Асимметричное расположение мРНК является законсервированным клеточным процессом, наблюдаемым в разных типах клеток и организмов. Разработка утонченных методов гибридизации in situ привело к успешному открытию локализации мРНК в соматических клетках, так β-actin мРНК была локализована на ведущем крае первичных фибробластов, тогда как др. мРНК, напр. vimentin, располагаются около ядра [1]. Недавно мРНК, кодирующие членов комплекса the Arp2/3, как было установлено, располагаются на ведущем крае выпячиваний фибробластов [2]. Специфические мРНК могут обнаруживать разные паттерны локализации в разных клетках. Напр., vimentin мРНК ,первоначально многочисленная в околядерных областях развивающихся миобластов, а затем в конечном итоге оказывается в costameres, как и белки vimentin в зрелых мышечных трубках [3]. У почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Ash1 мРНК располагается в кортексе почки дочерней клетки во время поздней анафазы [4]. Локальная трансляция Ash1 мРНК ограничивает экспрессию Ash1p дочерней клеткой, которая контролирует переключение типа спаривания. Асимметричная локализация мРНК во время оогенеза и эмбрионального развития существенна для становление оси тела, спецификации клеточных судеб и формирования паттерна [5, 6]. В ооцитах Drosophila bicoid мРНК располагается на переднем полюсе, тогда как oskar и nanos мРНК локализуются на заднем полюсе [7]. Сходный феномен наблюдается в ооцитах Xenopus, в которых Vg1 мРНК располагается на вегетативном полюсе [8, 9]. Специфическое расположение мРНК также продемонстрировано в нейронах. Исследования in situ гибридизации выявили, что определенные мРНК избирательно локализуются в аксонах и/или дендритах первичных нейронов. Напр., tau мРНК специфически локализуется в развивающихся аксонах [10], а Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIα (CaMKIIα), microtubule-associated protein 2 (MAP2) мРНК, как было установлено, локализуются в дендритах [11, 12]. β-actin мРНК может быть локализована как в развивающихся аксонах, так и дендритах, где она концентрируется в ростовых конусах и филоподиальных выпячиваниях [13, 14], тогда как её гомолог β-actin мРНК в основном ограничен телом клетки. В олигодендроцитах myelin basic protein (MBP) мРНК локализуется в отростках и периферических компартментах, богатых миелином [15]. В большиства приведенных выше примеров мРНКs располагаются в виде частиц или гранул, которые являются messenger ribonucleic protein (mRNP) комплексами, которые содержат одну или более мРНКs, РНК-связывающие белки, факторы трансляции и в некоторых случаях, также рибосомы [16].

Геномный анализ показал, что асимметричное распределение мРНК является распространенным феноменом, наблюдаемым для множественных мРНК в одном и том же типе клеток. Проверка 3370 транскриптов у эмбрионов Drosophila с помощью высокопроизводительной гибридизации in situ показала, что 71% из них обнаруживает четкое не униформное распределение [17]. Фракционирование субклеточных компартментов вместе с систематическим анализом РНК предоставили исчерпывающее мнение о локализации мРНК в выпячиваниях фибробластов и аксонах нейронов. Mili et al. идентифицировали более 50 транскриптов достоверно концентрирующихся в очищенных выпячиваниях фибробластов в ответ на воздействие lysophosphatidic acid [18]. Серийный анализ мРНК аксонов показал, что сотни транскриптов располагаются в аксонах первичных кортикальных и сенсорных нейронов [19-23]. Интересно, что пулы мРНК, присутствующие в нормальных и поврежденных аксонах [19, 23], или в аксонах из разных стадий развития [21], обладают дифференциальным составом, указывая тем самым, что локализация мРНК в нейронах динамически регулируется за счет активностей и внеклеточных стимулов. Интересно, что профили мРНК в конусах роста аксонов отличаются от таковых в аксональных отростках и также находятся под онтогенетическим контролем [22]. Недавно, строгий анализ мРНК, выделенных из CA1 нейропилей гиппокампа, синаптического региона, содержащего аксоны и дендриты, выявил 2550 видов мРНК, локализованных в этом регионе головного мозга [24], значительно более крупный пул мРНК, по сравнению с подсчитанным ранее менее сотни [25-27]. Как в выпячиваниях фибробластов, так и нервных отростках белки, кодируемые локальными мРНКs, выполняют разные функции, включая РНК и/или регуляцию трансляции, активный транспорт, динамику цитоскелета, передачу сигналов и/или синаптическую передачу и регуляцию в нейронах, подтверждая, что локализация мРНК и последующая локальная трансляция являются общими регуляторными механизмами, широко используемыми в разнообразных клеточных функциях.

Local Translation of мРНК Provides a Mechanism for Efficient Protein Sorting Shaping Cell Function

Трансляция локальных мРНК обеспечивает концентрированную продукцию белков в ограниченных местах и позволяет клеткам или организмам генерировать своевременные реакции на внешние стимулы или внутренние онтогенетические программы. Во время оогенеза Drosophila, напр., трансляция на переднем полюсе локализованной bicoid мРНК и на заднем полюсе локализованных oskar и nanos мРНК генерирует увеличивающиеся уровни кодируемых белков на переднем и заднем полюсах, соотв. [7]. Диффузия этих белков приводит к возникновению градиентов этих белков, которые важны для становления оси тела эмбрионов Drosophila. Поскольку трансляция этих мРНК не активируется вплоть до того, пока они не будут локализованы соответственно, вредный эффект эктопической экспрессии этих белков не проявляется.

В поляризованных клетках, таких как нейроны или олигодендроциты, мРНК могут быть направлены в места, где их белковые продукты д. быть сконцентрированы. Напр., мРНК кодирующие белки, концентрирующиеся в аксонах, напр. tau, могут быть сконцентрированы в аксонах, а мРНК, кодирующие белки, обогащенные в дендритах, MAP2, CaMKIIα и PSD-95, могут поставляться в дендриты и субсинаптические сайты [11, 12, 28]. Многочисленные мРНК могут быть локализованы в ростовых конусах [22], включая β-actin и GAP-43 [13, 29], где белковые продукты обогащены. В олигодендроцитах, MBP мРНК локализуется в компартментах миелинизации, где MBP обогащен [15]. Хотя эти белки могут быть доставлены к своим компартментами мишеням посредством переноса белка, локализация и локальная трансляция этих мРНК создает молекулярную основу для эффективной продукции белков, которая может быть контролируема во времени, особенно для клеток быстро отвечающих на внеклеточные сигналы.

