Посещений:
ТРАНСПОРТ МОРФОГЕНОВ

Формирование морфогенетических градиентов

Morphogen transport
Patrick Muller, Katherine W. Rogers, Shuizi R. Yu, Michae Brand and Alexander F. Schie
Development 2013 V.140, 1621-1638.

The graded distribution of morphogens underlies many of the tissue patterns that form during development. How morphogens disperse from a localized source and how gradients in the target tissue form has been under debate for decades. Recent imaging studies and biophysical measurements have provided evidence for various morphogen transport models ranging from passive mechanisms, such as free or hindered extracellular diffusion, to cell-based dispersal by transcytosis or cytonemes. Here, we analyze these transport models using the morphogens Nodal, fibroblast growth factor and Decapentaplegic as case studies. We propose that most of the available data support the idea that morphogen gradients form by diffusion that is hindered by tortuosity and binding to extracellular molecules.


Рисунки к статье

Уже более ста лет обсуждается роль градиентов сигнальных молекул в управлении формирования тканей во время эмбриогенеза (Morgan, 1901; Turing, 1952; Stumpf, 1966; Wolpert, 1969; Crick, 1970) (reviewed by Rogers and Schier, 2011). Идея таких сигнальных градиентов возникла в результате наблюдений, что некоторые клетки могут индуцировать формирование структур в соседних тканях. Это привело к гипотезе, что сигнальные молекулы, наз. морфогенами, продуцируются в локальном источнике и распределяются по ткани мишени. Возникающий концентрационный градиент морфогена диктует экспрессию разных наборов генов и ведет к формированию тканевого паттерна и морфогенезу. Морфогены действуют на разные дистанции (от десятков до сотен микрометров) и в течение разного времени (от часов до дней) в разных онтогенетических контекстах, от формирования паттерна крыловых предшественников у мух до индукции паттерна зародышевых слоёв у эмбрионов позвоночных (reviewed by Rogers and Schier, 2011).
Предложено несколько моделей для объяснения, как морфогены перемещаются от своего источника по ткани мишени. Мы анализируем недавние исследования и модели транспорта морфогенов. Современные модели транспорта могут быть грубо сгруппированы в: (1) внеклеточные, базирующиеся на диффузии механизмы; and (2) и базирующиеся на клетках механизмы, при которых морфогены перемещаются через клетки или вдоль клеточных выпячиваний. Сначала мы рассмотрим три базирующиеся на диффузии модели внеклеточного транспорта морфогенов (свободная, с препятствиями и облегчаемая диффузия) и два базирующихся на клетках механизма (трансцитоз и обеспечиваемый цитонемами транспорт). Мы использовали математическое моделирование и классическую аналогию 'пьяного моряка', чтобы проиллюстрировать принципы каждой модели. Затем мы проанализирует недавние эксперименты, которые исследовали перемещения морфогенов и обсудим каждую модель транспорта, сфокусировавшись на морфогенах Nodal, fibroblast growth factor (FGF) и Decapentaplegic (Dpp).

Theories of morphogen transport


Морфогены перемещаются от места, где они продуцируются (источника) через сложное окружение, приводя к формированию градиента морфогена в ткани мишени (Fig. 1A). Модели транспорта морфогена поэтому часто используют сложные математические описания, которые включают несколько связанных с частичных дифференциальных уравнений. В упрощенных терминах, эта модель может быть продемонстрирована аналогией с 'drunken sailor' (Fig. 1) (Pearson, 1905a; Pearson, 1905b; Rayleigh, 1905; Stewart, 2001). Согласно этой аналогии, судно (источник) нагруженное пьяными моряками (молекулы морфогена) прибывает в гавань города (ткань мишень). Путь отпущенных на берег пьяных моряков, перемещающихся по городу, иллюстрирует случайное перемещение каждой молекулы по ткани мишени (Fig. 1B, inset). Каждый пьяный моряк перемещается с определенным средним размером шага и движется в случайном направлении с каждым шагом. r walks with a certain average step size and moves in a random direction with each step. Fig. 1.
Разные модели, объясняющие транспорт морфогенов могут быть описаны в терминах аналогичных пьяным морякам.

Transport model 1: free diffusion


В наипростейшем случае дисперсии морфогена молекулы движутся за счет 'свободной диффузии' (see Glossary, Box 1) от источника к ткани мишени. При аналоги с пьяными моряками, каждый моряк движется случайно (Fig. 1B, inset). Динамика дисперсии может быть описана коэффициентом диффузии D. Однако, свободной диффузии недостаточно для формирования градиента: если моряки перемещаются с помощью свободной диффузии, они в конечном итоге будут случайно распределены по городу [т.e. почти униформное распределение молекул морфогена будет наблюдаться в ткани мишени (Wartlick et al., 2009)]. Чтобы сформировать градиент некоторые пьяные моряки д. исчезать по пути; моряки могут умирать (т.e. морфоген деградирует) или могут вступать и оставаться в заведениях (т.e. морфоген постоянно отлавливается клетками). Оба события удаляют моряков/молекулы из мобильного пула и это обозначается как 'clearance' (see Glossary, Box 1). Комбинация пьяных моряков, постоянно выгружаемых с судна (продукция), движение по городу (диффузия) и исчезновение (устранение) вдоль пути будет приводить к градированному распределению моряков по городу со временем (Fig. 1B) (Crick, 1970; Lander et al., 2002; Wartlick et al., 2009; Yu et al., 2009; Zhou et al., 2012). Детальная математическая модель свободной диффузии представлена на Fig. 2A.

