи сигналов, возможно действуя посредством β1-integrin (Galvagni et al., 2010; Planas-Paz et al., 2012; Tammela et al., 2011). Кроме того, Rho GTPase RAC1 регулирует уровни VEGFR3 во время отпочкования LEC и миграции от CVs (D'Amico et al., 2009). Наконец, транскрипционный фактор T-box 1 (TBX1) активирует транскрипцию Vegfr3 и регулирует морфогенез лимфатических сосудов (Chen et al., 2010). Итак, эта серия находок подчеркивает важность точной модуляции активности пути VEGFC/VEGFR3 для роста и развития лимфатических сосудов (Fig. 3).

Менее изучены пути, которые влияют на ранние стадии миграции LEC и образование лимфатического мешка, включая пути adrenomedullin и CCBE1. Мыши, несущие целенаправленные мутации Adm (adrenomedullin), Ramp2 или Calcrl (рецепторы для adrenomedullin), обнар4уживают гипопластический яремный лимфатический мешок и выраженные подкожные отеки (Fritz-Six et al., 2008). Механизм, с помощью которого передача сигналов adrenomedullin регулирует развитие лимфатических сосудов, остается неясным, предполагается, что adrenomedullin способствует пролиферации LEC (Fritz-Six et al., 2008). Также мало известно о молекулярном механизме, с помощью которого действуют недавно идентифицированный коллаген и calcium binding EGF-domain containing protein 1 (CCBE1). CCBE1 важен для эмбрионального лимфангиогенеза у рыбок данио и мышей (Hogan et al., 2009a; Bos et al., 2011) и он мутантен при синдроме первичного лимфатического отека у человека (Alders et al., 2009; Connell et al., 2010) (see also Table 1). CCBE1 является секретируемым белком и фенотипы потери функции очень сильно напоминают таковые у Vegfc и Vegfr3 рыбок данио и VEGFC у мышей (Hogan et al., 2009a; Bos et al., 2011). Предполагается, что роль в этом пути, Ccbe1/Vegfc, т.к. нокаут двойных гетерозигот у мышей недавно показал наличие синергичных фенотипических взаимодействий (Hagerling et al., 2013), но нужны дополнительные работы, чтобы понять механистическое значение этих генетических взаимодействий.

Важно, что многие ключевые регуляторы развития, описанные выше необходимы для развития лимфатической сети у человека. Мутации, которые нарушают развитие лимфатических сосудов или их функцию, ведут преимущественно к (наследуемым) формам лимфатических отёков. Table 1.

Induction and guidance of lymphangiogenesis by cell extrinsic factors

Недавняя работа показала, что взаимодействия мигрирующих LECs со своим окружением играет ключевую роль во время развития лимфатических сосудов. Несколько тканей, как известно, участвуют в этом процессе.

Neurons

Миграция LECs, как было установлено, осуществляется с помощью треков соседних нейронов во время лимфатического развития (Navankasattusas et al., 2008; Lim et al., 2011) (Fig. 4A). У рыбок данио, путь линии двигательных нейронов, который используется мигрирующими PLs в HM и генетическое истощение моторных нейронов с использованием нокдауна Olig2 и Islet1 или физического устранения этих клеток, нарушает миграцию PL и последующее образование TD (Lim et al., 2011). Следовательно, соотв. наведение и миграция двигательных нейронов в HM является предварительным условием миграции PL. Netrin 1a обеспечивает миграцию этих нейронов, действуя из соседних мышечных пионерских клеток и передавая сигналы посредством своего рецептора Dcc (Deleted in colorectal cancer), экспрессирующегося в двигательных нейронах (Lim et al., 2011). После истощения или netrin 1a или dcc, предшественники LEC отрастают от вен и распространяются дорсально, но неспособны поворачивать латерально и распространяться спереди назад в остальную часть HM. Сходным образом, Netrin 1a рецептор Unc5b (Wilson et al., 2006; Navankasattusas et al., 2008) также фенокопирует истощение netrin 1a и dcc, подтверждая этот механизм ведения. Сигнальные пути, обеспечивающие взаимодействие между PLs и двигательными нейронами остаются неизвестными. Fig. 4.

