Mesodiencephalic dopaminergic (mdDA) нейроны располагаются в substantia nigra pars compacta (SNc; see Glossary, Box 1), в частности, они важны для моторной функции, тогда как mdDA нейроны из ventral tegmental area (VTA; see Glossary, Box 1) и retrorubal field (RRF; see Glossary, Box 1) участвуют в регуляции эмоций и поощрений (Smidt and Burbach, 2007). Очевидно, что тяжелая потеря SNc mdDA нейронов является патологическим признаком Parkinson’s disease (PD) (Sulzer, 2007). Напротив, mdDA нейроны в VTA и RRF, которые остаются интактными при PD, являются частью mesocorticolimbic системы (see Glossary, Box 1), в которой дефектная DA неротрансмиссия участвует в развитии наркомании, депрессии и шизофрении (Nestler, 2000). Учитывая их участие в нейродегенеративных заболеваниях и психических нарушениях, mdDA нейроны активно изучаются в последнее время.

Box 1. Glossary

CpG sites. Areas in the genome that consist of a C-phosphate-G DNA sequence (i.e. cytosine next
to a guanine) and can be sites of specific methylation.

Dopamine (DA). A neurotransmitter of the monoaminergic group.

DNA methyl transferases (DNMTs). Enzymes that transfer a methyl group to CpG sites in DNA
molecules, thereby influencing transcriptional activity.

Histone acetyltransferases (HATs). Enzymes that transfer acetyl groups to histone complexes.

Histone deacetylases (HDACs). Enzymes that remove acetyl groups from histone complexes.

HDAC inhibitors (HDACis). Chemical compounds that have a repressive effect on the enzymatic
activity of HDACs. Specific compounds can selectively inhibit specific HDAC family members.

Mesocorticolimbic system. Dopaminergic network encompassing the VTA/RRF mdDA neurons
and the projections towards the prefrontal cortex and ventral striatum (nucleus accumbens).

Polycomb group (PcG) proteins. Transcriptional silencers that can form multiple large protein
complexes, regulating lineage choices during development and differentiation via
chromatin remodeling and histone modification.

Retro rubral field (RRF). Neuroanatomical region containing the most caudal group of
dopaminergic neurons in the brain.

Substantia nigra pars compacta (SNc). Neuroanatomical region with dense groups of DA
neurons located in the mesodiencephalon. Named after the presence of a black precipitate in
human DA neurons that forms as a consequence of melanin deposits.

Sumoylation. Process of post-translational modification of proteins, whereby small ubiquitin-like
modifier proteins (SUMO proteins) are attached to the targeted protein lysine residue.

Ventral tegmental area (VTA). Neuroanatomical region containing DA neurons that mostly
project to the prefrontal cortex and are involved in emotion, attention and reward.

С помощью разнообразных молекулярных подходов выявлены факторы, которые специфичны для субнаборов mdDA нейронов или которые управляют их пространственной организацией (Smidt and Burbach, 2007); недавно идентифицирован путь, который молекулярно отличает SNc DA нейроны от тех, что локализованы в VTA (Jacobs et al., 2011). Помимо молекулярного профилирования DA нейронов, однако, второй уровень сложности добавлен быстро развивающейся эпигенетикой, который предоставляет новую информацию об источнике и поддержании характерных паттернов генной экспрессии в mdDA нейронах. Современные определения эпигенетики часто подчеркивают наследуемость изменений в экспрессии генов в ходе клеточных делений, которые не связаны с альтерациями последовательностей ДНК. Вообще-то более подходящим определением эпигенетики, особенно если прикладывать этот термин к зрелым нейронам, которые не могут делиться, является предложенное Adrian Bird: 'The structural adaptation of chromosomal regions so as to register, signal or perpetuate altered activity states' (Bird, 2007). Это определение подчеркивает динамический способ, с помощью которого эпигенетические механизмы координируются и регулируют генную экспрессию. Кроме того, элегантные исследования подтвердили, что ранний жизненный опыт может приводить к длительными эпигенетическим изменениям, которые потенциально могут влиять на экспрессию в течение всей жизни, тогда как старение может влиять на эпигенетическую регуляцию в зрелых нейронах (Lu et al., 2004; Liu et al., 2009; Weaver et al., 2004).

Box 2. Epigenetic mechanisms

Multiple layers of nuclear organization are crucial for determining the unique expression patterns of individual cell types. Changes in nuclear organization rely on three distinct processes: (1) chromatin remodeling; (2) DNA modification (no sequence change); and (3) changes mediated by non-coding RNAs (ncRNAs). Ongoing investigations have already related many of these processes to nervous system function in health and disease (for reviews, see Mehler, 2008; Im and Kenny, 2012). Central to understanding epigenetic regulation are the smallest functional units of chromatin, the nucleosomes. Nucleosomes consist of ?147 bp of DNA wrapped around an octamer of four paired histone proteins (H2A2, H2B2, H32, H42) (Luger et al., 1997). Each of the histone proteins has an N-terminal tail that protrudes from the DNA, making these linear amino-acid chains accessible for post-translational modifications, such as acetylation, methylation, phosphorylation and ubiquitylation. The dynamic pattern of these chemical modifications on histones is essential for chromatin remodeling and, ultimately, for the regulation of gene expression. Another epigenetic mechanism involves DNA modification, such as that seen in genomic imprinting, a robust epigenetic process leading to the specific repression of one of the parental alleles. Differential DNA methylation controls regions during spermatogenesis and oogenesis and reflects silencing of one of the alleles, which can be maintained throughout multiple cell cycles by the combined effort of various epigenetic mechanisms, including those mediated by long ncRNAs and histone modifications (Kacem and Feil, 2009). In embryonic stem cells, the majority of genes that are subject to silencing by imprinting are paternally derived. However, during development such discrimination is reversed and in the adult brain maternally derived alleles, in particular, are silenced (Gregg et al., 2010). Although its underlying mechanisms are largely unknown, this shift might reflect a process of spatiotemporal organization during brain development (Keverne et al., 1996).