Регуляция и функция локализации мРНК и локальной трансляции хорошо известны в нейронах. В культивируемых первичных нейронах локализация β-actin мРНК и локальный синтез β-actin белка обеспечивают химическими сигналами привлекаемые повороты ростового конуса, индуцируемые с помощью brain-derived neurotrophic factor (BDNF) или Netrin-1 [30-33]. В развивающейся нервной системе ведение аксонов является важным процессом нахождения цели для образования функциональных нейрональных петель (circuits), которые обеспечивают управляемость ростового конуса с помощью как хемоаттрактантов, так хемо-отталкивающих сигналов наведения. Недавние исследования показали, что нарушение транспорта и локализации β-actin мРНК с помощью антисмысловых нуклеотидов против её элементов локализации устраняет BDNF-индуцируемый контроль аксонов [30] и neutrophin-3-индуцируемый рост аксонов [34]. В сенсорных нейронах ганглиев дорсальных корешков локальная трансляция Par6 мРНК играет роль в элонгации аксонов, индуцируемую с помощью фактора роста нервов [35]. В лаб. Jaffrey использовали микроструйные (microfluidic) камеры для выделения аксонов и непосредственного нарушения трансляции в аксонах, что позволяет осуществить определенную проверку функции локальной трансляции в аксонах [35]. Трансляция мРНКs, локализованных в конусе роста, может быть активирована химическими отталкивающими сигналами наведения, такими как Slit и Sema3A. Piper et al. показали, что инкубация со Slit запускает зависимое от синтеза белка обогащение белка cofilin перед коллапсом ростового конуса нейронов ретинальных ганглиев [36], подтверждая возможную локальную трансляцию cofilin или ассоциированных белков. Wu et al. продемонстрировали, что воздействие Sema3A на нейроны ганглиев дорсальных корешков вызывает локальную трансляцию RhoA в аксонах; это событие, по-видимому, необходимо для вызываемого Sema3A коллапса ростового конуса [37]. И cofilin и RhoA мРНК располагаются в ростовых конусах развивающихся аксонов [36, 37]. В отношении синтеза дендритных белков, было сделано важное открытие полирибосом в дендритных шипах [139]. Эти многочисленные исследования выявили механизмы локальной трансляции в дендритах, а их постсинаптические компартменты играют важную роль в синаптической пластичности, это ещё больше подчеркивает важность локализации мРНК, чтобы модифицировать состав белков пространственно ограниченным способом в поляризованных клетках [38, 39].

Direct Interaction of Localization/Zipcode Elements and RNA-Binding Proteins

Активный транспорт и асимметричное распределение мРНКs базируются на прирожденных элементах целенаправленной доставки мРНК, также известного как последовательности zipcode, впервые описанной для β-actin мРНК [40], которая часто локализуется в 3'UTR локализуемого транскрипта и изредка в 5'UTR и кодирующих регионах. Множественные цис-действующие элементы часто обнаруживаются в локализуемых мРНК [41]. Во многих случаях присутствие множественных элементов локализации обеспечивает более строгую способность к локализации. Как было продемонстрировано на почкующихся дрожжах, 4 цис-действующих элемента, E1, E2A, E2B и E3 в кодирующем регионе и в 3'UTR в Ash1 мРНК, были идентифицированы благодаря свой способности локализовать Ash1 репортерные транскрипты [42]. Хотя каждый элемент сам по себе достаточен, чтобы локализовать Ash1 репортерные транскрипты, присутствие 4-х элементов драматически увеличивает эффективность локализации. В ооцитах Drosophila 4 цис-действующих элемента были идентифицированы для локализации на заднем полюсе nanos мРНК. Как и в случае дрожжевой Ash1 мРНК, каждый индивидуальный элемент локализации nanos обладает только слабой способностью локализации мРНК, а существование 4-х элементов локализации обеспечивает локализацию добавочной силой [43]. Локализация на переднем полюсе bicoid мРНК детерминируется несколькими bicoid localization elements (BLEs) внутри региона длиной в 625-nt в 3'UTR, которые образуют 5 stem-loop структур [44, 45]. Присутствие множественных элементов локализации позволяет bicoid мРНК соотв. образом локализоваться в ходе нескольких стадий развития всего процесса оогенеза.

Избыточность элементов локализации мРНК обнаруживается также в клетках позвоночных. Две консервативные последовательности zipcode идентифицированы в 3;UTR of β-actin мРНК: в 54-nt zipcode последовательность и в 43-nt zipcode последовательность [40]. Оба элемента достаточны, чтобы локализовать химерные репортерные мРНК в ведущих ламеллиподиях первичных фибробластов, хотя 43-nt zipcode обнаруживает более слабую способность локализовать репортерную мРНК по сравнению с 54-nt zipcode [40]. В зрелых нейронах, CaMKIIα мРНК целенаправленно направляется в дендриты зрелых нейронов и транслируется локально [12], а генетическая делеция CaMKIIα 3'UTR in vivo устраняет дендритную локализацию CaMKIIα мРНК и приводит к снижению уровней CaMKIIα белка в постсинаптических сайтах [46]. По крайней мере, 4 цис-действующих целевых элемента идентифицировано пока, включая 94-nt элемент после стоп-кодона, участок длиной в 1200-nt на 3' конце, cytoplasmic polyadenylation element (CPE) и G-quartet структура [47-50]. Все 4 направляющих на цель элемента достаточны, чтобы направлять мРНКs в дендриты. Однако, как эти элементы локализации могут кооперировать во время локализации и регуляции CaMKIIα мРНК необходимы дальнейшие исследования.

Физиологическая важность присутствия множественных элементов локализации также нуждается в дальнейшем изучении. Хотя присутствие множественных элементов локализации в некоторых мРНКs обеспечивает большую силу локализации, очевидно также, что каждый цис-действующий элемент может кодировать разную информацию в пути многоступенчатой локализации, чтобы обеспечить тонкую модуляцию локализации мРНК. Кроме того, элементы множественно локализации могут быть важными для клеток. по-разному отвечающих на разные стимулы. Однако эти модели нуждаются в дальнейшем тестировании.

Информация, кодируемая с помощью элементов локализации мРНК может быть в форме первичной последовательности и/или во вторичных структурах. Напр., CPE несет консервативную минимальную консервативную последовательность UUUAUU, которая достаточна для локализации в дендритах CaMKIIα мРНК зрелых нейронов [49], а консервативная последовательность РНК GGCAAGGAGCC служит в качестве hnRNP-A2 response element (A2RE) для связывания hnRNP-A2 с локализованной MBP мРНК в олигодендроцитах [51]. Напротив, локализация Ash1 мРНК в почкующихся дрожжах зависит от вторичных stem-loop структур, образуемых элементами локализации [42]. Мутации в регионе ствола (stem), разрушающие stem-loop структуру, устраняют локализацию Ash1 мРНК, тогда как восстановление stem-loop структуры за счет мутирования компенсаторных оснований успешно восстанавливает локализацию Ash1 мРНК. Сходным образом, Drosophila bicoid мРНК, несущие мутации первичной последовательности BLEs, которые не влияют на stem-loop структуры, локализуются соотв. образом [52].