Box 1. Glossary

  • Clearance. The removal of morphogen from the mobile pool by degradation or trapping due to permanent immobilization at the cell surface or permanent cellular uptake.
  • Diffusivity. Also referred to as 'diffusion coefficient', 'diffusion constant' or 'diffusion rate', this constant describes how fast a population of molecules spreads. A high value indicates fast spreading, whereas a low value indicates slow spreading.
  • Diffusion regulator. Molecules that interact with morphogens and affect their diffusion. Interactions with diffusion regulators may decrease or increase effective diffusivity. In the hindered diffusion model, transient binding to 'negative' diffusion regulators on the cell surface reduces effective diffusivity, whereas in the facilitated diffusion model 'positive' diffusion regulators enhance effective diffusivity.
  • Effective diffusion. This type of diffusion, which is also referred to as 'global diffusivity', takes into account multi-scale effects such as tortuosity and transient binding. The effective diffusivity of a particle moving through and interacting with a complex environment is typically lower than the free diffusivity of the same particle in solution (Kicheva et al., 2012b).
  • Facilitated diffusion. The enhancement of morphogen diffusivity by a 'positive' diffusion regulator. For example, morphogen binding to a positive diffusion regulator may inhibit interactions with cell surfaces that would otherwise hinder morphogen movement.
  • Free diffusion. The spreading of particles by random walks in solution in the absence of cells or other obstacles. The mean squared displacement of the population of particles is proportional to the diffusion coefficient multiplied by time. This type of diffusion is also referred to as 'molecular diffusion' and is dependent on the size of the diffusing molecule as well as the temperature and viscosity of the surrounding medium (Berg, 1993; Muller and Schier, 2011).
  • Hindered diffusion. Diffusion that is hindered by geometric obstacles, causing an increase in the path length that molecules have to travel, or by transient binding to immobilized molecules.
  • Local diffusivity. The diffusion coefficient that describes the diffusion of molecules in a small, localized volume and does not take into account global effects on movement.
  • > Steady state. In the context of morphogen gradient formation, a gradient has reached steady state when the concentration in space no longer observably changes over time. Note that it is possible to define steady state in terms of the gradient shape as well; the shape of the gradient reaches steady state when the change in concentration in space no longer observably changes over time. Assuming localized constant production, diffusion and uniform clearance, the steady state of gradient shape is determined by the morphogen's effective diffusivity and clearance, whereas the steady state of gradient amplitude also takes into account the lifetime of the cleared morphogen. Thus, gradient shape may reach steady state before the gradient amplitude (Fig. 2).


    • Модель свободной диффузии делает 4 главных предсказания. Во-первых, морфогены движутся за счет внеклеточной диффузии. Во-вторых, морфогены обнаруживают высокую свободную 'diffusivity' (see Glossary, Box 1), которая описывается взаимоотношением Einstein-Stokes (Berg, 1993; Muller and Schier, 2011). Коэффициент диффузии д. быть близким к теоретическим предсказаниям, базирующимися на размере морфогена и свойствах его окружения. В-третьих, то, что позволяет формированию градиента, очищение морфогена более быстрое по сравнению с диффузией (Yu et al., 2009; Zhou et al., 2012). Уменьшение д. достигаться за счет быстрой деградации, во всяком случае, молекулы имеют короткий жизненный период или обнаруживают быструю постоянную иммобилизацию на или внутри клеток мишеней. В последнем случае, фракция свободно перемещающихся молекул маленькая из-за того, что большинство молекул морфогена постоянно отлавливается (Fig. 2A). В-четвертых, кинетика формирования градиента быстрая; форма градиента устанавливается рано и не изменяется (Fig. 2C). Напротив, амплитуда градиента увеличивается, если иммобилизованные молекулы имеют продолжительный период жизни (Fig. 2A).

    Transport model 2: hindered diffusion


    В родственной модели транспорта морфогена, 'hindered diffusion' (see Glossary, Box 1), внеклеточной диффузии молекул мешают препятствия (кривизной обусловленные препятствия) и временные связывающие взаимодействия (связыванием обусловленные препятствия). Возвращаясь к аналогии с пьяными моряками, каждый моряк перемещается по улицам города вокруг строений и временами заходят и покидают пабы вдоль пути. Подобно модели свободной диффузии, морфогены подвергаются случайным перемещениям, но движения ограничиваются клетками и прерываются за счет внеклеточных связывающих взаимодействий.

    Tortuosity-mediated hindrance


    Ткани часто плотно упакованы клетками. В противоположность модели свободной диффузии, которая предполагает, что эффекты геометрии клеток на диффузию незначительны или движение происходит вне поля клеток, диффузия с препятствиями предполагает, что упаковка клеток, а , следовательно, кривизна (see Box 2), сильно влияет на перемещения внеклеточных молекул. Внеклеточные морфогены д. проходить вокруг клеток и это снижает их общую дисперсию (Nicholson and Sykova, 1998; Rusakov and Kullmann, 1998; Nicholson, 2001; Tao and Nicholson, 2004; Thorne and Nicholson, 2006; Thorne et al., 2008). В аналогии с пьяными матросами, матросы осуществляют случайные перемещения в регионе, содержащем строения, а не в пустой местности analogy (Fig. 1C). Хотя локальные перемещения и величина шага моряков идентичны в обоих сценариях, это заставляет моряков в среднем совершать более продолжительное путешествие по той же дистанции в обустроенном регионе (see Box 2). Т.о., в окружении клеток 'локальный' коэффициент внеклеточной диффузии (или 'local diffusivity', see Glossary, Box 1) сходен с таковой при свободной диффузии, тогда как коэффициент 'эффективной диффузии' (see Glossary, Box 1) (или 'глобальная диффузия') уменьшен.

    Box 2. Tortuosity

    The environment in which a molecule diffuses is said to be 'tortuous' if it contains obstacles that increase the geometric path length of the diffusing molecule. For example, a tissue containing tightly packed cells is more tortuous than one with looser cell packing. The more tortuous the environment, the shorter the average distance that a molecule will travel from its starting point.
    To illustrate the effect of tortuosity on diffusion, consider a simple scenario in which a molecule ensemble travels a distance L without obstacles. The average time required to travel distance L is t=L2/D1 (where D is the diffusion coefficient). Now imagine that a cell is located between the molecule and the destination point at length L away from the initial position (see diagram). In this case, the shortest path (dashed line) would be P=? L/2. To reach the destination point in the same amount of time in the presence of a cell, t=L2/D1=P2/D2=(? L/2)2/D2. Thus, the molecules traveling around the cell would need to have a ?2/4?2.5-fold higher diffusion coefficient D2 than D1.