Epigenetics in mdDA neuronal development

Генез mdDA нейронов проходит ряд ступеней развития. Во-первых, во время раннего развития формирование паттерна головного мозга вызывает локальную региональную передачу сигналов , которые специфицируют компетентный регион к индукции ранних предшественников mdDA. Затем эти предшественники дифференцируются, чтобы принять нейрональную судьбу, приобрести DA фенотип и затем созреть. Необходимо отметить, что нейрональная судьба и DA фенотип приобретаются последовтаельно и это сопровождается миграцией ранних mdDA предшественников в их специфические вентральные регионы. Хотя эти процессы, скорее всего, скоординироаны, но как в точности это контролируется неизвестно. Мы обсудим каждое из этих событий в отдельности. Более того, приобретение нейрональной судьбы mdDA предшественниками в действительности не отличается от происходящего в др. регионах головного мозга и подтипах нейронов и поэтому управляются теми же самыми механизмами дифференцировки нейронов.

Недавнее исследование показало, что по ходу развития наблюдаемые сдвиги в эпигенетических метках вносят вклад в начало изменений профилей экспрессии, которые отражают эти онтогенетические процессы.

Первой стадией образования mdDA системы является регионализация среднего мозга, чтобы сформировать компетентную область, в которой будут продуцированы mdDA нейроны. Эта региональная готовность, как было установлено, зависит от экспрессии fibroblast growth factor 8 (Fgf8), возникающей в isthmic организаторе (границе между средним и задним мозгом), и от присутствия Sonic hedgehog (Shh), происходящего из вентральной пластинки (floorplate) вентрикулярной зоны (Smidt and Burbach, 2007). Корректность генных регуляторных событий, приводящих к экспрессии этих генов, может базироваться на регуляции с помощью белков Polycomb group (PcG; see Glossary, Box 1), которые влияют на экспрессию генов Shh, Fgf8 и др. факторов [таких как wingless-type MMTV integration site family proteins (Wnts), orthodenticle homeobox-2 (Otx2) и engrailed 1/2 (En1/2)], критических для раннего развития и формирование паттерна mdDA (Fig. 1) (Bracken et al., 2006; Smidt and Burbach, 2007). PcG белки формируют мультибелковые комплексы, которые обычно ассоциируют с типично предварительно модифицированным хроматином (Sauvageau and Sauvageau, 2010) и они способны стабильно репрессировать или поддерживать экспрессию генов путем модификации окружающего хроматина путем целенаправленного воздействия ранних онтогенетических факторов, таких как гомеобоксные гены (Schuettengruber et al., 2007). Более того, PcG белки обычно ассоциируют с эмбриональной регуляцией или обновлением стволовых клеток посредством эпигенетической регуляции транскрипционных факторов (Sauvageau and Sauvageau, 2010), хотя непосредственная роль белков PcG в формировании паттерна среднего мозга и в программировании генов ещё не установлена. Интересно, что PcG белок Yin Yang 1, как было установлено, участвует в формировании осевого паттерна структур передней части головы и являетс, по-видимому, регулятором engrailed 2 (En2) белка (Kwon and Chung, 2003), который участвует в формировании границы между средним и задним мозгом и непосредственно вовлечен в индукцию клона DA у позвоночных.

Fig. 1. Model of epigenetic events that can influence the midbrain mdDA permissive region and the developmental programming of specific neuronal cell types. In the early phase of mdDA neuronal development, Polycomb group proteins, via their effects on Fgf8 and Shh expression levels, might play a role in specifying the permissive region within the midbrain. In addition, they might also influence the activation of genes involved in mdDA neuronal specification (not shown). Later in development, additional epigenetic processes, including histone acetylation and DNA methylation, can play key roles in directing cell fate towards the neuronal, astroglial and oligodendrocytic lineages. NPC, neural precursor cell; NSCs; neural stem cells.