Blood vasculature

Доказательством тканевого ведения миграции лимфатических предшественников у рыбок данио получены в наблюдениях, что ISLVs всегда образуются вдоль arterial intersomitic vessels (aISVs) (Bussmann et al., 2010) (Fig. 4B). Ранее наблюдалось, что инициальное выделение и миграция лимфатических предшественников в HM (32-48 hpf) происходит независимо от артерий у plcg1y10 мутантов, которые лишены артерий (Lawson et al., 2003). Однако, у kdrlhu5088 мутантных эмбрионов, у которых некоторые aISVs неспособны формироваться вдоль дорсального аспекта эмбриона, обнаруживается дефектная миграция PLs прочь от HM на более поздних стадиях развития, особенно в регионах эмбриона, лишенных aISVs (Bussmann et al., 2010). Наблюдение вживую и тщательные количественные оценки в этом исследовании идентифицировали строгую, почти исключительную ассоциацию между мигрирующими PLs и aISVs, как только PLs покидают HM, начиная со ст. 60 hpf и далее. Хотя механизм, ответственный за этот процесс был первоначально неясен, роль передачи сигналов хемокина недавно проявила себя (Cha et al., 2012) (Fig. 4A,B). Хемокиновые рецепторы cxcr4a и cxcr4b экспрессируются в мигрирующих лимфатических предшественниках. Их лиганды cxcl12a и cxcl12b экспрессируются в клетках, которые выстилают изменяющийся путь, используемый мигрирующими клетками PLs по эмбриону: cxcl12a в мышцах HM, где он необходим для миграции PLs в регион HM, а cxcl12b в артериальных BECs, проводя PLs когда они последовательно мигрируют из HM вдоль артерий. Это исследование подтверждает, что повторяющиеся хемокиновые сигналы от многих, соседних тканей регулируют прогрессивную миграцию PLs через среду эмбрионов рыбок данио и предоставляют механистическое объяснение локализации лимфатических сосудов вдоль артерий (Cha et al., 2012). Поддерживая, скорее всего, передачу хемокиновых сигналов во время лимфангиогенеза, CXCR4 экспрессируется в LECs млекопитающих, а Cxcl12a способствует миграции LEC в культуре (Zhuo et al., 2012). Однако интересно отметить, что фенотипы knockdown и мутантных рыбок данио не полностью пенетрантны, это вообще-то указывает на то, что существует перекрывание внутри путей хемокинов или с др. ещё неописанными факторами ведения.

Haematopoietic cells

Макрофаги обладают тесной пространственной локализацией вместе с лимфатическими сосудами у эмбрионов мышей и, как было установлено, влияют на формирование паттерна лимфатических сосудов во время развития (Bohmer et al., 2010; Gordon et al., 2010). PU.1 (Sfpi1 - Mouse Genome Informatics) и Csf1r мутантные мыши в основном лишены макрофагов, обнаруживают гиперпластичные кожные лимфатические сосуды и гипопластичные яремные лимфатические мешки (Gordon et al., 2010). Миелоидные клетки, в особенности те, что экспрессируют цитоплазматическую тирозин киназу SYK, как было установлено, усиливают лимфангиогенез за счёт продукции способствующих лимфангиогенезу стимулов, включая VEGFC, VEGFD (FIGF - Mouse Genome Informatics), MMP2 и MMP9 (Bohmer et al., 2010; Gordon et al., 2010). Syk мутантные мыши обладают повышенными количествами макрофагов в коже эмбрионов и драматической гиперплазией кожных лимфатических сосудов (Bohmer et al., 2010). Можно предположить, что макрофаги могут откладывать сигналы наведения или факторы, ремоделирующие матрикс, когда они мигрируют через эту ткань, прокладывая путь для развивающейся лимфатической системы. Однако необходимы дальнейшие исследования для выяснения точной роли макрофагов в развитии лимфатической системы.