Общим свойством цис-действующих элементов локализации мРНК является то, что каждый из них предоставляет уникальную платформу для рекрутирования специфических транс-действующих белковых факторов для сборки транспортных mRNP гранул, несмотря на различающиеся последовательности и структурную информацию, которую они несут. Современные исследования подтвердили, что специфическое взаимодействие транс-действующих РНК-связывающих белков с элементами локализации мРНК существенно для собственно локализации мРНК. Один давний и хорошо охарактеризованный пример, что в 54-nt zipcode последовательность β-actin мРНК, которая играет главную роль в локализации β-actin мРНК, специфически взаимодействует с РНК-связывающим белком, zipcode-binding protein 1 (Zbp1) [53]. Недавнее кристаллографическое исследование показало, что KH3 и KH4 домены Zbp1 образуют антипараллельное псевдо-димерное связывание с состоящим из двух частей элементом (5'-GGACU-3' and 5'-ACA-3') внутри в 54-nt zipcode [54]. Воздействие на клетки антисмысловым олигонуклеотидом против zipcodes устраняет локализацию β-actin мРНК как в первичных фибробластах, так и первичных нейронах [34, 40]. Структуры stem-loop bicoid мРНК рекрутируют белок, связывающий двойную нить РНК, Staufen, который, как было установлено, важен для локализации на заднем полюсе bicoid мРНК [52]. She2p непосредственно взаимодействует с элементами локализации Ash1 мРНК и обеспечивает её локализацию [55, 56]. Fragile X mental retardation protein (FMRP) может соединяться со своими мишенями мРНК посредством G-quartet структур, образуемых с помощью G-rich последовательностей [57, 58]. G-quartet структура была недавно продемонстрирована как элемент локализации , чтобы доставлять мРНК в дендритный компартмент [50]. FMRP играет важную роль в локализации в дендритах ассоциированных с ним мРНК в ответ на активацию группы 1 metabotropic glutamate receptors (mGluRs); в нейронах, культивируемых из Fmr1 нокаутных мышей, моделирующих Fragile X syndrome, mGluR-индуцируемая дендритная локализация мРНК, снижается [59]. CPE-binding protein (CPEB) , как было установлено, также облегчает локализацию в дендритах мРНК посредством взаимодействия с CPEs [49].

мРНК-Binding Proteins as Adaptors for Molecular Motors for Active мРНК Transport

Многочисленные исследования продемонстрировали, что локализация мРНК зависит от транспортной активности, обеспечиваемой молекулярными моторами зависимым от цитоскелета образом [60, 61]. Три класса молекулярных моторов, как было установлено, участвуют в транспорте мРНК, а именно зависимые от микротрубочек моторы, kinesin и dynein, и зависимые от микрофиламент моторы, myosins. Фактически, анализ одиночных молекул мРНК выявил, что большая порция локализованных мРНК гранул обнаруживает направленное перемещение. Fusco et al. показали, что приблизительно 20% LacZ-β-actin химерных мРНК, несущих β-actin 3'UTR? обнаруживает направленное движение в противовес 2-4% для не локализуемых мРНК (LacZ без β-actin мРНК 3'UTR) [62]. Это уникальное свойство локализованных мРНКs указывает на то, что присутствие элемента локализации в mRNP комплексе с его транс-действующими факторами может потенциально использовать аппараты для активного транспорта. РНК-связывающие белки могут служить в качестве адапторов, чтобы непосредственно или косвенно через дополнительные факторы, рекрутировать моторные белки, чтобы сформировать mRNP транспортные гранулы.

Такая модель прекрасно продемонстрирована у почкующихся дрожжей для локализации Ash1 мРНК. Белковый комплекс, наз. 'locasome' был идентифицирован, как содержащий She1p/Myo4p, She2p и She3p [55, 63, 64]. She2p это РНК-связывающий белок, который снуёт между ядром и цитоплазмой и формирует mRNP гранулы с Ash1 мРНК за счет непосредственного взаимодействия с его цис-действующими элементами; She1p/Myo4p является типом V миозина (myosin V), который осуществляет транспорт, обеспечиваемый актиновыми компонентами; She3p действует в качестве адаптора, обеспечивающего ассоциацию She2p/Ash1 мРНК комплексов с She1p/Myo4p (Figure 1A). Соединение Ash1 мРНК с She3p устраняется при потере She2p, и как She2p, так и She3p необходимы для рекрутирования She1p/Myo4p на Ash1 мРНК и для локализации Ash1 мРНК [55].

Figure 1. мРНК-binding proteins couple мРНКs to molecular motors for active transport. A) Yeast мРНК-binding protein She2p in a complex with She3p recruits myosin (Myo4/She1p) onto Ash1 мРНК. B) Drosophila non-canonical RNA-binding protein, Egl1, and Bic-D interact with dynein and dynactin complexes, respectively, to couple TLS-containing мРНКs to dynein for microtubule minus-end-directed мРНК transport. C) FMRP facilitates the localization of its target мРНКs to dendritic compartments in mammalian neurons in response gp1 mGluR activation. FMRP may directly (left) or indirectly (right) interact with kinesin light chain (KLC) to couple мРНКs to conventional kinesin motors for мРНК localization.

Апикальная локализация мРНК в синцитиальной бластодерме эмбрионов Drosophila обеспечивается с помощью процесса транспорта, направленного к минус концу микротрубочек. Факторы, участвующие в апикальной локализации мРНК включают Bic-D, Egl, dynein и dynactin. Dienstbier et al. сообщили, то белковые комплексы, состоящие из Egl и Bic-D связывают Transport and Localization Signal (TLS) в мРНК с dynein моторами у эмбрионов Drosophila [65] (Figure 1B). Ранее и Egl и Bic-D, как было установлено, ассоциируют с легкой цепью dynein, Bic-D ассоциирует также с dynactin [66, 67]. Dienstbier et al. продемонстрировали, что Egl является неканоническим РНК-связывающим белком, который содержит неизвестный РНК-связывающий домен, но может распознавать TLS. Авт. далее показали, что Egl и Bic-D является единственными двумя белками, обладающие специфическим сродством с несколькими разными TLSs, и подтвердили, что Egl и Bic-D в комплексе связывают TLS с dynein моторами для направленного к минус концу микротрубочек транспорта.

Ранние наблюдения локализации мРНК и активного транспорта в нейронах продемонстрировали зависимый от микротрубочек механизм локализации мРНК в нейронах [68, 69], подтвердив участие зависимых от микротрубочек моторов. Участие kinesin в транспорте мРНК в нейронах далее тестировали с помощью метода идентификации белков, связанных с KIF5 груз-связывающим доменом. Результаты этого исследования показали, что гранулы mRNP являются грузами обычного кинезина [70]. Идентифицированные РНК-связывающие белки включают несколько хорошо охарактеризованных примеров транспорта мРНК, такие как hnRNP-A2, Staufen и FMRP. Избыточная экспрессия дикого типа и доминантно-негативной формы KIF5 способствует или супрессирует соотв. способность транспортировать mRNP гранулы, демонстрируя непосредственное участие kinesin в транспорте мРНК [70].