Specifying mdDA neuronal precursors

Как только компетентная область оказывается сформированной, стволовые клетки вентрикулярной зоны начинают подвергаться действию программ инициальной дифференцировки и специфические наборы предшественников идентифицируются по экспрессии ранних маркеров, таких как LIM homeobox transcription factor 1 alpha/beta (Lmx1a/b), Otx2 и forkhead box A2 (Foxa2; также известный как Hnf3b). Единственный эпигенетический механизм участвует в экспрессии генов, специфичных для типов предшественников, это рекрутирование histone acetyltransferases (HATs; see Glossary, Box 1), в частности CBP/P300 (CREB binding protein, CREBBP), на регуляторные сайты внутри этих генов. Примечательно, что транслокация P300 на каждый из этих сайтов контролируется с помощью передачи сигналов, специфичной для типов предшественников, которая т.о., детерминирует качественные особенности (Fig. 1). Напр., генеральный нейрогенез инициируется с помощью усиления активности нейрогенного basic helix-loop-helix (bHLH) белка neurogenin 1 [Ngn1 (также известного как Neurog1)], который формирует активаторный комплекс с Smad и P300, стимулируя тем самым ацетилирование гистонов и увеличивая экспрессию специфичных для нейронов генов, таких как NeuroD (Sun et al., 2001) (Fig. 1). В то же самое время гипометилирование сайта связывания сигнального трансдуктора и активатора транскрипции 3 (Stat3) в промоторном регионе гена glial fibrillary acidic protein (Gfap) облегчает связывание methyl CpG binding protein 2 (MeCP2) и последующее рекрутирование репрессивного histone deacetylase комплекса, содержащего Sin3a и histone deacetylase (HDAC; see Glossary, Box 1), который репрессирует глиальный фенотип (Cheng et al., 2011). При переключении с нейрогенеза на генез астроцитов, передача сигналов leukemia inhibitory factor (Lif) и bone morphogenetic protein 2 (Bmp2) усиливает активность Stat3 and Mad homolog 1 (Smad1), индуцируя тем самым астрогенез (Nakashima et al., 1999), путем подавления экспрессии Ngn1 и путем усиления экспрессии анти-нейрогенных bHLH факторов, которые делают возможной активацию специфичных для астроцитов генов, таких как Gfap (Fukuda and Taga, 2005; Hsieh and Gage, 2004) (Fig. 1). В конечном итоге усиление активности oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) ингибирует образование Stat3-P300 активационного комплекса посредством соединения с p300, и инициации тем самым олигодендрогенеза (Fukuda and Taga, 2005) (Fig. 1).

Помимо эпигенетического КПП нейрональная дифференцировка может осуществляться за счет активности nuclear receptor co-repressor 2 (NcoR2; также известного как SMRT), который важен для репрессии H3 trimethyl K27 demethylase, Jumonji domain-containing 3 (Jmjd3; также известной как Kdm6b) (Jepsen et al., 2007). В переднем мозге используется механизм, которые супрессирует передачу сигналов ретиноевой кислоты (RA) (которая направляет клетки на путь нейрональной судьбы), удерживая тем самым клетки в состоянии стволовых клеток до тех пор, пока не появится соотв. лиганд, приводя к высвобождению SMRT. Было установлено, что RA присутствует в поле развивающегося среднего мозга во время первой фазы дифференцировки (Smidt and Burbach, 2007); , следовательно, это механизм может играть роль в супрессии передачи сигналов RA и поддержании судьбы стволовых клеток вплоть до того, пока не произойдет соотв. индукция RA наиболее поздних стадиях дифференцировки.

Epigenetics during differentiation to mdDA neurons

После инициального нейрогенеза, индуцированного с помощью Ngn2, предшественники mdDA начинают экспрессировать Nur-related protein 1 [Nurr1; также известный как nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2 (Nr4a2)], орфановый ядерный гормональный рецептор, который важен для собственно генеза mdDA нейронов и который маркирует пост-митотическую фазу развития mdDA. Соотв., mdDA предшественники супрессируют Ngn2 (Smidt and Burbach, 2007). Вскоре после этого происходит созревание mdDA нейронов, активируется paired-like homeodomain transcription factor 3 (Pitx3). Nurr1 регулирует белки, участвующие в синтезе и транспорте DA, тогда как зависимость от Pitx3 обнаруживается специфически в субпопуляции mdDA нейронов, которые в конечном итоге формируют SNc (Smidt et al., 2004; Jacobs et al., 2011). In vivo, Nurr1 и Pitx3, как было установлено, действуют совместно с геномными локусами некоторых генов, затрагивая тем самым транскрипцию генов, участвующих в DA метаболизме (Jacobs et al., 2009a; Jacobs et al., 2011) (Fig. 2A,B). Более того, эти исследования показали, что Pitx3-обусловленные изменения в экспрессии генов осуществляются посредством эпигенетических механизмов. Fig. 2.

Анализ Pitx3-нулевых мышей показал, что в отсутствие Pitx3, SMRT-HDAC репрессивные комплексы присутствуют в Nurr1 транскрипционном комплексе, репрессируя тем самым гены мишени для Nurr1 (Fig. 2C). После индукции Pitx3, однако, SMRT-HDAC комплекс удаляется и гены мишени для Nurr1 активируются. В согласии с этими наблюдениями, воздействие sodium butyrate (NaB), ингибитора class I and II HDACs, на Pitx3-дефицитные культуры эксплантов ведет к дерепрессии генов мишеней для Nurr1 (Jacobs et al., 2009a).