Тромбоциты, как было показано рядом групп, играют роль в обеспечении отделения лимфатических сосудов от кровеносных сосудов (Bertozzi et al., 2010; Carramolino et al., 2010; Uhrin et al., 2010). CLEC-2 (CLEC1B - Mouse Genome Informatics), C-type лектиновый рецептор на тромбоцитах, которые соединяется с podoplanin на LECs, является важным для агрегации тромбоцитов в соединениях между развивающимися лимфатическими мешками и CVs (Bertozzi et al., 2010; Suzuki-Inoue et al., 2010; Osada et al., 2012). Мыши дефицитные по мегакариоцитам, тромбоцитам или агрегации тромбоцитов или с мутациями разрушающими podoplanin, O-glycosylation (ключевая посттрансляционная модификация podoplanin), CLEC-2 или передачу сигналов SLP-76 (LCP2-Mouse Genome Informatics) в тромбоцитах, все они обнаруживают заполненные кровью лимфатические сосуды (Fu et al., 2008; Uhrin et al., 2010; Carromolino et al., 2010; Bertozzi et al., 2010; Suzuki-Inoue et al., 2010; Debrincat et al., 2012; Osada et al., 2012), это отражает аберрантное сохранение соединений между кровеносными и лимфатическими сосудами. Осуществляется ли разделение двух сосудистых компартментов исключительно тромбоцитами, действующими как физический барьер 'закупоривающий' отверстия между венами и лимфатическими мешками и лимфатическими сосудами или как взаимодействие между тромбоцитами и LEC, приводящее к нижестоящим сигнальным событиям, важным для разделения кровеносных и лимфатических сосудов, еще предстоит установить. Итак, эти данные представляют клеточный и молекулярный механизм для объяснения ранних наблюдений, что передача сигналов посредством оси Syk/SLP-76/PLC? в гематопоэтических клетках важна для разделения кровеносной и лимфатической сосудистой сети (Abtahian et al., 2003; Sebzda et al., 2006; Ichise et al., 2009).

Mechanical effects

Дополнительно, внешний по отношению к клеткам сигнал, участвующий в регуляции лимфатического развития у эмбрионов, это механические силы, осуществляемые повышенным давлением тканевой жидкости (Planas-Paz et al., 2012). Planas-Paz с коллегами показали, что давление тканевой жидкости увеличивается в дорсальном interstitium эмбрионов мышей на ст. E11.0, как пространственно, так и по времени, коррелируя с индукцией выростов лимфатических сосудов из лимфатических мешков. В серии исследований было установлено, что увеличение или снижение интерстициального давления регулирует выросты лимфатических сосудов из лимфатических мешков (Planas-Paz et al., 2012). На молекулярном уровне, активация β1-integrin коррелирует с высоким интерстициальным давлением, а отсутствие β1-integrin, снижается фосфорилирование тирозина VEGFR3, что согласуется с известным c-Src-обусловленным общением между β1-integrin и VEGFR3 (Fig. 3) (Galvagni et al., 2010). Эти исследования пришли к заключению, что высокое интерстициальное давление механически вызывает β1-integrin-обусловленное фосфорилирование киназного домена VEGFR3, чтобы модулировать активацию VEGFR3 и индукцию эмбрионального лимфангиогенеза (Planas-Paz et al., 2012).

Итак, лимфатическая сеть высоко контролируемый процесс с использованием ряда последовательных тканеспецифичных сигналов. Вместе эти сигналы запускают миграцию LEC и контролируют передвижение LECs в изменяющейся эмбриональной среде.

Forming functional lymphatic vessels

Vessel remodelling and maturation

На ст. E14.5 у мышей лимфатическая сеть расширяется по всему эмбриону, чтобы сформировать примитивные лимфатические сплетения. Начиная со ст. E15.5 и продолжаясь постнатально, первичная сеть подвергается ремоделированию, чтобы сформировать зрелую лимфатическую сеть, состоящую из поверхностных лимфатических капилляров или инициальных лимфатических сосудов, сосудов, предваряющих коллекторы, и собирающие лимфатические сосуды (Norrmen et al., 2009) (Box 1). Инициальные лимфатические сосуды представляют собой абсорбирующий компонент лимфатической сети и слепо оканчивающиеся сосуды характеризуются одиночным слоем перекрывающихся 'дубового листа' формы ECs. Эти ECs слипаются др. с др. посредством прерывистых 'кнопко-подобных' соединений и закрепляются во внеклеточном матриксе (ECM) посредством специализированных закрепляющих филамент (Leak and Burke, 1968). Инициальные лимфатические сосуды имеют небольшую базальную мембрану и лишены поддерживающего слоя перицитов. Напротив, собирающие сосуды, в которые дренируются инициальные лимфатические сосуды, обладают непрерывными 'подобными застежке молнии' соединениям между эндотелиальными клетками, прочный слой базальной мембраны, покрытие из перицитов и присутствие внутри просвета клапанов, всё это облегчает транспорт лимфы (Baluk et al., 2007).