Хотя как мРНК , так и РНК-связывающие белки очищаются совместно с груз-связывающим доменом обычного кинезина kinesin, остается неясным, как мРНК непосредственно соединяются с kinesin моторами в клетках млекопитающих. Недавнее исследование показало, что потеря FMRP снижает эффективность связывания FMRP мРНК мишеней с обычной тяжелой цепью kinesin и в последствии ведет к уменьшению локализации в дендритах FMRP мРНК мишеней после активации mGluR рецептора [59] (Figure 1C). Дефекты локализации мРНК, вызываемые потерей FMRP могут частично лежать в основе возникновения онтогенетических дефектов дендритов, ассоциированных с Fragile X Syndrome, наследственной формой умственной отсталости, вызываемой замалчиванием экспрессии FMRP белка [71]. Функция РНК-связывающих белков по связыванию мРНК с молекулярными моторами может быть не уникальной для FMRP в клетках млекопитающих. В качестве дополнительного экземпляра, CPEB, который регулирует локализацию и трансляцию в дендритах CPE-содержащих мРНК, и взаимодействует с kinesin, а также с dynein [49]. Однако , участвует ли CPEB в связывании его мРНК мишеней с молекулярными моторами, нуждается в дальнейшем исследовании.

Nuclear Initiation of мРНК Transport

Несколько линий доказательств подтверждают, что транспорт мРНК инициируется в ядре, где он связан с транскрипцией. Эта модель была прекрасно продемонстрирована для локализации Ash1 мРНК в почкующихся дрожжах. Shen et al. показали, что локализация в ядре She2p и последующее взаимодействие с Ash1 мРНК в ядре является существенным для соотв. локализации Ash1 мРНК [72]. Взаимодействие в ядре между She2p и Ash1 мРНК обеспечивается с помощью type II RNA polymerase факторами элонгации, Spt4-Spt5/DSIF, и связана с транскрипцией Ash1 мРНК [73]. Хотя ядерная локализация She2p не нужна для её взаимодействия с элементами локализации Ash1 мРНК, устранение его ядерной локализации с помощью мутантного She2p NLS полностью устраняет его функцию по локализации Ash1 мРНК [72]. Инициальное соединение She2p с Ash1 мРНК во время транскрипции может запускать ступенчатообразное привлечение др. факторов и в конечном итоге ведет к сборке Ash1 mRNP гранул, способных к локализации. В самом деле, She2p рекрутирует Loc1p и Puf6p на Ash1 мРНК в ядре, и Loc1p и Puf6p , как известно, необходимы для локализации Ash1 мРНК, а связывание этих факторов приводит к репрессии трансляции Ash1 мРНК [74, 75].

Подобно дрожжевому She2p, многие, если не все, мРНК-связывающие белки являются белками снующими между ядром и цитоплазмой, имеют как сигналы ядерной локализации, так и сигналы экспорта из ядра. Zbp1 является одним из хорошо охарактеризованных примеров. Хотя неясно, связано ли соединение Zbp1 с β-actin мРНК с транскрипцией, исследование показало, что Zbp1 локализуется в локусах транскрипции β-actin в ядре и взаимодействует с β-actin мРНК в сайтах транскрипции β-actin [76]. Это взаимодействие облегчается первоначальным связыванием преимущественно ядерного РНК-связывающего белка, Zbp2, с синтезируемой β-actin мРНК во время транскрипции [77]. Истощение Zbp2 с помощью RNAi ведет к ослаблению ассоциации Zbp1 и β-actin мРНК [77].

Участие exon-junction complexes (EJCs) в локализации мРНК составляет др. кусок доказательств в подтверждение инициации транспорта мРНК в ядре. Содержащие EJC, Barentsz, Mago, Y14 и eIF4AIII, откладываются на мРНК приблизительно 20 nt выше соединения экзонов во время сплайсинга [78]. В ооцитах Drosophila сплайсинг первого интрона и последующее откладывание EJC являются важными для для локализации на заднем полюсе oskar мРНК [79, 80]. В-третьих, ядерные мРНК cap-binding proteins CBP20/80 находятся в комплексах с мРНК, локализованными в дендритных компартментах и закрепляются в местах по соседству с дендритными шипами в ответ на стимуляцию [81]. CBP20/80 комплексы ассоциируют с вновь транскрибированными мРНК и замещаются с помощью цитоплазматического cap-связывающего белка, eIF4E, во время первого раунда трансляции [82, 83], подтверждая, что эти локализованные мРНК трансляционно пассивны. Кроме того, биохимический анализ выявляет, что CBP20/80 является единственным ассоциированным с мРНКs, нагруженными EJCs [83], далее было подтверждено, что эти с CBP20/80-связанные мРНК трансляционно репрессированы. Однако, являются ли связывание ядерных CBPs и ассоциации с EJC всеобщей потребностью для транспорта и локализации всех мРНК, предстоит еще протестировать. По крайней мере, в нейронах eIF4AIII ко-локализуется с дендритными mRNP гранулами и ассоциирует с локализованной в дендритах Arc мРНК, хотя его функция в локализации Arc мРНК неясна [84].

Cooperation of мРНК-Binding Proteins in мРНК Localization

Специфическая локализация мРНК уникально достигается с помощью одиночного транс-действующего фактора, принимая во внимание, что процесс транспорта мРНК использует множественные ступени, которые могут нуждаться в разных комбинациях транс-действующих факторов. Фактически, существование множественных элементов локализации РНК может делать возможным связывание с помощью множественных РНК-связывающих белков. Эти элементы целенаправленной доставки за счет рекрутирования транс-действующих факторов, т.о., составляют основу для сборки и поддержания транспортных mRNP гранул, эффективного рекрутирования механизмов транспорта, чтобы регулировать локализацию. Эти транс-действующие РНК-связывающие белки могут играть разные роли в многоступенчатом процессе транспорта мРНК.

Некоторые хорошо изученные примеры транс-действующих факторов, участвуют в локализации oskar мРНК на заднем полюсе ооцита Drosophila [7]. В исследовании St Johnston с сотр., по in vivo imaging в комбинации с мутационным анализом транспорта oskar мРНК было продемонстрировано, что мутации в каждом из факторов ведут к разным фенотипам способности распределения и транспорта oskar мРНК. Эти данные подтверждают, что белки, связывающие oskar мРНК, выполняют разные функции в локализации oskar мРНК, хотя все факторы связывания необходимы для собственно локализации oskar мРНК [85]. Напр., мутация HRP48, Drosophila hnRNP-A/B гомолога, ведет к диффузному распределению oskar мРНК , а исчезновение GFP-Staufen гранул, подтверждает возможную роль HRP48 в сборке oskar mRNP гранул [85]. Напротив, потеря белков соединения экзонов, Mago и Btz, не оказывает эффекта на образование видимых oskar мРНК и GFP-Staufen гранул, но ведет к уменьшению количества активно транспортируемых гранул. Кроме того, потеря Mago и Btz ведет к обратимым направленным net движениям oskar мРНК в направлении переднего полюса, и у этих мутантов oskar мРНК распределяется в виде градиента, распространяющегося прочь от переднего полюса [85]. Такие альтерации в динамике и распределении oskar мРНК указывают на то, что EJC может играть роль в соединении oskar мРНК с kinesin, молекулярным мотором, обеспечивающим локализацию oskar мРНК в цитоплазме ооцита. Альтернативно, EJC белки могут играть роль в ингибировании активности dynein комплексов, которые обеспечивают экспорт мРНК из питательных клеток. Staufen, по-видимому, играет основную роль в соединении oskar mRNP с kinesin, поскольку у мутантов Staufen oskar мРНК в основном ограничена передним полюсом с небольшой пропорцией правильно локализованных на заднем полюсе [85]. Анализ изображений живых клеток показал, что гранулы oskar мРНК у мутантов Staufen обнаруживают сниженную частоту быстрых направленных движений, это указывает, что Staufen играет роль в соединении oskar мРНК с kinesin или регулирует активность kinesin. Для небольшой пропорции oskar мРНК, обладающей быстрыми движениями, мутация Staufen не влияет на склонность локализации в задней части oskar мРНК, указывая тем самым, что дополнительные факторы также могут участвовать в ассоциации oskar мРНК с kinesin для соответствующей локализации. Однако упомянутые выше гипотетические функции этих транс-действующих факторов необходимо тестировать дальше. Несмотря на это, полученные результаты указывают, что для гарантии правильной локализации мРНК участвуют многие транс-действующие факторы и ассоциированные моторы, выполняя роли кооперативно или на разных ступенях транспорта, чтобы локализовать oskar мРНК.