    Binding-mediated hindrance


    В дополнение к геометрическим препятствиям из-за клеток, перемещению морфогена могут препятствовать временное связывание внеклеточных молекул, такие как рецепторы морфогенов или компоненты внеклеточного матрикса (Crank, 1979; Lander et al., 2002; Baeg et al., 2004; Belenkaya et al., 2004; Han et al., 2004; Lin, 2004; Han et al., 2005; Callejo et al., 2006; Hufnagel et al., 2006; Thorne et al., 2008; Wang et al., 2008; Miura et al., 2009; Yan and Lin, 2009; Muller and Schier, 2011; Muller et al., 2012; Sawala et al., 2012). В аналогии с пьяными матросами, моряки часто задерживаются в пабах вдоль пути (Fig. 1D). Локальная 'скорость' моряков перемещения между пабами та же самая как в модели свободной диффузии, но их время задержки в пабах снижает глобальную 'скорость' перемещения по городу. Такие препятствия на пути морфогенов будут снижать коэффициент эффективной диффузии. Детальная математическая модель связыванием обусловленная задержка диффузии представлена на Fig. 2B.
    Ключевые предсказания связыванием обеспечиваемыми препятствиями диффузии являются следующие. Во-первых, морфогены перемещаются посредством внеклеточной диффузию Во-вторых, коэффициент эффективной диффузии ниже, чем коэффициент свободной диффузии, поскольку морфогены временно связываются с внеклеточными иммобилизирующими молекулами ('diffusion regulators', see Glossary, Box 1). В-третьих, количество свободно двигающихся молекул, как ожидается, меньше, поскольку большинство молекул морфогенов пребывает в связи с регуляторами диффузии в данный момент времени (Fig. 2B). В-четвертых, в противоположность модели свободной диффузии очистка от морфогенов не нужна столь быстрая; поскольку глобальная диффузия медленная, градиенты могут сформироваться даже, если мобильные молекулы долгоживущие. В-пятых, форма градиента устанавливается более медленно по времени, чем в модели свободной диффузии из-за более медленной общей дисперсии морфогена (Fig. 2C). Как и в модели свободной диффузии, амплитуда градиента увеличивается со временем, если очистка молекул осуществляется в течение длительного времени (Fig. 2B).
    Отметим, что модели свободной и с препятствиями диффузии в конечном итоге приводят к тому же самому 'устойчивому состоянию' (see Glossary, Box 1) градиента морфогена (Fig. 2A,B), но кинетика образования градиента иная (Fig. 2C). Это отличие особенно важно в быстро развивающихся системах, в которых градиенты могут быть быстро интерпретированы или они не могут достигать устойчивого состояния.

    Transport model 3: facilitated diffusion and shuttling


    Модель базирующаяся на 'облегченной диффузии' (see Glossary, Box 1) является расширением модели диффузии с препятствиями, при которой перемещение морфогена усиливается за счет взаимодействий с 'позитивными' регуляторами диффузии, которые устраняют препятствия, вызываемые 'негативными' регуляторами диффузии. При таком сценарии морфоген в основном неподвижен вплоть до тех пор, пока не будет связан с позитивным регулятором диффузии, который усиливает его подвижность. Неподвижность может вызываться соединением в иммобилизованным регулятором диффузии до тех пор, пока мешают связыванию мобильного регулятора диффузии первого взаимодействия и это позволяет молекулам морфогена перемещаться на длинные расстояния. В аналогии с пьяными моряками, посещающими пабы (негативные регуляторы диффузии; Fig. 1E) до тех пор пока офицер полиции (позитивный регулятор диффузии) не препроводит моряка и не предупредит дальнейшее посещение пабов (Fig. 1F). В этой аналогии пьяные моряки в основном неподвижны и могут двигаться на длинные расстояния, только экскортируемые офицером полиции.
    Движение вперед и назад (shuttling) является специальным случаем облегченной диффузии, при котором 'челноки', не морфогены, а генерируются из локального источника (Holley et al., 1996; Eldar et al., 2002; Mizutani et al., 2005; Shimmi et al., 2005; van der Zee et al., 2006; Ben-Zvi et al., 2008; Wang et al., 2008; Ben-Zvi et al., 2011; Haskel-Ittah et al., 2012; Matsuda and Shimmi, 2012; Sawala et al., 2012). Ассоциация молекул морфогена с челноком приводит к формированию градиента морфогена первоначально широкого или даже униформно распределенного морфогена (Fig. 1E,F). Челночные движения используют повторяющиеся раунды : (1) связывания морфогена с челноком; (2) быстрой диффузии комплекса морфоген-челнок ; (3) деструкции челнока; и (4) иммобилизации морфогена. Если челночные молекулы продуцируются в локально источнике, то морфогены вблизи источника связываются с молекулами челноков и диффундируют прочь. Поскольку комплексы морфоген-челнок диффундируют, челноки деградируют и морфоген иммобилизуется. Вдали от источника челноков молекулы морфогена накапливаются, поскольку они с меньшей вероятностью сталкиваются с челноками и не могут двигаться в меру в отсутствие челноков. В конечном счете, немногие молекулы морфогена обнаруживаются вблизи источника челноков, а концентрируются на расстоянии. Такой процесс генерирует крутой градиент из первоначально униформного распределения морфогена (Fig. 1E,F).
    Модель облегченной диффузии имеет три основных предсказания. Во-первых, при состоянии по умолчанию внеклеточные морфогены неподвижны или существенно задерживаются в своей подвижности. Во-вторых, конкуренция между челноками и регулятором иммобилизованной диффузии высвобождает и мобилизует морфоген. В-третьих локальный источник челноков может генерировать градиент морфогена из первоначально униформно распределенного морфогена.

