В то время как важность store operated Ca2+ entry (SOCE) в невозбудимых клетках была установлена давно, важность его в скелетных мышцах стала очевидна совсем недавно. В данном исследовании мы расширили наше предыдущее исследование, чтобы показать, что внутренние хранилища Ca²⁺ из STIM1-/- мышечных трубок заметно уменьшены по сравнению с мышечными трубками дикого типа. Эти находки находятся в контрасте с др. исследованиями , когда альтерации SOCE в невозбудимых клетках оказывали минимальное воздействие на содержимое хранилищ Ca²⁺ (Mercer et al.,2006; Soboloff et al.,2006; Jousset et al.,2007). Чтобы устранить разногласия наших данных по скелетным миоцитам по сравнению с невозбудимыми клетками, мы показали, что молекулярное устройство SR/ER из мышечных трубок STIM1-/- отличается от такового дикого типа, поскольку содержание SERCA1 было существенно снижено, а SLN существенно увеличено. Эти находки позволяют нам предположить, что задержка в созревании SR/ER STIM1-/- мышечных трубок приводит к редукции размера хранилищ SR Ca²⁺ и изменению передачи миогенных сигналов. Фактически, мы подтвердили, что STIM1 и SLN координируют SOCE и, следовательно, формирование SR во время мышечной дифференцировки. Это исследование выявило новую роль STIM1-SOCE в мышечной дифференцировке и показало, что SLN является новым регулятором SOCE в мышцах.

SLN является небольшим один раз пронизывающим мембрану белком, расположенным в SR скелетных мышц. Поскольку SLN ингибирует активность SERCA1, то мы задались вопросом, будет ли SLN влиять на STIM1-зависимый SOCE. Мы показали, что избыточная экспрессия SLN в мышечных трубках восстанавливает SOCE, уменьшает содержание SR Ca²⁺ и задерживает мышечную дифференцировку. Чтобы объяснить эти находки, мы показали, что STIM1 снижает избыточную экспрессию SLN в мышечных трубках, а повторное внесение STIM1 в SLN мышечные трубки может устранять дефекты в SOCE. Итак, наши находки согласуются с моделью, в которой SOCE чётко скоординировано во время различных фаз мышечного развития (Fig. 7). В подтверждение нашей модели, мы показали, что STIM1 и SLN экспрессируются в скелетных мышцах в виде специфических временных паттернов: SLN экспрессируется в ранних эмбриональных мышцах, тогда как STIM1 экспрессируется на поздних стадиях плодных мышц (E15.5) и в постнатальных мышцах. Поэтому мы предположили, что SLN блокирует наполнение SR хранилищ во время ранних фаз миогенеза, это может служить для предупреждения перегрузки Ca²⁺ и отсрочки мышечной дифференцировки вплоть до поздних стадий. Напротив. во время постнатального развития мышц SLN ограничивается в волокнах в мышцы soleus и STIM1-зависимое SOCE возникает, чтобы заполнить SR хранилища и способствовать мышечной дифференцировке.

Figure 7. Regulation of calcium signaling by sarcolipin (SLN) and stromal interaction molecule 1 (STIM1) during muscle differentiation. Embryonic muscle expresses high levels of SLN and relatively low levels of STIM1 resulting in decreased sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ store content and reduced store operated calcium entry (SOCE). In adult muscle, SLN expression is attenuated and STIM1 is up-regulated, resulting in a mature SR with increased SR Ca2+ store content and fully intact SOCE.

Чтобы лучше понять SLN/STIM1 взаимоотношения, мы тестировали нашу модель с культивируемыми миобластами и установили, что избыточная экспрессия SLN в мышечных трубках ограничивает вступление Ca²⁺ вследствие истощения хранилищ, тогда как мышечные трубки, экспрессирующие shRNA плазмиду для SLN демонстрируют более значительное SOCE, чем в контроле. Эти результаты показывают, что влияние SLN на передачу сигналов Ca²⁺ может использовать не только ингибирование активности SERCA1, но и также размер и функцию пула SR Ca²⁺ путем изменения экспрессии STIM1. Эти результаты согласуются с известной функцией SLN в предсердных и скелетных мышцах (MacLennan,2000; Minamisawa et al.,2003; Babu et al.,2007a). Фактически, предсердия, SLN-/- мышей обладают более значительными SR Ca²⁺ хранилищами и усиливают контрактильность (Babu et al.,2007b). Напротив, SLN трансгенез в сердце и скелетных мышцах нарушает способность SERCA1/2 заполнять внутренние хранилища, приводящее к продолжительной преходящей и нарушенной Ca²⁺ контрактильности (Asahi et al.,2003,2004). В данном нашем исследовании мы показали, что SLN-мышечные трубки обнаруживают заметно нарушенную передачу сигналов Ca²⁺. Напр., KCl-деполяризация SLN-мышечных трубок ведет к временному появлению Ca²⁺ у уменьшенной амплитудой, но удлиненной продолжительностью по сравнению с мышечными трубками дикого типа. Эти результаты указывают на то, что SLN удерживает эффективно SERCA1 от повторной секвестрации Ca²⁺ в SR/ER хранилищах. Более того, мы показали, что снижение экспрессии STIM1 нарушает активацию SOCE в SLN-мышечных трубках. Мы полагаем, что изменения в передаче сигналов Ca²⁺ за счет избыточной экспрессии SLN задерживают мышечную дифференцировку, как показывают исследования экспрессии мышце-специфических генов.

Мы полагаем, что фундаментальная роль SOCE в мышцах координирует Ca²⁺/calmodulin-зависимые программы экспрессии генов, управляемые c помощью CamKII, calcineurin и возможно calmodulin-binding transcription activator (CAMTA) семейством транскрипционных факторов (Han et al.,2006; Song et al.,2006). Фактически, STIM1-зависимое SOCE необходимо для восполнения SR Ca²⁺ хранилищ после повторяющейся нейро-мышечной активности (Launikonis and Rios,2007). Сигнальные молекулы, такие как CamKII и calcineurin должны затем интерпретировать изменения в частоте осцилляций Ca²⁺, чтобы активировать Ca²⁺-зависимую экспрессию генов. Дефицитные по STIM1 мышечные трубки, которые обнаруживают дефекты в повторяющихся передачах сигналов Ca²⁺, обнаруживают нарушения передачи сигналов calcineurin/NFAT (Stiber et al.,2008). Кстати, мы установили, что SLN был активирован в STIM1-/- мышцах и может представлять собой маркер для незрелых скелетных мышц. Интересно, что SLN-мышечные трубки обладают пониженной экспрессией STIM1, пониженным SOCE и задержкой1 мышечной дифференцировки. Если всё это учесть, то эти результаты согласуются с идеей, что SLN ограничивает SOCE во время ранних фаз дифференцировки, чтобы предупредить преждевременную дифференцировку мышц. Мы интерпретировали это исследование как доказательство, что STIM1-/- мыши обнаруживают задержку постнатального развития мышц.

Увеличение вступления Ca²⁺ посредством SOCE может выступать также в качестве причины перегрузки Ca²⁺ при некоторых отличающихся формах мышечных дистрофий (Boittin et al.,2006; Edwards et al.,2010). Аномальное вступление Ca²⁺ активирует calpains, Ca2+-зависимые протеазы, которые вносят вклад в дегенерацию дистрофичных мышц. Такое аномальное вступление Ca²⁺ характеризует как управляемые хранилища, так и участки, активированные в дистрофичных волокнах (Franco and Lansman,1990; Vandebrouck et al.,2002a). Фактически, SOCE контролируется c помощью STIM1, как недавно было установлено, активируется в mdx мышечных волокнах, которые лишены dystrophin (Edwards et al.,2010). Некоторые недавние исследования, использующие transient receptor potential channels (TRPC) в качестве вносящих вклад в аномальное поступление Ca2+ в дистрофичные волокна (Vandebrouck et al.,2002b; Vandebrouck et al.,2007). Принимая во внимание, что STIM1, как известно, также регулирует TRPC1 каналы, то вполне возможно, что TRP каналы участвуют в становлении комплекса SOCE в mdx мышечных волокнах (Yuan et al.,2007). Мы склоняемся к идее, что позитивная регуляция SOCE при разных миопатиях может представлять собой компенсаторную реакцию в ответ на индукцию благоприятных изменений в экспрессии генов и для приспособленности к мышечным повреждениям (Stiber and Rosenberg,2011). Squire et al. продемонстрировали, что устранение дистрофического фенотипа c помощью индуцибельной экспрессии utrophin не сопровождается изменениями в комплексе SOCE (Squire et al.,2002). Т.о., предстоит исследовать, является ли SOCE патологическим медиатором или mitigator дегенерации дистрофичных мышц.

В данной работе SLN,как было установлено, блокирует SOCE и нар3ушает мышечную дифференцировку. В результате возникает интересная возможность относительно роли SLN в регуляции SOCE во время регенерации мышц и в качестве модификатора скелетных миопатий. Nemaline миопатии являются группой недистрофических миопатий, возникающих в результате мутации в тонком филаментном белке nebulin. Мыши, лишенные nebulin или пациенты с немалиновой миопатией обнаруживают сильно сниженную мышечную контрактильность, которая может быть приписана накоплению nebulin палочек и альтерациям в передаче сигналов Ca²⁺. Активация SLN может представлять один из потенциальных механизмов, лежащих в основе снижения сократимости у nebulin KO мышей (Gokhin et al.,2009). Сходным образом, SLN активируется в животной модели dysferlinopathy (Campanaro et al.,2002). В данной работе мы показали, что SLN активируется в мышцах STIM1-/- мышей. Важно знать, изменяются ли STIM1 и SOCE при nemaline миопатиях и dysferinopathy. Мы полагаем, что экспрессия STIM1 негативно регулируется приводя к уменьшению SOCE. Т.о., SOCE-зависимая дифференцировка мышц д. быть ограничена и поэтому д. вносить вклад в мышечную слабость, ассоциированную с мышечной регенерацией. Мы показали, что влияние SLN's на хранилища SR Ca²⁺ расширяется за границы SERCA1/2 ингибирования, но также используется ограничение SOCE в незрелых мышечных трубках. Фактически, изменения в экспрессии SLN/SERCA1 и уменьшение хранилищ SR ^Ca2+ , наблюдаемые у STIM1 мутантных мышей отражает задержку в дифференцировке мышц, которая использует процесс созревания SR. Во время нормального миогенеза или регенерации мышц, SLN и STIM1 могут действовать независимо, чтобы скоординировать мышечную дифференцировку регулируемым способом, чтобы предотвратить перегрузку Ca²⁺.

Итак, полученные находки предоставляют первые экспериментальные доказательства, что SLN и STIM1 действуют, чтобы скоординировать созревание SR и мышечную дифференцировку. Регуляция активности SLN и STIM1 нарушена при некоторых нейромышечных болезнях, это открывает возможность, что эти контрольные механизмы управляют SOCE во время постнатального миогенеза. Т.о., SOCE может быть активирован, чтобы способствовать мышечной дифференцировке в регенерирующих мышечных волокнах. Исходя из этой идеи, мы полагаем, что модуляция STIM1-зависимого SOCE может представить в будущем стратегию для лечения различных скелетных миопатий.