Кооперативные взаимодействия между мРНК-связывающими белками, участвующие в локализации мРНК, наблюдались в клетках млекопитающих включая фибробласты и нейроны. Возьмем β-actin мРНК в качетве примера, помимо Zbp1 и Zbp2, которые, как было впервые установлено, участвуют в локализации β-actin мРНК за счет непосредственного взаимодействия с 54-nt zipcode [53, 86], несколько др. РНК-связывающих белков, как было установлено, играют роль в локализации β-actin мРНК в нейронах, включая hnRNP-R [87], Staufen2 [88] и белок, соединяющийся с полипиримидиновым треком [89]. Хотя детальные рабочие механизмы для каждого из РНК-связывающих белков в локализации β-actin мРНК ещё не установлены в точности, предполагается более сложный состав факторов, которые участвуют в регуляции сборки и сортировки локализованных β-actin мРНК гранул.

В качестве одного из примеров болезни связи с нарушениями локализации β-actin мРНК с аксонах и ростовых конусах в моторных нейронах, культивируемых от мышей, моделирующих spinal muscular atrophy (SMA) [90]. SMA это аутосомное рецессивное нейродегенеративное заболевание, специфически затрагивающее двигательные нейроны нижних отделов спинного мозга. SMA вызывается низкими уровнями белка жизнеспособности двигательных нейронов (survival of motor neuron (SMN)) [90], подтверждая возможную связь между SMN и РНК-связывающими белками, участвующими в локализации мРНК. Накапливаются доказательства, подтверждающие, что функция SMN в локализации мРНК может использоваться и помимо β-actin мРНК, а SMN, скорее всего, общий фактор, участвующий в локализации др. мРНК в аксонах двигательных нейронов [91]. Во-первых, рекомбинантный флюоресцентный белок, нагруженный SMN обнаруживает двунаправленное движение в аксонах двигательных нейронов [91]; Во-вторых, аксональный SMN взаимодействует с рядом РНК-связывающих белков в гранулах, содержащих мРНКs [91-95] и в-третьих, острая потеря SMN, вызываемая с помощью RNAi ведет к уменьшению аксональной локализации poly(A) мРНКs, подтверждая широкий круг мРНК, которые регулируются с помощью SMN [91]. Хотя точная функция SMN в локализации мРНК остается неясной, правдоподобная модель могла бы посодействовать сборке mRNP. SMN, в комплексах, содержащих Gemin белки и дополнительные факторы, облегчает сборку транспортных mRNP гранул [96]. Хорошо известно, что SMN комплексы функционируют в качестве платформ для сборки маленьких ядерных RNP сплайсесом, это увеличивает поддержку предположения о неканонической функции в сборке и, или доставке mRNP [97, 98].

В локализации в дендритах нейронов CaMKIIα мРНК также, скорее всего, используются множественные РНК-связывающие белки. Помимо CPEB, который взаимодействует с CPE из CaMKIIα мРНК, возможрость участия др. факторов остается открытым вопросом. Одним из непосредственных кандидатов является FMRP, который соединяется с G-quartet структурой, как известно, связывающим элементом для FMRP [57]. В соответствии с этим предсказанием, Dictenberg et al. показали, что локализация CaMKIIα мРНК в ответ на активацию group I mGluR устраняется в нейронах, лишенных FMRP [59]. CaMKIIα мРНК является непосредственной мишенью для FMRP [99], и оба совместно локализуются в дендритах, где FMRP необходим для регуляции mGluR-индуцируемой трансляции белка CaMKIIα [28].

Cotransport Versus Single мРНК Transport

Одной из важных тем исследований транспорта мРНК является расшифровка молекулярного состава транспортных mRNP гранул. Предприняты немногие протеомные попытки идентифицировать белковый состав mRNP гранул [70, 100, 101], пока компоненты одиночных mRNP гранул недостаточно изучены, особенно состав мРНК из одиночных транспортных mRNP гранул. Некоторые исследования описывают крупные mRNP гранулы в дендритах нейронов [70, 102]. Эти крупные mRNP гранулы содержат мРНК, РНК-связывающие белки, факторы трансляции и рибосомы, с S значением выше 1000 [70]. Эти типы mRNP гранул может быть непосредственно видны с помощью негативного окрашивания при ЭМ [102]. Принимая во внимание крупные размеры этих гранул, особенно одной гранулы, содержащей множественные виды или копии мРНК и эти мРНК могут совместно транспортироваться в отростки нейронов в одних и тех же транспортных mRNP гранулах. Gao et al. предоставили дополнительные доказательства этой модели, исследуя совместные локализацию и транспорт CaMKIIα, neurogranin и Arc мРНК, используя микроинъекции меченных РНК [103]. Данные подтвердили, что эти мРНК упаковываются в одни и те же транспортирующие мРНК гранулы с помощью элементов локализации A2RE посредством взаимодействия с hnRNP-A2 [103]. Эти мРНК гранулы не содержат β-actin мРНК, которая не имеет A2RE, это ещё больше подтверждает функциональную сортировку мРНК в разные типы гранул. Всё же, представляют ли hnRNP-A2-содержащие дендритные mRNPs, наблюдаемые при микроскопической визуализации, крупные mRNP гранулы, которые были охарактеризованы биохимически всё ещё неясно. Наблюдаемые преимущества совместной упаковки и транспорта мРНК в крупных мРНК гранулах делают возможной ко-регуляцию транспорта и трансляции этих мРНК в поляризованных клетках. В принципе, РНК гранулы могут представлять собой трансляционные единицы, которые продуцируют специфические белки по потребности в микроусловиях, таких как дендритные шипы.