    Transport model 4: transcytosis


    В качестве альтернативы механизмам внеклеточной диффузии (see Box 3 for a discussion of perceived weaknesses of diffusive transport mechanisms), было предположено, что морфогены транспортируются посредством клеточных механизмов: через клетки (трансцитоз) или вдоль клеточных выпячиваний (cytonemes; see below).



    Box 3. Perceived weaknesses of diffusion-based models

    Diffusion-based models of morphogen dispersal have four potential weaknesses concerning (1) the length of patterning fields, (2) the solubility of morphogens, (3) the reliability of patterning and (4) the geometry of patterning fields (Deuchar, 1970; Ramirez-Weber and Kornberg, 2000; Kornberg and Guha, 2007; Wolpert, 2009; Roy and Kornberg, 2011; Kornberg, 2012). First, diffusion cannot generate appropriate gradients sufficiently quickly when the patterning field is large (reviewed by Muller and Schier, 2011). However, the tissues discussed here are all under 500 ?m in length, which is small enough that gradients can form by diffusion in time spans (hours to days) consistent with the duration of patterning (Crick, 1970). Second, it has been proposed that the post-translational modifications and hydrophobicity of morphogens prevent their diffusion in aqueous environments. However, multiple mechanisms have been identified that serve to solubilize morphogens (reviewed by Muller and Schier, 2011; Creanga et al., 2012; Haskel-Ittah et al., 2012; Mulligan et al., 2012; Sawala et al., 2012; Tukachinsky et al., 2012). Third, it has been argued that morphogen gradients "must be constructed with a high degree of reliability; yet it is unlikely that a substance freely diffusible in the extracellular space could provide a very reproducible long-range distribution" (Kerszberg and Wolpert, 1998). It is clear, however, that precise and robust patterning initiated by morphogen gradients depends on numerous secondary interactions between morphogens, signal transducers, target cells and downstream genes. Thus, secondary interactions can generate highly precise patterns from initially imprecise gradients, and feedback mechanisms can increase the precision of gradients themselves (reviewed by Wartlick et al., 2009; Rogers and Schier, 2011; Kicheva et al., 2012a; Schilling et al., 2012). Fourth, it has been argued that morphogen would be lost from the tissue by diffusion if the tissue geometry were not sufficiently constrained (Kornberg and Guha, 2007; Kornberg, 2012). However, binding interactions can retain the majority of morphogen molecules inside a tissue (Figs 2, 6). Taken together, diffusion-based mechanisms can account for most, if not all, morphogen gradients observed to date, whereas longer-range signaling must rely on mechanisms ranging from cellular extensions to flow-driven transport (reviewed by Muller and Schier, 2011).


    В модели трансцитоза сигнальные молекулы связаны с клеточной поверхностью и подвергаются эндоцитозу. После экзоцитоза сигнал высвобождается снова из клетки. Благодаря множественным раундам потребления и высвобождения клетками молекулы оказываются диспергированы в ткани мишени (Dierick and Bejsovec, 1998; Gonzalez-Gaitan and Jackle, 1999; Entchev et al., 2000; Kruse et al., 2004; Bollenbach et al., 2005; Bollenbach et al., 2007; Gallet et al., 2008; Kicheva et al., 2012b). В терминах аналогии с пьяными моряками молекулы не перемещаются вокруг зданий, а проходят сквозь здания (Fig. 1G). Поскольку пьяные моряки всё ещё движутся случайным образом, этот процесс отражает поведение диффузии, но в противоположность механизмам, рассмотренным выше, это происходит внутри клеток.
    Ключевые предсказания модели трансцитоза следующие. Во-первых, морфоген потребляется и высвобождается клеткой. Во-вторых, коэффициент эффективной диффузии мал, поскольку транспорт морфогене базируется на относительно медленном процессе потребления и выделения его клетками. В-третьих, количества свободно перемещающихся молекул ожидается малым,т.к. большинство молекул морфогена связано с устройствами транспорта в каждый данный момент времени. В-четвертых, градиенты могут формироваться даже когда подвижные молекулы долгоживущие, т.к. глобальная диффузия медленная. В-пятых, форма градиента складывается медленно во времени из-за более медленной общей дисперсии морфогена, как в случае модели с препятствиями диффузии.

    Transport model 5: cytonemes


    Др. альтернативным механизмом является механизм направленной доставки для дисперсии морфогена (Deuchar, 1970; Miller et al., 1995; Ramirez-Weber and Kornberg, 1999; Ramirez-Weber and Kornberg, 2000; Kerszberg and Wolpert, 2007; Kornberg and Guha, 2007; Wolpert, 2009; Roy and Kornberg, 2011; Kornberg, 2012). Один такой механизм использует филоподиальные структуры, чтобы обеспечить транспорт морфогена. Имеется прецедент, что такие клеточные выпячивания служат для исследования окружения, чтобы определить удаленные сигналы или презентации информации др. клеткам (see Box 4) (Gustafson, 1964; Gustafson and Wolpert, 1967; Karp and Solursh, 1985; Bentley and Toroian-Raymond, 1986; Locke, 1987; Miller et al., 1995; Jacinto et al., 2000; Vasioukhin et al., 2000; Milan et al., 2001; Renaud and Simpson, 2001; Sato and Kornberg, 2002; Wolf et al., 2002; De Joussineau et al., 2003; Rorth, 2003; Gallo and Letourneau, 2004; Yuste and Bonhoeffer, 2004; Lehmann et al., 2005; Demontis and Dahmann, 2007; Kress et al., 2007; Cohen et al., 2010; Swaney et al., 2010; Callejo et al., 2011; Cohen et al., 2011; Inaba et al., 2012; Peng et al., 2012; Rojas-Rios et al., 2012; Vitriol and Zheng, 2012). Цитонемная модель строится на этих наблюдениях и постулирует, что длинные динамичные подобные филоподиям структуры, известные как цитонемы проецируются от клеток мишеней и контактируют с клетками, продуцирующими морфоген. Морфогены оказываются поверх и транспортируются вдоль цитонем, чтобы сформировать концентрационный градиент (Ramirez-Weber and Kornberg, 1999; Ramirez-Weber and Kornberg, 2000; Sato and Kornberg, 2002; Hsiung et al., 2005; Kornberg and Guha, 2007; Roy and Kornberg, 2011; Kornberg, 2012), подобно пьяным матросам, использующими туннели для достижения мест предназначения (Fig. 1H).