Второй молекулярный механизм, с помощью которого Pitx3 регулирует развитие mdDA нейронов, является Pitx3-индуцированная передача сигналов RA, которая пространственно ограничена развивающимся SNc (Jacobs et al., 2007; Jacobs et al., 2011) (Fig. 2A). Pitx3 индуцирует синтез RA посредством активации aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A1 (Aldh1A1; также известного как Ahd2), эффективного генератора RA из витамина A в mdDA нейронах (McCaffery and Drager, 1994). RA действует как лиганд RA рецепторов RAR, RAR-RXR и RXR, которые соединяются с геномным RA-responsive elements (RAREs), приводя к высвобождению класса II HDACs (Nebbioso et al., 2010), и запуская экспрессию генов мишеней для RA. RA-индуцированная активация чувствительных к RA элементов может также влиять на экспрессию специфичных для mdDA генов, таких как tyrosine hydroxylase (Th; см. ниже). Такая непосредственная роль RARs в регуляции транскрипции Th гена была подтверждена в SK-N-BE(2)C клетках. в которых RAR соединяется с промотором гена Th и вызывает экспрессию Th в ответ на активацию RAR с помощью RA (Jeong et al., 2006) (Fig. 2D). В подтверждение этому, применение pan-RAR агониста повышает уровни транскриптов Th у Pitx3-дефицитных эмбрионов (Jacobs et al., 2011). Хотя зависимость от RA внутри тотальной популяции предшественников mdDA ограничена ростральным субнабором, который предназначен для формирования SNc, некоторые гены, которые выполняют роль в развитии mdDA, дифференциально регулируются с помощью передачи сигналов RA (Jacobs et al., 2011). Следовательно, RA-индуцированные изменения в ландшафте хроматина могут представлять механизм, который вносит вклад в формирование определенных эпигенетических профилей, отражающих подкласс SNc нейронов mdDA. Одной из мишеней RA, которая супрессируется в развивающемся SNc (Jacobs et al., 2011) это импринтируемый ген delta-like homolog 1 (Dlk1) (Gregg et al., 2010; Rogers et al., 2012). Dlk1 присутствует как в растворимой, так и в связанной с мембраной формах головного мозга и содержит 6 EGF-подобных повторов, это позволяет отнести его к сверхсемейству epidermal growth factor (EGF) (Jensen et al., 2001). Его экспрессия возникает из отцовского аллеля кластера Dlk1-Gtl2, который экспрессируется исключительно в тканях головного мозга и также содержит матерински экспрессируемую некодирующую РНК (ncRNAs) , такую как maternally expressed 3 (Meg3; также известную как Gtl2), и отцовски экспрессируемую deiodinase type III (Dio3) и retro transposon-like 1 (Rtl1) (Lin et al., 2003; da Rocha et al., 2008; Wilkinson et al., 2007). Intergenic germ-line derived differentially methylated region (IG-DMR) присутствует в обоих родительских аллелях кластера, неметилированный в материнском и метилированный в отцовском аллеле (Lin et al., 2003). Недавнее исследование экспрессии специфического отцовского происхождения аллеля в головном мозге мышей, описывает SNc и VTA как горячие точки импринтинга. Среди прочего, Dlk1 был обнаружен импринтируемым в mdDA системе и был найден как экспрессируемый с отцовского аллеля в SNc и VTA (Gregg et al., 2010). Более того, недавно было показано, что постнатальная потеря импринтинга Dlk1 в стволовых клетках и в астроцитах ниш регулирует нейрогенез (Ferron et al., 2011). Наконец, Dlk1 был идентифицирован в качестве мишени Nurr1 в mdDA нейронах и как участник регуляции экспрессии DA транспортера (Dat; Slc6a3) (Jacobs et al., 2009b; Jacobs et al., 2011). Т.о.. хотя Dlk1 является импринтируемым геном, дополнительная регуляция его экспрессии в mdDA нейронах может зависеть от Pitx3 и RA-обеспечиваемой эпигенетической регуляции, которая в свою очередь влияет на экспрессию генов мишеней для Dlk1.

Эпигенетическая регуляция самого гена Pitx3 была приписана двум нейротрофным факторам: glial cell-derived neurotrophic factor (Gdnf) и brain-derived neurotrophic factor (Bdnf), оба поддерживают развитие и жизнеспособность mdDA нейронов. В поле нейронов среднего мозга, Gdnf, который временно экспрессируется из базальной пластинки приблизительно на ст. эмбриогенеза (E) 10.5-11.5, может стимулировать экспрессию Pitx3 посредством активации сигнального пути nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells (NF-κB) (Peng et al., 2011). Более того, Gdnf усиливает экспрессию Bdnf исключительно в присутствии Pitx3 (Peng et al., 2011) (Fig. 3A). Ген Bdnf сам по себе модулируется с помощью экстенсивного метилирования и это облегчает связывание MeCP2 и последующие взаимодействия Hdac1 и Sin3a с промотором Bdnf (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003). Кроме того, после нейрональной активности, Bdnf транскрипция индуцируется посредством фосфорилирования MeCP2, приводя к высвобождению MeCP2 и ассоциированных репрессирующих белков (Chen et al., 2003). Др. фактор, действующий на промотор Bdnf, это cAMP-responsive element binding protein (Creb). Фосфорилирование Creb в ответ на нейрональную активность увеличивает силу его ассоциации с промотором Bdnf, усиливая тем самым активацию транскрипции (Martinowich et al., 2003) (Fig. 3B). Кроме того, передача сигналов Bdnf сама по себе может влиять на эпигенетическую регуляцию. Исследования in vitro показали, что передача сигналов Bdnf вызывает усиление активности nitric oxide (NO) в цитозоле. Химическое добавление NO к glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh), в процессе, так наз. S-nitrosylation, затем облегчает trans-nitrosylation ядерных белков, таких как Hdac2 (Kornberg et al., 2010). Это Bdnf-индуцируемое S-nitrosylation в Hdac2 приводит к высвобождению Hdac2 из хроматина, увеличивает ацетилирование гистонов в промоторах генов, способствует транскрипции и регулирует рост и ветвление дендритов в первичных кортикальных нейронах крыс, возможно за счет активации Creb. Более того, NO индуцирует фосфорилирование Creb и его рекрутирование на ДНК посредством S-nitrosylation ядерных белков, которые ассоциируют с генами мишенями для Creb (Nott et al., 2008; Riccio et al., 2006) (Fig. 3C). Сходный цитозольный эффект, с помощью которого нитрозилирование ингибирует формирование HDAC-репрессивных комплексов, был предположен (Watson and Riccio, 2009).