Недавние количественные исследования с использованием получения изображений одиночных молекул модифицировали концепцию механизма совместного транспорта, который предполагает обязательную упаковку множественных функционально связанных мРНК в одиночные гранулы и предоставили доказательства транспорта индивидуальных мРНК или немногих копий. Исследование Mikl et al. предоставило доказательства на фиксированных и живых клетках, что MAP2, CaMKIIα и β-actin мРНКs рассортировываются по разным мРНК гранулам, содержащим лишь небольшое количество копий каждой из мРНК [104]. Детекция эндогенных мРНКs с помощью in situ гибридизации с использованием антисмысловых зондов, меченных разными флюороформами, восстановило мнение о присутствии немногих мРНК молекул [104]. Используя мультиплексную детекцию одиночных молекул эндогенных мРНК в фиксированных клетках, Batish et al. не выявили совместной локализации для 8 исследованных мРНК [105]. Эти исследования подтвердили, что многие мРНК , скорее всего, транспортируются в нейрональные дендриты в mRNP гранулах, содержащих только одиночные мРНК молекулы. Необходимы дальнейшие исследования и вопрос пока остается открытым, при каких условиях мРНК могут быть отсортированы в более высоком количестве копий, в ответ ли на активность или стимуляцию нейронов. Хотя высокие количества копий мРНК могут не транспортироваться в одних и тех же гранулах, сборка и сортировка mRNP гранул, по-видимому, скорее всего, очень избирательный процесс. Tubing et al. показали, что значительно более крупная фракция Septin7 мРНК локализуется совместно с CaMKIIα мРНК (36%) по сравнению с MAP2 мРНК (14%) в дендритах [106]. Интересно, что наблюдаемая совместная локализация часто встречается для одних и тех же транскриптов, или для Septin7 или MAP2 мРНК, когда каждая совместно инъецируемая мРНК метилась in vitro разными флуорофорами. Остается неясным, как осуществляется специфическая сортировка мРНК по разным гранулам, обеспечивающая дифференциальный состав мРНК, напр., множественные копии мРНК . Одним из предполагаемых механизмов может быть димеризация РНК-связывающих белков, процесс, который может сводить мРНК со сходным или одним и тем же элементом локализации в одни и те же гранулы. Недавно, бесклеточная система была предложена для для искусственной nucleate сборки множественных мРНК в высокого порядка РНК гранулы, которая использует РНК-связывающий белок, FUS, и его low-complexity (LC) РНК-связывающий домен; интересно, что фосфорилирование LC, по-видимому, ингибирует сборку гранул [107]. Необходимы дальнейшие исследования для оценки этой предложенной модели сборки РНК гранул в клетках. Важно точнее оценить обстоятельства и механизмы, с помощью которых мРНК сортируются и/или транспортируются в гранулы с низким или с высоким содержанием числа копий РНК. Стрессовые гранулы представляют пример структуры высокого порядка, при этом мРНК, по-видимому, появляются упакованными в крупные структуры, которые отличны от РНК транспортирующих гранул [16]. Вероятно, что РНК гранулы существуют в виде континуума, гетерогенные по размеру и молекулярному составу и выполняющие разные функции по регуляции метаболизма, сортировки и доставки мРНК.

The Impact of Polarized Cytoskeletal Networks and Coordinated Role for Multiple Motors on мРНК Localization

Локализация мРНК нуждается собственно в сборке mRNP гранул и их связи с молекулярными моторами. Было бы интересно определить структурную основу асимметричного распределения мРНК. Недавнее исследование подтвердило, что поляризованная организация цитоскелетной сети является важным фактором. Анализ картин живых клеток с флюоресцентно меченной эндогенной oskar мРНК с помощью GFP-MS2 или GFP-Staufen, белков маркеров для oskar мРНК гранул, выявил, что задняя локализация oskar мРНК в ооцитах Drosophila детерминируется с помощью незначительной склонности к направленному транспорту oskar мРНК гранул по слабо поляризованной сети микротрубочек большинство плюс концов которых направлено к заднему полюсу [85]. Oskar mRNPs обладают двунаправленными быстрыми перемещениями вдоль сети микротрубочек, но при этом большая часть популяции локализуется в заднем полюсе ооцита. У эмбрионов Xenopus Vg1 мРНК располагается на вегетативном полюсе эмбриона благодаря кинезинам, перемещающимися по популяции микротрубочек с плюс концами в большинстве своем обращенными к вегетативному полюсу и благодаря взаимодействиям между kinesin-1 и kinesin-2 [108]. Хотя исследования указывают, что локализация мРНК это активный и направленный процесс, более недавние исследования подтвердили, что асимметричное распределение мРНК может быть также пассивным эффектом асимметричной ориентации цитоскелетных структур, используемых моторами. Во время процесса локализации мРНК прирожденные направляющие на цель элементы локализуемых мРНКs могут быть пригодны для сборки способных к транспорту mRNP гранул, которые могут соединяться с молекулярными моторами. Асимметричная организация микротрубочек должна поэтому испытывать влияние в зависимости от того, где д. накапливаться РНК. Пока остается неясным является ли это всеобщим механизмом для мРНК в др. клетках.

Асимметричная локализация мРНК является распространенным феноменом большинства поляризованных клеток, которые обладают высоко ориентированными цитоскелетными филаментами. Напр., нейроны отращивают высоко дифференцированные отростки, аксоны и дендриты. В аксонах микротрубочки ориентированы плюс концами униформно в направлении ростового конуса, тогда как в срединном регионе дендритов равные пропорции микротрубочек обращены своими плюс концами в направлении и прочь от тела клетки [109, 110]. Дифференциальный цитоскелет из микротрубочек в аксонах и дендритах указывает на то, что транспортная система, лежащая в основе локализации мРНК в этих функционально отличающихся отростках нейронов, может быть разной. Общим свойством аксонального и дендритного транспорта mRNP является то, что mRNP гранулы способны к двунаправленным перемещениям. Однако детальный механизм моторами обеспечиваемого транспорта мРНК в нейронах в основном остается неуловимым. Принимая во внимание, что аксональные микротрубочки униформно ориентированы, то двунаправленный транспорт mRNP гранул в аксонах подтверждает, что как dynein, так и kinesin ассоциируют с mRNP гранулами. Напр., GFP-нагруженный ZBP1, РНК-связывающий белок, обеспечивающий транспорт β-actin мРНК в развивающихся аксонах, обнаруживает двунаправленные быстрые перемещения в аксонах [33, 34]. Одно из предположений, вытекающее из этих исследований, что специфическое обогащение β-actin/Zbp1 mRNPs в ростовом конусе может быть следствием несбалансированных антероградных и ретроградных сил, генерируемых кинезином и динеином, соотв. Пока же неясно, как активность dynein и kinesin в транспортировке mRNP гранул координируется. Существует также интересная возможность, что миозиновые моторы могут отлавливать или закреплять РНК гранулы на кортикальном актине вдоль отростков нейронов, в качестве дополнительного средства для конкуренции или влияния на транспорт РНК на дальние расстояния по микротрубочкам. Одной из наиболее вероятных ролей миозинов может быть способствование остановке или трафику мРНК в периферии, такой как ростовые конусы и шипы. Myosin II, как было установлено, способствует локализации β-actin мРНК в фибробластах в ответ на стимуляцию сывороткой, а myosin V, как полагают, участвует в закреплении mRNP гранул в дендритных шипах [111, 112]. Т.о., эстафета, переходящая от зависимых от микротрубочек моторов на зависимые от микрофиламент моторы, может осуществляться локально, это делает возможным обогащение β-actin мРНК в ростовых конусах и шипах.