    Box 4. Signal reception and display by filopodia

    It is currently unclear whether filopodia function as cytonemes in morphogen transport or gradient formation, but there is precedence for non-cytoneme roles of filopodia in signal reception and display. It is firmly established that filopodial extensions probe gradients of chemoattractants and chemorepellents. For example, developing neurons use filopodial extensions to sense guidance cues and to grow towards synaptic targets (reviewed by Gallo and Letourneau, 2004; Vitriol and Zheng, 2012). Similarly, migratory cells reach their destination by navigating gradients of chemoattractants using cellular extensions (reviewed by Swaney et al., 2010). Filopodia can also sense tissue identity and connect neighboring tissues. For example, Drosophila tracheal subunits are connected using FGF-induced cellular extensions (Wolf et al., 2002), and FGF produced in the wing disc attracts tracheal branch filopodia to connect the wing disc to the tracheal system (Sato and Kornberg, 2002). Moreover, during dorsal closure in Drosophila, the fusion of two epithelial sheets on the dorsal side is mediated by filopodia that recognize the identity and registration of the opposing tissues (Jacinto et al., 2000). Filopodia also mediate long-range signaling between distant cells. For example, zebrafish stripes are proposed to form via filopodia-mediated interaction between two pigment cell types. Contact results in cell depolarization and repulsion. In the absence of filopodia, the stripes do not form properly (Inaba et al., 2012). Furthermore, filopodia mediate long-range Notch signaling during Drosophila bristle formation. Delta and its receptor Notch are both membrane bound, and filopodial extensions allow direct contact between distant cells (Renaud and Simpson, 2001; De Joussineau et al., 2003; Cohen et al., 2010; Cohen et al., 2011). Finally, cellular extensions are used to present signals to target cells. For example, cellular protrusions spatially bias EGF signaling during Drosophila mechanosensory organ patterning. EGF-producing source cells send out dynamic protrusions in a biased direction, which is thought to increase the contact and signaling between the producing and the receiving cell (Peng et al., 2012). Similarly, filopodia-like extensions emanating from source cells might present Hedgehog signals to target cells in Drosophila (Callejo et al., 2011; Rojas-Rios et al., 2012).
    Базирующаяся на цитонемах транспортная модель имеет 4 центральных предсказания. Во-первых, морфогены не диффундируют внеклеточно, а переносятся за счет локальных контактов между клеткой источником и мишенью. Во-вторых, морфогены транспортируются с помощью цитонем через поле мишень. В-третьих, цитонемы, исходящие от клеток мишеней ориентированы в направлении источника сигналов на расстояния, которые сравнимы с рангами передач сигналов морфогенов. В-четвертых, поскольку цитонемы д. быть ориентированы в направлении источника морфогена, необходимы рецепторы морфогенов для ощущения источника и создания успешных контактов.

    Experimental analyses of morphogen transport


    В последние годы исследования изображений и биофизические измерения (see Box 5 and Box 6) были использованы для исследования транспортных механизмов различных морфогенов, включая Nodal, FGF и Dpp, а также Bicoid (see Box 7). Хотя эти исследования предоставили некоторую информацию о механизмах, лежащих в основе транспорта морфогенов, они привели также к несопоставимым заключениям. Напр., некоторые механизмы транспорта определенных морфогенов, которые были предположены для формирования градиента с помощью Dpp в крыловых предшественниках Drosophila melanogaster; предоставили доказательства для свободной диффузии, диффузии с препятствиями, трансцитоза и транспорта посредством цитонем (Ramirez-Weber and Kornberg, 1999; Hsiung et al., 2005; Kicheva et al., 2007; Roy et al., 2011; Schwank et al., 2011; Wartlick et al., 2011; Zhou et al., 2012).



    Box 5. Measuring transport by FCS

    Figure Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) analyzes fluorescence fluctuations in small (?femtoliter) volumes (Yu et al., 2009; Griffin et al., 2011; Saunders et al., 2012; Zhou et al., 2012). A laser excites fluorescent molecules in a diffraction-limited and pinhole-confined volume within a tissue. Fluorescence fluctuations are correlated over time and compared with transport model predictions (Ries and Schwille, 2012). FCS thus allows analysis of local transport processes over very short time and length scales. Local extracellular diffusivities of Nodal-GFP and Lefty-GFP were measured in FCS experiments (see figure), similar to those of Yu et al. (Yu et al., 2009). One representative trace of binned fluorescence fluctuations over time is shown. Fluctuations in several of these traces were correlated using different lag times (?) to calculate the autocorrelation function G(?) shown in the autocorrelograms for the zebrafish Nodals Cyclops-GFP and Squint-GFP, as well as for Lefty2-GFP. The diffusion time ?D is inversely related to the free diffusion coefficient Dfree and can be found at the inflection point of G(?). Pair-correlation function (pCF) microscopy (not shown) is conceptually similar to FCS, but is based on spatial image information, and the fluorescence signal in different areas of an image is correlated and compared with a transport model (Digman and Gratton, 2009; Hinde and Cardarelli, 2011). pCF thus allows analysis of transport processes over longer distances than FCS [e.g. ?500 nm in pCF compared with ?300 nm in FCS (Zhou et al., 2012)].