Эти данные подтверждают, что эффекты Bdnf на развитие нейронов частично могут осуществляться посредством высвобождения HDACs с промоторов, которые участвуют в нейрональной дифференцировке. В согласии с этим, дерепрессия генов мишеней для Nurr1 (Jacobs et al., 2009a) после высвобождения SMRT-HDAC репрессивных комплексов, как было описано выше, может указывать, почему воздействие Bdnf благоприятно для развития и функционирования mdDA нейронов (Sortwell, 2003). Более того, было установлено, что передача сигналов Bdnf, передача сигналов RA и передача сигналов NO пересекаются при защите mdDA нейронов (Katsuki et al., 2009; Kurauchi et al., 2011). Следовательно, возможно, что эти сходящиеся сигнальные события действуют посредством общих механизмов, которые участвуют в изменении эпигенетического состояния генов мишеней для Nurr1 посредством высвобождения HDAC-обусловленной репрессии.

The generation of mature mdDA neurons: epigenenetic control of Th gene expression

В окончательно дифференцированных mdDA нейронах, нейротрансмиттер dopamine генерируется из тирозина, который сначала превращается в dihydroxyphenylalanine (DOPA) с помощью скорость ограничивающего энзима tyrosine hydroxylase (Th), DOPA в свою очередь, превращается в DA посредством активности DOPA decarboxylase (Ddc; также известной как Aadc). Следовательно, Th обычно используется, чтобы метить dopaminergic нейроны и присутствует в зрелых dopaminergic клетках, хотя совместная локализация Th с маркером терминальной дифференцировки Pitx3 ограничена (Maxwell and Li, 2005; Jacobs et al., 2007). Благодаря своей важности в определении фенотипа трансмиттера, Th стал предметом многочисленных исследований, в результате получена детальна информация о сложной региональной организации хроматина промотора Th. Fig. 4.

15 лет назад состояние метилирования ДНК трех CpG сайтов (see Glossary, Box 1) в Th промоторном регионе было обнаружено как тканеспецифическое у грызунов (Okuse et al., 1993); однако значительно позднее выявлен дополнительный регуляторный элемент в первом экзоне Th гена (Aranyi et al., 2005). Это исследование выявило, что метилирование одного специфического CpG в экзоне 1 в Th соответствует неактивному состоянию. Более того, предполагалось, что этот CpG внедрен в элемент связывания transcription factor (TF), было продемонстрировано, что репрессивный zinc finger transcription factor KAISO (также известный как Zbtb33) (Daniel and Reynolds, 1999) связывается только, когда этот CpG метилирован (Aranyi et al., 2005). KAISO повсеместно экспрессируется в головном мозге, при этом наивысшие уровни обнаруживаются в неокортексе, amygdala, гиппокампе и коре мозжечка (Della Ragione et al., 2006). In vitro, KAISO может взаимодействовать с Nco-R комплексами и, следовательно, посредством HDAC взаимодействия может действовать как дополнительный модулятор экспрессии Th (Fig. 4A). В согласии с этим фактом и то, что одиночный CpG регион может удерживать ген Th в репрессивном состоянии, наблюдение, что экспрессия Th может быть простимулирована в клетках нейробластомы путем воздействия деметилирующего агента 5-azacytidine (Aranyi et al., 2005).

На уровне модификации гистонов, было описано, что HDAC ингибиторы (HDACis; see Glossary, Box 1) trichostatin A (TSA) и sodium butyrate (NaB) могут индуцировать активность промотора Th в линиях не нейрональных клеток (Kim et al., 2003). В соответствии с этими находками NaB может восстанавливать экспрессию Th в Pitx3-дефицитных mdDA нейронах (Jacobs et al., 2009a), как отмечено выше, а воздействие с помощью неспецифического HDAC ингибитора valproic acid [VPA, мощный zinc-зависимый класс I и II гистоновых деацетилаз ингибитор, используемый как стабилизатор настроения и противоэпилептическое лекарство (Phiel et al., 2001)], как было установлено, усиливает активность экспрессии Th в первичных культурах нейронов SNc крыс (Monti et al., 2010). VPA ингибирует, среди прочего, Hdac1, который может быть рекрутирован с помощью pyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor (PSF; также известного как Sfpq) на локус Th. Интересно, что рекрутирование HDAC базируется на корректном sumoylation (see Glossary, Box 1) в PSF. PD-ассоциированный белок DJ-1 (Park7) ингибирует эту пост-трансляционную модификацию и увеличивает тем самым экспрессию Th (Zhong et al., 2006). Следовательно, мутации в DJ-1 (PARK7), как было установлено, ассоциируют с PD (Hague et al., 2003), могут быть связаны с отсутствием эпигенетической регуляции, которая может сенсибилизировать Th локус в направлении молчания.

Несколько путей, которые вызывают экспрессию или молчание Th во время развития mdDA нейронов, могут стать предметом эпигенетической регуляции. В нейральных стволовых клетках (NSCs), neurorestrictive silencer factor repressor element 1 silencing transcription factor (NRSF; также известен как Rest), хорошо известный репрессор более 2000 нейрональных генов, как было установлено, репрессирует экспрессию двух microRNAs, miR-9 и в особенности, miR-124, в NSCs (Conaco et al., 2006), предупреждая тем самым NSCs от созревания или выхода из состояния самообновления (Yoo et al., 2011). In vitro исследования подтвердили, что локус Th регулируется с помощью проксимального цис-регуляторного механизма, который использует рекрутирование Rest, co-repressor coREST (также известный как Rcor2) и HDAC (Kim et al., 2006; Yang et al., 2011) (Fig. 4A). Исследования показали, что репрессивный регуляторный регион выше предполагаемого промотора Th полностью метилирован в NSCs, тогда как некоторые CpGs могут быть деметилированы в Th-позитивных клетках. В согласии с этим, не метилированный CpG (-1868 из точки старта транскрипции Th) был локализован внутри сайта связывания метилированных CpG-связывающих белков Mbd2 и MeCP2, которые рекрутируют репрессоры и могут действовать независимо от Rest, выступая в качестве дополнительного репрессивного элемента (Kim et al., 2006; Yang et al., 2011).