Сходный механизм может лежать в основе локализации Translocated in Liposarcoma (TLS) белка, содержащегося в mRNPs. TLS является РНК-связывающим белком, расположенным в дистальных частях дендритов и дендритных шипах зрелых нейронов гиппокампа, а накопление TLS в дендритных шипах обеспечивается myosin V [112, 113]. Нарушения функции myosin V нарушает специфическую концентрацию TLS в шипах. В добавок к myosin V, TLS также обнаруживает участие в нейрональном транспорте mRNP гранул, ассоциированных с kinesin [KIF5 [70]]. Кроме того, разрушение или из микротрубочек или актиновой сети устраняет локализацию TLS в дендритах [112]. Для этих наблюдений может быть предложено, по крайней мере, два возможных механизма, лежащих в основе локализации TLS. Во-первых, микротрубочками - и микрофиламентами-обеспечиваемый транспорт TLS это два параллельных процесса, нуждающихся соотв. в kinesin и myosin V. Во-вторых, микротрубочками- и микрофиламентами обеспечиваемый транспорт и локализация TLS могут быть двумя последовательными ступенями собственно локализации TLS в дендритах, при этом TLS сначала транспортируется в дистальные части дендритов с помощью kinesin посредством микротрубочек, а затем транслоцируется или закрепляется на актиновых филаментах, чтобы закрепить локализацию TLS с помощью myosin V.

Базирующийся на микротрубочках и микрофиламентах транспорт может также участвовать в локализации oskar мРНК на заднем полюсе ооцитов Drosophila. Поскольку эта специфическая локализация oskar мРНК и с ней ассоциированного РНК-связывающего белка, Staufen, в основном обеспечивается с помощью kinesin по микротрубочкам [85], Krauss et al. наблюдали, что myosin V ассоциирует ттолько с Staufen в заднем кортексе ооцита Drosophila [114]. Мутации myosin V и нарушение функции myosin V за счет экспрессии доминантно-негативных белков myosin V приводят к нарушениям локализации белка Staufen, маркера для oskar мРНК, при этом часть неправильно локализуется в центре ооцита [114]. Это исследование показывает, что myosin V регулирует локализацию oskar мРНК на поздних стадиях транспорта, такой как локальная перестройка или закрепление oskar mRNPs, и подтверждает, что интактный цитоскелет, состоящий из микротрубочек и сети микрофиламент, необходим для эффективного транспорта и локализации мРНК.

Signaling Pathways Regulating мРНК Localization and мРНК-Binding Proteins

В поляризованных соматических клетках локализация мРНК активно регулируется с помощью внеклеточных стимулов. В фибробластах стимуляция сывороткой вызывает перераспределение β-actin мРНК на ведущем крае голодающих клеток [115]. Механистические исследования выявили, что сывороткой индуцируемая локализация β-actin мРНК обеспечивается передачей сигналов RhoA, которая вызывает как перестройку актиновых филамент, так и активацию myosin II [111]. Локализация β-actin мРНК на ведущем крае может регулировать направленную клеточную подвижность [116, 117]. В развивающихся нейронах стимуляция с помощью BDNF и netrin-1 увеличивает накопление в ростовом конусе β-actin мРНК, а также асимметричное распределение β-actin mRNPs на стороне ростового конуса вблизи источника BDNF и netrin-1 [30, 31]. Асимметричное распределение и последующая трансляция β-actin мРНК внутри одиночного ростового конуса необходимы для BDNF- и netrin-1-индуцируемого поворота роста. Zbp1 необходим для локальной трансляции β-actin и управления ростовым конусом [33]. Нейроны, культивируемые от Zbp1 KO мышей обнаруживают нарушение доставки β-actin мРНК в ростовые конусы вследствие стимуляции нейронров, отсутствие netrin-обеспечиваемого локального синтеза белка и потерю управления конусом роста в направлении градиента netrin [33]. Молекулярное взаимодействие между Zbp1 и zipcode необходимо для локализации β-actin мРНК в фибробластах и нейронах [34, 53]. Трансляция β-actin мРНК, как полагают, репрессирован во время транспорта, она может быть дерепрессирована в ростовом конусе посредством Src-обусловленного фосфорилирования Zbp1 [32]. Поскольку фосфорилирование Zbp1 с помощью Src высвобождает Zbp1 с β-actin мРНК [118], то регулируемое фосфорилирование в ответ на передачу сигналов рецептора, как полагают, обеспечивает переключение на активацию локального белкового синтеза с трансляционно молчащих РНК гранул. Помимо роли в локальной трансляции в ведении аксонов во время развития нервной системы, локализация мРНК также играет роль во взрослых аксонах в ответ на повреждения, которые представляют др. тип внешних стимулов, оказывающих комплексное влияние на локализацию мРНК [19, 119]. Недавно, Willis et al. предоставили доказательства, показавшие, что перерезка периферических аксонов и повреждения спинного мозга могут вызывать локализацию GFP-β-actin мРНК репортеров в регенерирующих аксонах in vivo [120]. Способность поставлять β-actin мРНК и др. мРНК в зрелые аксоны и усиливать регенерацию нервов нарушены у Zbp1 гетерозиготных мышей или трансгенных мышей, экспрессирующих доминантный мешающий β-actin 3'UTR репортер [121]. Итак, эти исследования подчеркивают потребность в одном важном РНК-связывающем белке и его регуляции в ответ на физиологические сигналы.

Summary and Perspective

Exciting research progress has identified factors involved in and mechanisms underlying мРНК transport and localization, and has allowed the formation of multistep models of мРНК localization (Figure 2). In general, мРНК localization may initiate from the assembly of transport mRNP granules within the nucleus, likely coupled to transcription and splicing. However, the requirement of a nuclear step is by no means obligatory, as shown in several model systems and experimental paradigms. The assembly and sorting of transport mRNP granules rely on the internal localization elements residing within мРНК sequences and their specific interaction with trans-acting factors. These trans-acting protein factors provide the molecular bases for the translational status of transporting мРНКs and their tethering to molecular motors, which mediate directional active transport and local anchoring through interactions with the cytoskeleton. In addition, мРНК localization is a highly regulated process, which can be affected by both intracellular microenvironment, such as the asymmetrical organization of the cytoskeleton, and extracellular signaling events that impinge on the trans-acting factors to modulate RNA granule assembly, sorting, transport, anchoring and local translation. It should be noted that although this model summarized above has been well tested in multiple organisms, it is certainly not the solo mechanism by which мРНКs are asymmetrically localized. For example, мРНКs encoding cytosolic proteins may also be directed to their target locations through a cis-acting RNA element-independent mechanism. In budding yeast S. cerevisiae, ABP140 мРНК is localized to the distal pole of the mother cells [122] in contrast to Ash1 мРНК, which is targeted to the budding cortex of the daughter cell. The localization of ABP140 мРНК relies on the translation of N-terminal peptide of ABP140 protein rather than specific RNA zipcode sequences as observed in Ash1 мРНК [122]. The N-terminal motif of partially translated ABP140 tethers ABP140 мРНК and its associated ribosomes to actin filaments for distal pole localization [122]. Similarly in fibroblast, Dia1 мРНК is localized to the endoplasmic reticulum; this localization process is also mediated by the nascent Dia1 peptide undergoing translation through its direct interaction with GTP-bound RhoA [123]. These emerging novel mechanisms for мРНК localization underscore our still limited understanding on the integration of мРНК localization mechanisms and encourage further studies.