    Box 6. Measuring transport by FRAP and FSAP

    Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) involves photobleaching an area in a fluorescent field and monitoring fluorescence recovery in this area (Lippincott-Schwartz et al., 2003). FRAP can be used to test transport models on different spatial and temporal scales and to determine which factors (e.g. diffusion, production, convection, degradation, binding interactions) influence recovery. Nested FRAP compares fluorescence recovery in the entire bleached area with recovery in a window nested within the bleached area and can determine if recovery is due mainly to diffusion (Sprague and McNally, 2005; Kicheva et al., 2007; Muller et al., 2012; Zhou et al., 2012). FRAP experiments similar to those of Muller et al. (Muller et al., 2012) were performed in zebrafish embryos expressing FGF8-GFP in the presence or absence of exogenous extracellular heparin (A). Nested FRAP in the absence of heparin demonstrates a recovery delay in the nested window, suggesting diffusion-mediated recovery. The delay is not observed in the presence of heparin, probably owing to faster recovery kinetics reflected in the higher effective diffusivity (Deff).
    Fluorescence spreading after photoconversion (FSAP) (B) is an experimental mirror image of FRAP (Lippincott-Schwartz et al., 2003; Griffin et al., 2011; Zhou et al., 2012). Molecules tagged with photoconvertible proteins are photoconverted in a localized area and changes in fluorescence are monitored over time, which provides information about molecule movement or clearance (Drocco et al., 2011; Muller et al., 2012). For example, diffusion out of the photoconverted region would result in an increase in intensity outside of the region.

    Box 7. Bicoid morphogen

    Whereas other morphogens act as extracellular signals in cellularized tissues, Bicoid is a transcription factor that acts in a syncytium. Bicoid patterns the anterior-posterior axis of Drosophila embryos. Maternal bicoid mRNA is deposited at the anterior, leading to a protein gradient along the anterior-posterior axis (Driever and Nusslein-Volhard, 1988a; Driever and Nusslein-Volhard, 1988b; Spirov et al., 2009; Porcher and Dostatni, 2010; Little et al., 2011; Liu and Niranjan, 2011). Measurements of Bicoid-GFP diffusivity in the cytoplasm by FRAP yielded an effective diffusivity of 0.3 ?m2/s at mitotic cycle 14 (Gregor et al., 2007). By contrast, FCS determined a local cytoplasmic diffusivity of 7 ?m2/s in the cytoplasm and detected two populations of Bicoid-GFP with nuclear diffusivities of 0.2 ?m2/s and 8 ?m2/s (Abu-Arish et al., 2010; Porcher et al., 2010). Modeling indicates that a diffusivity of 0.3 ?m2/s is too low to account for gradient formation by diffusion (Gregor et al., 2007). However, diffusivities were measured after the Bicoid gradient is established, and Bicoid might have a higher diffusivity at earlier times. In addition, a recent reassessment of the FRAP experiments that took into account inhomogeneities arising during photobleaching suggests that the effective Bicoid diffusivity might be ?1 ?m2/s, which is fast enough to account for gradient formation (Castle et al., 2011). It has recently been proposed that dynamic membrane invaginations within the syncytial embryo could create tortuous paths that lead to anomalous diffusion of Bicoid at short time scales and to a lowering of the effective diffusivity on longer time scales (Daniels et al., 2012). An effect of membrane invaginations on the diffusivity of Bicoid or other molecules has not been measured, but the short invaginations that exist during early embryogenesis might allow Bicoid to diffuse rapidly enough to account for gradient formation.


    Transport of Nodal morphogens


    Система Nodal/Lefty морфогена формирования паттерна зародышевых листков во время раннего эмбриогенеза в период в нескольких часов и лево-правосторонней оси во время более поздних стадий развития позвоночных (rev. Schier, 2009). Общей темой в этих различающихся контекстах является то, что Nodal и его ингибитор Lefty действуют в разных пределах (see Box 8): Nodal активирует передачу сигналов вблизи источника, тогда как Lefty ингибирует передачу сигналов Nodal вдали от источника (Fig. 3A). Недавние исследования стали обнаруживать некоторые свойства Nodal и Lefty и способа их транспорта.



    Box 8. Signaling range

    The range over which morphogens induce expression of target genes varies substantially. The morphogens Dpp and Wingless (Wg) have relatively short ranges in the Drosophila wing disc (Entchev et al., 2000; Teleman and Cohen, 2000; Kicheva et al., 2007; Bollenbach et al., 2008), Bicoid (Bcd) has a mid-range in Drosophila embryos (Driever and Nusslein-Volhard, 1988a; Driever and Nusslein-Volhard, 1988b; Gregor et al., 2007; Abu-Arish et al., 2010; Porcher et al., 2010; Castle et al., 2011; Drocco et al., 2011), and Nodal and FGF8 can act over longer distances in zebrafish embryos (Gritsman et al., 2000; Chen and Schier, 2001; Harvey and Smith, 2009; Yu et al., 2009; Muller et al., 2012). Intriguingly, Lefty has a much longer range than Nodal, even though both molecules are TGF? superfamily members and expressed in zebrafish embryos. The Thiele modulus (a dimensionless number; Graphic, where D is the diffusion coefficient, k is the clearance rate constant, and L the length of the field) is a measure of the relative range of a signaling molecule with respect to the length of the patterning field, assuming that the gradient is generated by localized production, diffusion and uniform clearance (Thiele, 1939; Goentoro et al., 2006; Reeves and Stathopoulos, 2009; Haskel-Ittah et al., 2012). The Thiele modulus thus defines the term 'gradient range' and allows for comparison of ranges in differently sized patterning fields (e.g. ranging from 200 ?m in the Drosophila wing disc to 500 ?m in early Drosophila embryos). For simplicity, the inverse 1/? is shown in A. Low values indicate a short range, whereas large values indicate a long range. For comparison, the absolute range Graphic is shown in B. ? and 1/? were calculated from literature values of D and k (Gregor et al., 2007; Kicheva et al., 2007; Yu et al., 2009; Abu-Arish et al., 2010; Porcher et al., 2010; Castle et al., 2011; Drocco et al., 2011; Wartlick et al., 2011; Muller et al., 2012; Zhou et al., 2012).