Интересно, что роль белков PcG группы (и PcG group-подобных) белков в регуляции гена Th также была описана. У Caenorhabditis elegans, PcG-подобные белки SOP-2 и SOR-3 специфицируют и поддерживают нейрональную судьбу путем регуляции экспрессии DA метаболических энзимов, включая C. elegans гомологичную tyrosine hydroxylase (CAT-2) (Yang et al., 2007). Хотя ещё предстоит определить, действуют ли PcG белки прямо на локус Th у беспозвоночных, важная роль PcG-обеспечиваемой регуляции в программировании mdDA довольно очевидна и нуждается во включении в протоколы репрограммирования соматических клеток.

Наконец, др. эпигенетический уровень регуляции гена Th , как полагают, действует посредством клеточной активности. У крыс первичные культуры среднего мозга, обнаруживают продолжительную деполяризацию мембран при этом хлористый калий усиливает рекрутирование Nurr1 на промотор Th и синхронно увеличивает ацетилирование гистона H3 и триметилирование H3K4 и снижает триметилирование histone 3;lysine (H3K9) и histone 3;lysine 27 (H3K27), приводя к усовершенствованию дифференцировки DA нейронов (He et al., 2011) (Fig. 4B).

DA neurons via stem cells and reprogramming: can epigenetics play a role?

Чтобы получить соизмеримый пул DA нейронов для трансплантации PD пациентам, были проделаны многочисленные попытки, чтобы направить стволовые клетки по пути репрограммирования и дифференцировки в направлении dopaminergic фенотипа. Хотя первоначальные результаты клеточных трансплантаций в SNc пациентов с PD были многообещающими, но клиническое использование оказалось сильно затрудненным из-за долговременных побочных эффектов (Bjorklund et al., 2003), и было предположено, что проблема связана с неспособностью продуцировать соотв. mdDA нейроны (Smidt and Burbach, 2007). Чтобы улучшить протоколы индукции mdDA нейронов,важно было выяснить как молекулярные, так и эпигенетические механизмы, лежащие в основе спецификации здоровых и функциональных субнаборов mdDA нейронов. В недавних попытках генерировать изогенные плюрипотентные стволовые клетки за счет репрограммирования соматических клеток, комбинацией современных факторов де-дифференцировки (Caiazzo et al., 2011), широкого спектра ингибирования HDACs и DNA methyl transferases (DNMTs; see Glossary, Box 1), и активации histone acetyltransferases (HATs) оказалось успешным (Han et al., 2010), подтвердив, что повторная дифференцировка клеток, которые имеют более открытое, сходное со стволовыми клетками состояние хроматина, может быть наиболее эффективным. Однако, интенсивное воздействие HDACis, DNMT ингибиторов и ингибиторов histone methyltransferase может оказаться недостаточным, чтобы вызвать полную плюрипотентность NSCs, происходящих из субвентрикулярной зоны у взрослых (Deleidi et al., 2011). Однако, недавнее исследование по дифференцировке в направлении mdDA нейронального фенотипа с использованием non-mesencephalic NSCs, подтвердило, что использование TSA, неспецифического ингибитора класса I и II histone deacetylases, в комбинации с mdDA-индуцирующими факторами Shh, Fgf8 и Wnt1, чтобы воспроизвести передачу паракринных сигналов в месте развития среднего мозга, более эффективно индуцирует дифференцировку в направлении mdDA-подобных нейронов (Rossler et al., 2010).

Dopaminergic pathologies: understanding epigenetics might have potential for treatment paradigms

Ясно, что эпигенетика участвует в генерации, спецификации и функции mdDA нейронов, понимание роли эпигенетики в поддержании эт их нейронов может быть важным в отношении стимуляции жизнеспособности mdDA нейронов при различных нейродегенеративных заболеваниях и нейрологических нарушениях.

Epigenetic control of and by ?-synuclein

При PD, α-synuclein (α-syn; SNCA) является хорошо известным белком, поскольку его агрегаты являются элементарными компонентами характерных повреждений, известных как тельца Lewy (LBs), которые располагаются в регионах гибели нейрональных клеток (Forno et al., 1996). Ряд недавних исследований показал, что уровень экспрессии гена, кодирующего α-syn регулируется посредством эпигенетических механизмов, благодаря метилированному CpG в интроне 1 благодаря HDAC активности (Du et al., 2010; Jowaed et al., 2010; Matsumoto et al., 2010) (Fig. 5A). Следовательно, частично наблюдаемые результаты после воздействия HDACis в PD моделях могут быть обусловлены изменениями в уровнеα-syn в этих клетках. Более того, косвенным эффектом агрегации α-syn является возможное включение белковых компонентов, участвующих в эпигенетической регуляции, которые должны изменять тем самым эпигенетический ландшафт в затронутых нейронах. Выборки головного мозга умерших людей с PD и у α-syn-экспрессирующих трансгенных мышей, напр., сообщалось, что DNA methyltransferase 1накапливается внутри α-syn агрегатах (Desplats et al., 2011). Более того, сообщалось, что α-syn агрегация используется при репрессии позиционирования в ядре HATs (Fig. 5B) (Kontopoulos et al., 2006). Это подтверждает, что ингибирование агрегации α-syn может облегчать косвенные эффекты на эпигенетическую регуляцию в dopaminergic клетках.

Fig. 5. Epigenetic processes involved in dopaminergic neuronal pathology. (A) The gene encoding α-syn (SNCA), which is involved in the pathogenesis of PD, is regulated by Dnmt1-mediated methylation (top panel). α-Syn is upregulated as a consequence of loss of methylation on the Snca promoter due to loss of nuclear-localized Dnmt1 (which occurs as a consequence of it being sequestered in α-syn aggregates). (B) HDAC inhibitors (green) increase acetylation at the Snca promoter and are thus able to increase the level of α-syn, which in turn is able to lower the level of HATs, again through aggregation within α-syn-containing complexes, thereby influencing the epigenetic landscape of the α-syn-containing dopaminergic neurons.

Influence of pesticides on the epigenetic landscape

Пестициды известны своими вредными эффектами на поддержание dopaminergic нейронов (Moretto and Colosio, 2011). Интересно, что эти пестициды могут влиять на эпигенетические регуляторные механизмы, присутствующие в dopaminergic клетках. Напр., гербицид paraquat (Song et al., 2011) и инсектицид dieldrin (Song et al., 2010), как было установлено, вызывают гиперацетилирование гистона H3 в линии dopaminergic клеток (N27). Для dieldrin, это включает быстрое гиперацетилирование гистона H4, подтверждая прямой эффект на баланс активности HAT/HDAC. Paraquat, напротив, вызывает гиперацетилирование только H3, это ассоциирует с пониженными уровнями белков Hdac4 и Hdac7. В обоих случаях, цитотоксичность может быть ослаблена за счет применения HAT ингибитора anacardic acid (которая ингибирует CBP/p300/P/CAF). Эти данные подтверждают, что , по крайней мере, цитотоксичность этих пестицидов может быть вызвана эпигенетическими изменениями в dopaminergic нейронах. Тот факт, что эпигенетические изменения могут быть результатом воздействия пестицидов, д. быть распознан и использован для понимания рисков развития болезни Паркинсона.

Using epigenetic regulation to promote mdDA neuron survival

Субстанции, которые усиливают ацетилирование гистонов (напр. HDACis) были изучены в отношении их мощных защищающих нейроны эффектов в некоторых моделях Parkinsonian. Многообещающий пример такого HDAC ингибитора, VPA, был изучен особенно тщательно (Kidd and Schneider, 2011) и в первую очередь относительно его утилизации для лечения PD (Hicks et al., 2011). Отметим, не все нейрозащитные эффекты ингибирования HDAC обусловлены деацетилированием связанных с хроматином гистонов. Напр., некоторые HDAC-ингибирующие факторы, включая VPA, , как полагают, ингибируют активность glycogen synthase kinase 3β (Gsk3β), которая негативно связана с жизнеспособностью нейронов (Huang et al., 2011).

Сегодня большинство исследований, связанных с mdDA нейрозащитными эффектами относительно ингибирования HDAC, сфокусированы на участии глиальных клеток и высвобождении этими клетками нейротрофных или воспалительных факторов. Предварительная обработка с помощью VPA первичных культур среднего мозга крыс, напр., может защищать их от lipopolysaccharide (LPS)-индуцированной нейротоксичности за счет снижения высвобождения воспалительных факторов из клеток микроглии (Peng et al., 2005). В последующем исследовании ингибирование HDAC было предположено в качестве лежащего в основе механизма нейропротекции, это было подкреплено наблюдениями, что усиление ацетилирования гистона H3 коррелирует со снижением воспалительных факторов и увеличением апоптоза в популяциях микроглии (Chen et al., 2007). Более того, 3-hydrocymorphinan, аналог dextromethorphan, как было установлено, защищает от LPS токсичности с помощью увеличения ацетилирования гистона H3, которое вызывает усиление экспрессии нейротрофного фактора (Zhang et al., 2006). В соответствии с этим наблюдается усиление активности Bdnf и Gdnf после воздействия VPA в in vitro культурах астроцитов (Chen et al., 2006). Более того, HDAC ингибирование усиливает ацетилирование гистонов H3 в Gdnf промоторе, вызывая повышение уровней мРНК Gdnf в первичных культурах астроцитов (Wu et al., 2008). Кроме того, сходная способность была предположена для др. HDAC ингибиторов, включая TSA и NaB и suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) (Kidd and Schneider, 2010; Chen et al., 2012).

Несколько сообщений описали благоприятные эффекты HDAC ингибиторов на жизнеспособность DA нейронов. HDAC ингибитор phenylbutyrate, как было установлено, защищает mdDA нейроны, возможно за счет увеличения экспрессии DJ-1, который участвует в активации промотора Th, как описано выше (Gardian et al., 2004; Zhou et al., 2011). Более того, beta-hydroxybutyate, эндогенный и специфический ингибитор класса I HDACs (Shimazu et al., 2012) , как было установлено, защищает первичные мезэнцефалические нейроны крыс от индуцированной 1-methyl-4-phenylpyridinium [MPP(+)] токсичности (Kashiwaya et al., 2000). Др. исследования сообщают о регуляции экспрессии хитшокового белка 70 (Hsp70) посредством изменений ди- и триметилирования гистона H3 по лизину 4 (H3K4me2 и H3K4me3) и рекрутирования p300 (HAT) (Marinova et al., 2009; Marinova et al., 2011; Leng et al., 2010). Как член семейства хитшоковых белков, Hsp70 участвует в укладке белков, он способен усиливать активность апоптического регулятора Bcl2, и участвует в нескольких дополнительных анти-апоптических механизмах (Yenari et al., 2005). Кроме того, urocortin (Ucn), нейропептид с HDAC-ингибирующими свойствами, был изучен в отношении его защитных эффектов в первичных мезэнцефалических культурах крыс, и у др. моделей (Bayatti et al., 2003). Защитные эффекты Ucn против спонтанной гибели DA нейронов коррелируют с повышенным ацетилированием гистона H3 acetylation. Помимо своей HDAC-ингибирующей способности, Ucn ингибирует glycogen synthase kinase 3β, и это, как полагают, вносит вклад в Ucn-управляемые нейрозащитные эффекты (Huang et al., 2011). Наконец, pioglitazone, a peroxisome proliferator-activated receptor γ (Pparγ) агонист, как было установлено, ингибирует косвенно ядерную транслокацию Hdac3 в 3-nitropropionic acid-индуцированную животную модель Huntington, тем самым частично ослабляя нейродегенерацию (Napolitano et al., 2011). Это подтверждает, что нейрозащитный эффект pioglitazone, как показано на модели PD (Laloux et al., 2012) может базироваться на ингибировании активности Hdac3 в ядре.

Однако, не смотря на многообещающие результаты, описанные здесь, становится ясно, что HDAC ингибиторы, такие как VPA, могут оказывать вредные эффекты на человека. Напр., сообщалось, что VPA, используемый в качестве противо-психотического лекарства, может вызывать паркисонизм (Mahmoud and Tampi, 2011). Следовательно, клиническое использование лекарств, модулирующих эпигенетику, для обеспечения dopaminergic нейропротекции находится на очень ранней стадией разработки, оценки и понимания посредством экспериментов на животных моделях.

Conclusions

As we have highlighted above, the development of mdDA neuronal precursors and their specification to mature mdDA neurons might rely on many levels of epigenetic regulation. In brief, Polycomb group proteins may be involved in initially defining regional specificity within the midbrain in order to generate an mdDA permissive region and they might additionally have direct influence on crucial mediators of mdDA neuronal specification. Within the mdDA permissive area, precursors then start to differentiate and imprinted factors such as Dlk1 arise, specifying part of the mdDA neuronal phenotype. During the terminal differentiation of mdDA neurons, the regulation of large parts of the transcriptional profile is controlled through inhibition of HDAC occupancy of the involved promoter regions, either through interplay with Nurr1 and/or through RAR-RXR complexes, the latter providing a dual role for RA. In the ventricular zone, RA is involved in maintaining stem cell fate though epigenetic mechanisms, whereas in the differentiation phase, RA plays a role in fine-tuning mdDA neuronal subset specificity. Furthermore, RA provides positional specification in the induction of mdDA neurons that will become SNc neurons in the adult. These inductive signals could rely on RXR-RAR-directed epigenetic mechanisms, mainly involving HDAC regulation. The complexity of the regulatory events occurring at specific promoter sites in mdDA neurons is best illustrated by the regulation of the rate-limiting enzyme in DA synthesis, tyrosine hydroxylase (Th), and it is clear that a multitude of both epigenetic and classic gene regulatory events are essential for proper Th gene regulation.

In the case of cell programming and reprogramming approaches, the ultimate goal is to generate a sizable pool of replacement mdDA neurons. Based on the crucial role of epigenetics in modulating mdDA neuronal fate, epigenetic programming might thus form a new corner stone. From current data, it is clear that some aspects of the mdDA neuronal phenotype can be programmed in vitro; however, the stability and efficiency of this process may be increased if the correct epigenetic marks in such cells are properly generated. This might also circumvent the problem of teratoma formation after transplantation procedures using these neurons. Recent advances in genome methylation and acetylation profiling will provide the means to achieve this goal. Concerning PD pathology, the initial data suggest that epigenetic events, including histone acetylation, can also contribute to mdDA neuronal cell loss and the disruption of mdDA neuron maintenance. However, although in vitro data were promising and suggested that treatment with HDAC inhibitors might overcome some of this pathology, initial data on VPA treatment in humans suggest that we should be careful in translating these in vitro results into a clinical application. Toxic substances and drugs of abuse might also cause a decrease in epigenetic robustness within the short term, whereas aging may be responsible for a slow, ongoing decline in the effectiveness of epigenetic mechanisms to adapt chromatin in order to secure the activity states of vital genes in neuronal viability.

Finally, it seems inevitable that research associated with the mdDA neuronal system needs to embrace epigenome-wide association studies (Rakyan et al., 2011), for which technical limitations are rapidly being surmounted. It seems increasingly likely that promising findings from low-throughput studies, which are reviewed here, will prompt high-throughput studies in a manner comparable to that used in the field of genetics. Such progression will be fruitful for the fundamental understanding of the development, maintenance and specific vulnerability of mdDA neurons and might also facilitate stem cell reprogramming strategies in an ultimate attempt to generate healthy mdDA neurons as a treatment paradigm for PD.

Epigenetic mechanisms in the development and maintenance of dopaminergic neurons Hendrikus J. van Heesbeen, Simone Mesman, Jesse V. Veenvliet and Marten P. Smidt Development 140, 1159-1169.2013 | doi: 10.1242/dev.089359

Epigenetic mechanisms in the development and maintenance of dopaminergic neurons
Hendrikus J. van Heesbeen, Simone Mesman, Jesse V. Veenvliet and Marten P. Smidt
Development 140, 1159-1169.2013 | doi: 10.1242/dev.089359