Figure 2. A schematic view of the multistep process for мРНК localization. Mechanistic studies in different model systems reveal that мРНК localization is a multistep process involving the assembly of mRNP granules, engagement of transport molecular motors and subsequent active transport and anchorage of mRNPs at the destination. (1) Assembly of transport mRNP granules can initiate from the nucleus, coupled to transcription and splicing. The binding of мРНК-binding proteins to nascent pre-мРНКs may help to maintain mature мРНКs in a translational quiescent state. EJCs are loaded onto mature мРНКs following the incision of introns. (2) mRNPs are exported into the cytoplasm. (3) мРНК-binding proteins interacting with zipcode elements recruit transport machineries by direct or indirect interaction with molecular motors including myosin, kinesin and dynein/dynactin complexes for microfilament or microtubule-mediated cargo transport. (4) Molecular motors couple mRNPs to microfilaments or microtubules for active transport. Molecular motor-mediated мРНК transport and localization require intact cytoskeletal structures. (5) mRNPs are anchored to their destination. (6) Properly targeted and repressed мРНКs are released for local translation in response to local signaling events.

Although tremendous progress has been made in recent years, many interesting issues remain to be further addressed. It is important to further determine the molecular composition of transport mRNP granules, define the mechanisms that regulate their heterogeneity and elucidate the functional significance of diverse RNA sorting mechanisms for the polarized cell. In light of the complex composition of mRNP granules, it seems likely that there are machineries involved to ensure the proper assembly of granules with transport capability, but these machineries remain unclear. The continued development and applications of endogenous мРНК labeling systems, such as MS2 and ?-N22 systems, will continue to elucidate and further characterize the mechanisms of мРНК sorting and trafficking [124, 125]. Several MS2 transgenic animal models have been successfully generated to enable the visualization of endogenous мРНК [85, 126]. With the MS2-мРНК labeling system, the endogenous мРНК can be purified to characterize the protein and мРНК compositions in detail [127]. By analyzing the composition of мРНК granules of a given мРНК, mechanisms underlying developmental regulation of мРНК localization may also be better understood. In addition, such studies may help to identify the molecular motors mediating the transport of a specific мРНК and, possibly, mechanisms and conditions whereby mRNPs are directly and/or indirectly coupled to motors.

It will be important to continue to advance technology for visualization of endogenous мРНКs without the need for expression of transgenic reporters. The use of multiply labeled tetravalent RNA imaging probes has allowed visualization of native мРНК in live cells, including β-actin мРНК [128]. Recently, this method was used to visualize microtubule-dependent transport of single β-actin мРНК molecules in live cells [129]. The opportunity for multiplex applications should shed further light on the sorting, copy number and heterogeneity of native RNA granules.

Further work is needed to understand the cytoskeletal basis for directed мРНК transport and the role of asymmetric cytoskeletal organization. One important observation made recently is that the posterior pole localization of oskar мРНК in the Drosophila oocyte is mediated through slightly biased microtubules [85]. Similarly, the vegetal localization of Vg1 мРНК in Xenopus oocyte is mediated by distinct kinesins through a group of microtubules with plus ends oriented toward the vegetal pole [108]. Beyond oskar and Vg1 мРНКs, whether the polarized cytoskeleton constitutes a general mechanism for мРНК asymmetrical distribution remains as a further question to be addressed. Particularly in neurons, how the organization of microtubules contributes to the differential мРНК transport in axons and dendrites is unclear.

Недавние исследования продемонстрировали, что miRNAs и РНК-индуцированные молчащие комплексы избирательно локализуются в дендритных компартментах и дистальных частях аксонов и, по-видимому, регулируют локальный синтез белка [130-133]. В дендритах нейронов miR-134 локализуется совместно со своей мишенью Limk1 мРНК в дискретных дендритных гранулах [134] , а miR-125a ассоциирована с PSD-95 мРНК в дендритных компартментах [135], подтверждая присутствие локальных мРНК/miRNA комплексов. Эти наблюдения позволяют выдвинуть интересные гипотезы, что miRNAs являются компонентами локальных мРНК гранул и могут регулировать локализацию мРНК путем репрессии трансляции мРНК. Остается неясным транспортируются ли miRNAs совместно, связанными со своими мРНК мишенями или могут транспортироваться независимо [132]. Одним из возможных способов может быть, что microRNAs сортируются с P-тельцами, которые были описаны в дендритах, как динамично взаимодействующие с гранулами, транспортирующими РНК [136]. Взаимодействия между мРНК транспортирующими гранулами и microRNAs, регулирующими локальную трансляцию, предстоит уточнить в будущем.

Дальнейшие исследования необходимы для понимания, как внеклеточные сигналы активно регулируют локализацию мРНКs. Особенно в нейронах, стимуляция с помощью нейротрансмиттеров нейротрофных факторов может избирательно облегчать локализацию определенных мРНК. В зрелых аксонах, обнаруживающих ограниченную доставку мРНК, повреждения могут реактивировать этот биологический процесс и способствовать локализации мРНК, чтобы регенерировать аксоны. Зависимая от активности локализация мРНК играет важную роль в дифференцировке, жизнеспособности и образовании нервных дуг нейронов [39]. Дефекты локализации мРНК связаны с рядом нейрологических нарушений, таких как Fragile X syndrome [71], amyotrophic lateral sclerosis и frontotemporal dementia [137, 138] и SMA [97]. Белки, кодируемые генами, вызывающими эти болезни, включая FMRP, TDP-43, FUS и SMN, являются компонентами транспортных mRNP гранул и, скорее всего, играют важную роль в сборке, сортировке и/или локализации мРНК гранул.

mRNA Localization: An Orchestration of Assembly, Traffic and Synthesis Lei Xing, Gary J. Bassell Traffic Volume 14, Issue 1, pages 2–14, January 2013

mRNA Localization: An Orchestration of Assembly, Traffic and Synthesis
Lei Xing, Gary J. Bassell
Traffic Volume 14, Issue 1, pages 2–14, January 2013