Работы ряда лаб. пролили свет на молекулярные пути, которые важны для созревания первичного лимфатического сплетения в иерархическую сеть лимфатических сосудов. Анализ мышей, дефицитных по forkhead box protein C2 (Foxc2), выявил, что хотя инициальные стадии развития лимфатических сосудов протекают нормально, но инициальные лимфатические сосуды приобретают эктопическую базальную мембрану и покрыты перицитами (Petrova et al., 2004). Кроме того, лимфатические собирающие сосуды сохраняют маркеры, характерные для инициальных лимфатических сосудов и неспособны формировать клапаны. Эти данные демонстрируют, что FOXC2 играет важную роль в разделении между фенотипами инициальных и собирающих лимфатических (Petrova et al., 2004). Более того, кооперация между FOXC2 и nuclear factor of activated T-cells c1 (NFATc1) необходима для приобретения качественных особенностей собирающих сосудов; NFATc1, как было установлено, соединяется с FOXC2-связывающим энхансером в LECs (Norrmen et al., 2009). Nfatc1^-/- мыши и эмбрионы, обработанные с помощью фармакологического ингибитора передачи сигналов NFAT фенокопируют дефекты ремоделирования лимфатических сосудов, наблюдаемые у мышей Foxc2^-/-.

Ephrins и родственные им Eph тирозин киназные рецепторы устанавливают регуляторы наведения аксонов в нервной системе (rev. Flanagan and Vanderhaeghen, 1998) и развития кровеносных сосудов (reviewed by Kuijper et al., 2007), и также играют ключевую роль в созревании лимфатической системы (Makinen et al., 2005). Мыши, лишенные C-terminal PDZ домена в ephrin B2 обнаруживают гиперпластичные собирающие лимфатические сосуды и отсутствие в просветах клапанов и неспособность первичного лимфатического сплетения перестраиваться в иерархическую сеть (Makinen et al., 2005). Тогда как Eph receptor B4 (EphB4) присутствует как в инициальных, так и собирающих лимфатических сосудах, ephrin B2 присутствует избирательно в собирающих лимфатических сосудах, подтверждая механизм, с помощью которого ephrinB2-EphB4 взаимодействия вносят вклад в становление различий характеристик между инициальными и собирающими лимфатическими сосудами (Makinen et al., 2005).

Путь angiopoietin/Tie, который считается ключевым регулятором ремоделирования и созревания кровеносных сосудов (rev. Augustin et al., 2009), также важен и для ремоделирования лимфатических сосудов. Мыши, гипоморфные по Tie1, обнаруживают расширенные и дезорганизованные лимфатические сосуды с нарушенной способностью дренирования лимфы (D'Amico et al., 2010; Qu et al., 2010), а мыши, дефицитные по гену, кодирующему TIE2 (TEK - Mouse Genome Informatics) лигнад, Angpt2, обнаруживают аномальную архитектуру лимфатических сосудов, аберрантное ремоделирование инициальных поверхностных капиллярных сплетений и неспособность к образованию в просветах клапанов (Gale et al., 2002; Dellinger et al., 2008).

Lymphatic valve formation

Внутрипросветные клапаны определяющий признак собирающих лимфатических сосудах и являются обязательными для однонаправленного транспорта лимфы у млекопитающих; неспособность этих специализированных структур формироваться или функционировать ведут к лимфатическим отекам (see Table 1). Зрелые лимфатические клапаны обычно двухстворчатые; они представлены двумя створками клапана, каждая состоит из стержня в виде центральной соединительной ткани, выстланной слоем ECs (Lauweryns and Boussauw, 1973; Navas et al., 1991; Bazigou et al., 2009). Несмотря на обнаружение клинической важности лимфатических клапанов, молекулярные механизмы, регулирующие их морфогенез ( Bazigou and Makinen, 2012) только начинают выявляться. Большинство из того что известно, получено в результате обширного анализа развивающихся эмбриональных мезэнтерических лимфатических сосудов как у мышей дикого типа, так и у генетически модифицированных мышей с использованием высокого разрешения техники получения изображений (summarised below and in Fig. 5).

Инициация развития лимфатических клапанов у мышиных эмбрионов может быть впервые выявлена на ст. ~E15.5, когда PROX1, FOXC2 и GATA2 оказываются видимыми на высоких уровнях внутри дискретных клеток кластеров в инициальном лимфатическом сплетении (Bazigou et al., 2009; Norrmen et al., 2009; Kazenwadel et al., 2012; Sabine et al., 2012). GATA2, транскрипционный фактор zinc finger, регулирует экспрессию как Prox1, так и Foxc2 in vitro в культивируемых LECs, и может, следовательно, представлять собой выше расположенный регулятор развития лимфатических клапанов (Kazenwadel et al., 2012). Хотя 'пусковой механизм' морфогенеза лимфатических клапанов остается неясным, недавняя элегантная работа Sabine с коллегами продемонстрировала, что воздействие LECs на нарушенный ток регулирует уровни экспрессии ключевых молекул, включая FOXC2, которые важны для развития лимфатических клапанов (Sabine et al., 2012). То, что лимфатические клапаны часто располагаются в местах бифуркаций сосудов (Bazigou et al., 2009; Sabine et al., 2012) подтверждает гипотезу, согласно которой динамика тока жидкости и сдирающий стресс являются важными факторами в определении, где в конечном итоге будут сформированы клапаны. where valves ultimately form. Соотв. инициация образования лимфатических клапанов у эмбрионов мышей коррелирует с началом тока лимфы (Sabine et al., 2012). Недавняя работа показала, что ECs располагаются непосредственно по соседству с венозными и лимфатическими клапанами, демонстрируя определенные морфологические характеристики; ECs непосредственно выше клапанов удлинены, тогда ниже клапанов превалируют округлые ECs (Bazigou et al., 2011). Кстати, молекулярные игроки, ответственные за трансдукцию механосенсорных сигналов, которые инициируют развитие клапанов, неизвестны.

Повышенные уровни PROX1 и FOXC2 в проспективных клетках, формирующих клапаны, в комбинации с осциллирующими сдирающими стрессами, активируют два нижестоящих регулятора морфогенеза клапанов: connexin 37 (CX37; GJA4 - Mouse Genome Informatics) и передачу сигналов calcineurin/NFAT. CX37 является белком щелевых соединений, критическим для формирования кольцеобразных сужений ECs в ранних развивающихся клапанах, а передача сигналов calcineurin (CNB1; PPP3R1 - Mouse Genome Informatics) регулирует транслокацию в ядро NFATc1, чтобы контролировать демаркацию территории лимфатического клапана (Norrmen et al., 2009; Kanady et al., 2011; Sabine et al., 2012). Будучи специфицированными клетки, формирующие клапаны, подвергаются переходу из слущивающихся в клетки кубовидной морфологии, переориентируются перпендикулярно продольной оси сосуда и выпячиваются в просвет сосуда (Sabine et al., 2012; Bazigou, 2009). Одновременно с перестройкой клеток компоненты ECM, включая laminin-?5, collagen IV и EIIIA сплайс изоформу fibronectin (FN-EIIIA), откладываются, а экспрессия рецептора слипчивости клетки-матрикс, integrin-?9, повышается в клетках, формирующих клапаны (Bazigou et al., 2009; Norrmen et al., 2009). Как integrin-?9, так и его лиганд, FN-EIIIA, являются критическими для развития створок клапанов; мыши, у которых любой из этих генов был инактивирован, обнаруживали аномальные створки клапанов (Bazigou et al., 2009). Молекула ведения аксонов SEMA3A, экспрессируется в лимфатических сосудах, недавно было предположено, что она регулирует образование створок клапанов за счет коммуникаций с клетками, формирующими клапаны, экспрессирующими semaphorin рецепторы NRP1 и plexin A1 (Bouvree et al., 2012; Jurisic et al., 2012). Кроме того, SEMA3A, как полагают, поддерживает регионы клапанов в виде зон 'свободных от гладкомышечных клеток' путем отталкивания гладкомышечных клеток, которые экспрессируют NRP1 рецептор, прочь от клапанов (Bouvree et al., 2012; Jurisic et al., 2012). Клетки, формирующие клапаны, обладают определенными молекулярными и морфологическими профилями по сравнению с соседними LECs, не являющихся клапанами; они обнаруживают повышенные уровни маркеров соединений PECAM1 и VE-cadherin, пониженную экспрессию LYVE1 и NRP2, и обогащены специфическими коннексинами [CX37, CX43 (GJA1) и CX47 (GJC2)] (Kanady et al., 2011; Bouvree et al., 2012; Sabine et al., 2012). CX47 представлен в зрелых лимфатических клапанах, тогда как CX37 и CX43 дифференциально расположены на створках клапанов: CX37 на нижестоящей стороне клапана, а CX43 на вышестоящей стороне (Kanady et al., 2011; Sabine et al., 2012). Интересно, что градированная экспрессия PROX1 и FOXC2 была описана на каждой из сторон развивающихся клапанов во время инициальной стадии морфогенеза клапанов, подтверждая их роль в регуляции последующей ориентации образования лимфатических клапанов (Sabine et al., 2012).

Трансмембранный лиганд ephrin B2 также важен для формирования и поддержания лимфатических клапанов (Makinen et al., 2005), хотя точный механизм, с помощью которого функции ephrin B2 и рецепторов, которые обеспечивают его активность, пока остаётся неизвестным. Недавно было показано, что ephrin B2 регулирует интернализацию VEGFR3 (Fig. 3) (Wang et al., 2010), который также присутствует на повышенных уровнях в развивающихся и зрелых лимфатических клапанах (Petrova et al., 2004; Norrmen et al., 2009). Необходимы дальнейшие работы по выяснению точных ролей ephrin B2 и VEGFR3 в морфогенезе лимфатических клапанов.

Важным моментом является то, что морфогенетический процесс развития клапанов осуществляется сходным образом, что и в венах; гены, важные для морфогенеза лимфатических клапанов, также играют ключевую роль в формировании венозных клапанов (Bazigou et al., 2011; Munger et al., 2013). Более того, Srinivasan and Oliver недавно продемонстрировали, что доза Prox1 является критической для формирования эмбриональных lymphovenous клапанов, которые отделяют развивающуюся лиматическую сеть от яремных и подключичных вен (Srinivasan and Oliver, 2011). FOXC2 и PROX1 также присутствуют на высоких уровнях в этих же клапанах (Srinivasan and Oliver, 2011). Эти исследования подчеркивают общие пути, важные для развития венозных, лимфовенозных и лимфатических клапанов и подтверждают, что они обладают общими молекулярными механизмами, управляющими морфогенезом клапанов.

Conclusions and future perspectives

In recent years, we have seen a rapid expansion of knowledge in our understanding of the mechanisms by which the lymphatic vasculature emerges and differentiates in the vertebrate embryo. From the molecular control of LEC fate specification and maintenance, to selective modulation of the VEGFC/VEGFR3 signalling pathway, flow induction of lymph sac outgrowth and valve formation, and the identification of tissue-specific guidance cues, a picture has begun to emerge of a non-linear process in which morphogenesis and molecular regulation are tightly linked and co-dependent. As often seems to be the case in modern developmental biology, the ability to observe phenotypic changes with increased resolution and in new developmental contexts leads to new insights, directions and paradigms. Thus, molecular events that programme LEC identity occur concomitantly with morphological changes, LEC precursors are constantly communicating with their neighbours along their pathway through the embryo and physical forces are capable of inducing molecular changes that drive lymphangiogenesis and differentiation. How tightly are molecular and morphological processes linked? How influential and widespread are mechanical forces in regulating lymphatic development and the molecular processes underpinning it? Is our current view of distinct transcriptional programming and growth factor responsiveness too inflexible and does a level of cross-collaboration exist? Recent discoveries of new molecular regulators of lymphangiogenesis appear to signal a level of complexity that remains to be fully dissected, but how many new pathways and processes remain undefined? Although much has been uncovered in recent years, it seems that a new set of questions have begun to emerge. Answering some of these questions will not only inform our understanding of a fascinating biological process, but will be applicable to the generation of novel diagnostic tools and new therapeutics for the treatment of human lymphatic vascular pathologies, including lymphoedema, inflammatory diseases and metastasis.

Getting out and about: the emergence and morphogenesis of the vertebrate lymphatic vasculature Katarzyna Koltowska, Kelly L. Betterman, Natasha L. Harvey and Benjamin M. Hogan Development 2013 V.140, 1857-1870

Getting out and about: the emergence and morphogenesis of the vertebrate lymphatic vasculature
Katarzyna Koltowska, Kelly L. Betterman, Natasha L. Harvey and Benjamin M. Hogan
Development 2013 V.140, 1857-1870