    Fig. 3.
    Extracellular localization of Nodal and Lefty


    Субклеточная локализация морфогенов может быть важным показателем того, как может работать процесс транспорта. Напр., если большинство молекул морфогена находится вне клеток, то становится маловероятным, что концентрационный градиент устанавливается за счет перемещений через клетки (т.е., с помощью трансцитоза). Nodal и Lefty являются членами сверхсемейства transforming growth factor β (TGFβ) и обладают сигнальными последовательностями, необходимыми для секреции (Zhou et al., 1993; Meno et al., 1996; Beck et al., 2002; Sakuma et al., 2002; Le Good et al., 2005; Jing et al., 2006; Blanchet et al., 2008; Tian et al., 2008; Marjoram and Wright, 2011; Muller et al., 2012). Слияние N-терминальных доменов, содержащих сигнальные последовательности, Nodal и др. морфогенов с GFP вызывает секрецию GFP (Entchev et al., 2000; Yu et al., 2009; Muller et al., 2012). Более того, western blot анализ выявил эффективную секрецию эктопических Nodal-GFP и Lefty-GFP во внеклеточное пространство у эмбрионов рыбок данио, а in vivo изображения показали внеклеточную локализацию Nodal-GFP и Lefty-GFP (Muller et al., 2012). Эти результаты подтверждают идею, что Nodal и Lefty секретируются и в основном располагаются вне клеток.

    Tortuosity in the Nodal/Lefty morphogenetic field


    Находка, что Nodal и Lefty преимущественно внеклеточные подтверждает, что они движутся вокруг клеток. Как обсуждалось выше, клетки могут действовать в качестве препятствий, которые увеличивают длину пути диффузии молекул во внеклеточном пространстве (see Box 2). Как результат коэффициент глобальной эффективной диффузии в популяции молекул, движущихся через ткань, д. быть ниже, чем локальная диффузия внутри небольшого внеклеточного объема. Эта идея может быть протестирована путем изучения перемещения секретируемого GFP с использованием техники, которая сравнивает локальную диффузию с глобальной эффективной диффузией. Как описано в Box 5 и Box 6, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) и fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) могут измерять локальную и глобальную диффузии, соотв. FCS эксперименты с секретируемыми GFP у эмбрионов рыбок данио дали коэффициент локальной внеклеточной диффузии ~90 m2/s, который приблизительно вдовое эффективнее коэффициента диффузии ~40 m2/s? измеряемого с помощью FRAP (Yu et al., 2009; Muller et al., 2012). Это согласуется с 50-70% зависимой от изогнутости редукцией диффузии, предсказываемой теорией для пористой среды (Nicholson and Sykova, 1998; Rusakov and Kullmann, 1998; Nicholson, 2001; Tao and Nicholson, 2004) и наблюдаемой в тканях с плотной упаковкой (Thorne and Nicholson, 2006). Эти результаты подтверждают, что архитектура ткани у эмбрионов рыбок данио может препятствовать внеклеточному перемещению морфогена. Интересно, что сходные с секретируемыми GFP, эксперименты с FCS и FRAP показали. что локальная диффузия Lefty-GFP (~40 m2/s) почти вдвое эффективнее диффузии (~20 m2/s) (Table 1). Эти результаты подтверждают, что диффузия секретируемых GFP и Lefty-GFP осуществляется с препятствиями, вызываемыми упаковкой клеток, но не с соединением с регуляторами внеклеточной диффузии.

    Table 1. Global effective and local free diffusion coefficients

    Evidence for hindered diffusion of Nodal


    Поразительно, Nodal-GFP имеет сходну локальную диффузию с таковой для Lefty-GFP (~40 m2/s), но на ~90% более низкую эффективную диффузию (~2 m2/s; Table 1) (Muller et al., 2012). Поскольку секретируемые GFP, Nodal-GFP и Lefty-GFP движутся в одной и той же ткани и сталкиваются с одной и той же извилистостью, то д. сущестовать дополнительные факторы, снижающие эффективную диффузию Nodal-GFP.
    Единственная возможность, что Nodal может временно соединяться с иммобилизованными регуляторами внеклеточной диффузии (Fig. 3B), которые должны снижать его эффективную диффузию (Crank, 1979; Dowd et al., 1999; Miura et al., 2009; Muller et al., 2012), тогда как Lefty не связывается с такими регуляторами и поэтому движется более свободно через ткань (Fig. 3C). Диффузия с препятствиями для морфогенов Nodal не только подтверждается низким коэффициентом эффективной диффузии Nodal, но и также некоторыми дополнительными наблюдениями. Во-первых, измерениями внеклеточной очистки флюоресцентного Nodal у эмбрионов рыбок данио показали длинный внеклеточный период полужизни ~100 мин. (Muller et al., 2012), это противоречит короткому периоду полужизни, предсказываемому некоторыми формами модели свободной диффузии (предполагающих, что внеклеточная очистка представлена очисткой мобильной фракции). Во-вторых, гнездовые FRAP эксперименты (see Box 6) подтверждают модель диффузии с препятствиями для транспорта Nodal. Эти эксперименты сравнимы с восстановлением флюоресценции после фотообесцвечивания (photobleaching) в двух окнах: одно соответствует всему домену обесцвечивания и значительно меньшему гнездящемуся внутри домена обесцвечивания. Как и предсказывалось моделью диффузии с препятствиями, восстановление Nodal-GFP в меньшем окне задержано по сравнению с большим окном (Muller et al., 2012). Этот результат согласуется с моделью свободной диффузии, которая предсказывает очень небольшую, экспериментально не определяемую задержку при гнездовых FRAP экспериментах. В-третьих, форма градиента Nodal согласуется с измеряемой скоростью очистки и коэффициентом эффективной диффузии и подтверждает модель диффузии с препятствиями (Muller et al., 2012). Учитывая медленную очистку и быструю локальную диффузию Nodal, градиенты, формируемые свободной диффузией будут слишком уплощенными, чтобы объяснить наблюдаемый градиент.
    Эндогенный Nodal градиент пока не проанализирован и характерные особенности потенциального внеклеточного регулятора диффузии Nodal пока неизвестны, но все доступные данные подтверждают предсказания модели диффузии с препятствиями: внеклеточная локализация морфогена, высокая локальная подвижность, низкая глобальная эффективная подвижность, низкая очистка мобильных белков, задержка восстановления в гнездовых FRAP экспериментах и форма градиента, согласующаяся с этими биофизическими измерениями.

    Transport of FGF morphogens


    FGFs являются сигналами с разнообразными ролями в развитии и гомеостазе. Недавние биофизические измерения на живых эмбрионах рыбок данио (Yu et al., 2009; Nowak et al., 2011) и на культивируемых фибробласт ах молочных желез (Duchesne et al., 2012) предоставили информацию о движениях FGFs (FGF2 и FGF8 в частности) от nano- к микроскопической шкале и совместно подтвердили модель диффузии с препятствиями для транспорта морфогенов FGF.

    Evidence for hindered diffusion of FGF8


    Формирование паттерна FGF8 вдоль дорсо-вентральной и анимально-вегетативной осей во время эмбриогенеза рыбок данио осуществляется в течение нескольких часов. FGF8 продуцируется в локальном источнике и , как полагают, формирует градиент за счет диффузии и очистки, обеспечиваемой с помощью эндоцитоза (Scholpp and Brand, 2004; Yu et al., 2009). Флюоресцентно меченные молекулы FGF8 обнаруживают коэффициент локальной внеклеточной диффузии ~50-80 m2/s как было установлено с помощью FCS (Table 1) (Yu et al., 2009; Nowak et al., 2011), но коэффициент эффективной диффузии ~2 m2/s, как определено в экспериментах FRAP (see Box 6). Т.о., подобно Nodal, FGF8 обнаруживает высокую локальную диффузию, но низкую глобальную эффективную диффузию, соответствующие предсказаниям модели диффузии с препятствиями.
    Эволюция внеклеточного FGF8 градиента предоставляет дополнительное подтверждение диффузии с препятствиями. Форма градиента медленно возникает со временем и достигает устойчивого состояния спустя только 3 - 4 ч (Fig. 4A) (Yu et al., 2009). Медленное становление формы градиента согласуется с моделью диффузии с препятствиями (Fig. 4B), но не с моделью свободной диффузии (Fig. 4C). Fig. 4.

    HSPGs as diffusion regulators


    Что может препятствовать перемещению FGFs? Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) являются прекрасными кандидатами на роль регуляторов диффузии. FGFs, как известно, взаимодействуют с длинными цепочками сахаров, прикрепленными к стержню белка HSPG (Dowd et al., 1999; Makarenkova et al., 2009; Miura et al., 2009). разрушение взаимодействий между HSPGs и FGF2, напр., ведет к драматическому увеличению коэффициента диффузии FGF2, подтверждая, что HSPGs могут действовать как негативные регуляторы диффузии FGF2 (Dowd et al., 1999). В самом деле, математическое моделирование диффузии с препятствиями с быстрой кинетикой обратимого связывания воспроизводит экспериментальные наблюдения перемещения FGF2 (Dowd et al., 1999).
    Недавний подход по отслеживанию одиночных частиц предоставил более детальный вид того, как HSPGs влияют на подвижность FGF2 (Duchesne et al., 2012). FGF2 молекулы образуют кластеры зависимым от HSPG способом во внеклеточном матриксе. FGF2 тратят большую часть своего времени на ограничивающее движение соединение с HSPG-зависимыми кластерами, но молекулы FGF2 не постоянно закреплены и могут диффундировать после покидания кластера. Эти результаты подтверждают центральный догмат модели диффузии с препятствиями: в каждый данный момент времени большинство молекул морфогена обратимо соединено с регуляторами диффузии.
    Роль HSPGs в качестве регуляторов диффузии подтверждается также исследованиями in vivo FGF8 у рыбок данио, хотя наблюдение за одиночными молекулами ещё не достигнуто в этом отношении. Во-первых, более высокая фракция FGF8-GFP подвижна, когда цепочки сахаров HSPG разрушены инъекциями heparinase I во внеклеточное пространство (Yu et al., 2009). Во-вторых, FGF8-GFP обладает более высоким коэффициентом эффективной диффузии у эмбрионов, которым инъецировали внеклеточно heparin, который, как полагают, конкурирует с эндогенными HSPGs за связывание FGF8 (Fig. 4D). В-третьих, в основном локализованный на мембране FGF8-GFP сигнал становится более диффузным во внеклеточном пространстве после инъекции heparin, подтверждая, что такое воздействие прерывает взаимодействия с регуляторами диффузии, что удерживает FGF8-GFP на клеточной поверхности (Fig. 4D).
    Итак, недавние исследования транспорта FGF2 и FGF8 подтвердили следующий сценарий диффузии с препятствиями. FGF секретируется клетками источника. но быстро связывается с HSPGs на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе. FGF молекулы освобождаются от HSPGs после определенного времени пребывания и или диффундируют и соединяются с др. HSPG молекулами или движутся прочь от клеточной поверхности и диффундируют свободно. По этому сценарию большинство FGF молекул оказываются связанными в HSPGs и тем самым концентрируются на клеточной поверхности, тогда как небольшая фракция свободно перемещающихся молекул FGF обнаруживается далеко от клеточной поверхности. Т.о., диффузия морфогена перемежается связыванием с HSPGs и это объясняет образование градиента FGF.

    Transport of Dpp morphogen


    Dpp является секретируемым членом сверхсемейства TGFβ и гомологом bone morphogenetic proteins (BMPs) позвоночных (Panganiban et al., 1990a; Panganiban et al., 1990b; Lecuit et al., 1996; Nellen et al., 1996; Lecuit and Cohen, 1998; Entchev et al., 2000; Teleman and Cohen, 2000; Gibson et al., 2002; Belenkaya et al., 2004; