В данном исследовании установлена всеобщая роль Fu в сборке центральной пары и ориентации ресничек в разных тканях со множественными ресничками. Важная информация о функции Fu и Kif27 также получена в исследованиях, которые выявили распределение в подвижных ресничках Fu and Kif27; Fu обнаруживается по всей ресничке, тогда как Kif27 концентрируется в основании реснички. Обнаружение Fu в подвижных ресничках является важной ступенью в направлении механистического понимания, как Fu контролирует конструкцию центральной пары. Мы также расширили анализ физических взаимодействий и показали, что Fu не только ассоциирует с кинезином Kif27, но и также с двумя белками центральной пары, Spag16 и Pcdp1. Итак, эти находки позволяют на предположить, что Fu функционирует в аксонеме реснички во время критической ступени конструкции центральной пары. Это создает основу для будущих исследований, чтобы понять, как Fu и Kif27 в подвижных ресничках облегчают программу конструкции центральной пары.

Fu и Kif27 могут участвовать в рекрутировании или активации белков центральной пары, таких как Spag16 и Pcdp1 в основании реснички и вдоль реснички. Альтернативно, Fu и Kif27 могут обеспечивать конструкцию центральной пары или посредством отличающихся механизмов или воздействуя на промежуточные ступени, которые соединяют Fu и Kif27. Каскад событий, стоящий ниже Fu/Kif27, который ведет к конструкции центральной пары, неизвестен и может нуждаться в Kif27-обеспечиваемом транспорте грузов и активации множественных мишеней за счет киназной активности Fu. Являются ли Kif27, Spag16 и Pcdp1 непосредственными субстратами для Fu киназы, предстоит проверить. Скорее всего, Fu взаимодействует с дополнительными структурными и не структурными компонентами в сборке центральной пары. Неясно, взаимодействует ли Fu с белками центральной пары одновременно или последовательно и воздействует ли Fu на др. стыковочные белки реснички, чтобы обеспечить их взаимодействия с белками центральной пары. Систематические исследования мишеней для Fu предоставят ключевую информацию в этих вопросах. Сходным образом, идентификация потенциальных грузов, переносимых с помощью Kif27 является критической для выявления молекулярных механизмов, с помощью которых гены Fu/Kif27 регулируют конструкцию и функцию подвижных ресничек.

В сравнении с др. реснитчатыми тканями цилиогенез в яйцеводах завист от действия гормонов и др. факторов. Реснитчатые и секреторные клетки в ампуле подвергаются последовательным циклам дифференцировка-дедифференцировка с каждым менструальным циклом (Verhage et al., 1997). Это ставит важный вопрос, как базовый процесс цилиогенеза подвижных ресничек связан с ткане-специфической гормональной регуляцией. Напр., было бы интересно исследовать, затрагивается ли экспрессия и функция Fu/Kif27 эстрогеном. Это может выявить дополнительный слой контроля, помимо общего процесса сборки центральной пары, обеспечиваемого с помощью Fu/Kif27 в тканях со множественными ресничками. Мы не продвинулись с создании системы клеточных культур для изучения цилиогенеза в яйцеводах. Тем не менее, в наших предыдущих исследованиях (Wilson et al., 2009), мы выявили экспрессию Fu и Kif27 на разных стадиях дифференцировки MTEC. Это д. указывать на то, что экспрессия Fu/Kif27 в подвижных ресничках яйцеводов, скорее всего, следует сходной временной последовательности.

Все идентифицированные гомологи Fu киназы у разных видов участвуют, по-видимому, в разных клеточных процессах, включая цитокинез у растений (Oh et al., 2005), хемотаксис у слизистой плесни (Tang et al., 2008) и цилиогенез подвижных ресничек у млекопитающих (Wilson et al., 2009). Не смотря на это, поразительно, что контроль базирующейся на микротрубочках активности Fu, по-видимому, является унифицированным механизмом во всех этих процессах. Это подразумевает, что информация, получаемая в исследованиях данных процессов д. быть информативной для понимания лежащих в основе молекулярных механизмов в др. процессах, в частности, в конструкции центральной пары. Эти исследования д. также пролить свет на взаимоотношения между несопоставимыми клеточными процессами, которые нуждаются в активности Fu.

Активность Drosophila Fu киназы была описана с использованием или экспрессии Fu в линиях клеток мух, или иммунопреципитации Fu (Shi et al., 2011; Zhang et al., 2011; Zhou and Kalderon, 2011). В соответствии с этим, фосфорилирование kinesin Cos2 мух (гомолог Kif7/27) зависит от интактных консервативных Fu киназных остатков (Ruel et al., 2007). Напротив, киназная активность Fu млекопитающих не была описана. Вообще-то, стабильные клеточные линии не предоставляют собственно клеточного контекста, необходимого, чтобы Fu млекопитающих стал активным. Альтернативно, Fu млекопитающих ауто-ингибирован (Eldar-Finkelman and Eisenstein, 2009) или он зависит от пока не установленной ступени активации, которая сходна в принципе с рядом идентифицированных киназ в семействе JNK или ERK (Ramaswamy et al., 1998; Elzi et al., 2001). Идентификация необходимых условий для активации Fu млекопитающих и Fu субстратов является критической ступенью в направлении понимания, как Fu контролирует сборку центральной пары.

Мало информации о молекулярных механизмах, которые управляют целенаправленной доставкой Fu и Kif27 в подвижные реснички. В этом отношении киназная активность Fu, по-видимому, необязательна для локализации Fu в подвижных ресничках, поскольку распределение в ресничках Fu^K33R, в котором консервативный остаток в киназном домене был элиминирован, сходен с таковым Fu дикого типа. Низкие уровни Fu были обнаружены в цитоплазме, помимо его локализации вдоль всей длины подвижной реснички, когда вызывали избыточную экспрессию с помощью трансдукции лентивирусом. Мы полагаем, что цитоплазматическая экспрессия Fu обусловлена системой избыточной экспрессии. Мы не достигли структурного разрешения, необходимого для выяснения распределения Fu в разных субкомпартментах (напр., в белковых проекциях центральной пары аппарата) подвижных ресничек. Для этого необходима продукция Fu антител, которые могут выявлять эндогенный Fu белок при ультраструктурном исследовании (Fisch and Dupuis-Williams, 2011; Shoemark and Hogg, 2013). Мы использовали коммерчески доступны Fu антитела и оказались неспособны выявить экспрессию эндогенного Fu. Интересно, что поскольку фактор Kif27, по-видимому, располагается в основании подвижной реснички, то эктопически экспрессируемый Kif27 может доставляться в кончик первичной реснички. Это может быть обусловлено разными партнерами Kif27 в первичных в противовес подвижным ресничкам, что влияет на динамику распределения и доставки Kif27. Напр., ограниченная локализация Kif27 в основании реснички может быть необходима для конструкции центральной пары. Напротив, хотя Kif7 располагается в основании первичной реснички и его интенсивность в кончике реснички увеличивается после активации пути Hh, Kif7 может быть обнаружен вдоль всей длины подвижной реснички, если эктопически экспрессируется в эпителии яйцеводов благодаря трансдукции с помощью лентивирусов. Аналогично, это может быть результатом отличающихся микроусловий в первичных в противовес подвижным ресничкам. Идентификация целевых последовательностей на Fu и Kif27 и взаимодействующих с ними белков с помощью протеомного подхода может предложить кандидатов, которые управляют локализацией и доставкой Fu и Kif27 в подвижные реснички. Это не только предоставит инструмент для манипуляций с распределением Fu и Kif27 в ресничке и тестирования функциональных последовательностей, но и сделает возможными механистические исследования конструкции центральной пары.

Молекулярные механизмы, с помощью которых киназа Fu контролирует ориентацию ресничек, неясны. Возможно, что Fu непосредственно или косвенно ассоциирует с цитоскелетом и регулирует ориентацию ресничек, поскольку кинезины, как известно, перемещаются по микротрубочкам (Vale, 2003; Lawrence et al., 2004; Miki et al., 2005). Альтернативно, кинезин Kif27 (и вообще-то Fu) может взаимодействовать с компонентами базального тельца или дополнительными структурами в контроле ориентации ресничек, т.к. фракция Kif27 локализуется на базальном тельце. Др. возможный механизм для рандомизированной ориентации ресничек в Fu мутантных яйцеводах это нарушение planar cell polarity (PCP) (Lawrence et al., 2007; Seifert and Mlodzik, 2007; Wang and Nathans, 2007; Zallen, 2007; Wallingford,2010). В этом сценарии, Fu регулирует компоненты планарной клеточной полярности и соотв. ориентацию базального тельца и реснички. Изучение эпителиев с многочисленными ресничками подтвердило, что белок Disheveled контролирует апикальное расположение базальных телец (Park et al., 2008), а путь PCP ориентирует реснички воздушных путей (Vladar et al., 2012). Это открывает возможность, что путь PCP может участвовать в ориентации ресничек во время цилиогнезеа подвижных ресничек яйцеводов. Наконец, вполне правдоподобно, что рандомизированная ориентация ресничек у Fu мутантов является следствием снижения тока жидкости (Marshall and Kintner, 2008). В таком случае потеря Fu д. приводить к ультраструктурным дефектам в подвижных ресничках, деформации скоординированных движений ресничек и к генерации направленного тока. В отсутствие направленного тока жидкости как сигнала, подвижные реснички неспособны ориентировать свои базальные тельца вдоль одной и той же оси. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения взаимоотношений или взаимодействий между этими механизмами в отличающихся тканях с множественными ресничками в клетках (Guirao et al., 2010; Kishimoto and Sawamoto, 2012).

Fused человека расположен на хромосоме 2q35. Поскольку отсутствуют мутации в гене Fu у пациентов с PCD, то мы полагаем, что пациенты, несущие мутации Fu, будут вызывать сппктр фенотипов, сходных с таковыми у мутантных Fu мышей. В соответствии с этим, пациенты с PCD с дефектами центральной пары в подвижных ресничках были описаны, как обнаруживающие проблемы с плодовитостью (Halbert et al., 1997). Картирование и секвенирование мутаций Fu у PCD пациентов не только сможет формально установить Fu мутации в качестве причины PCD у человека, но и также предоставит новую информацию о патофизиологии PCD и биологии ресничек.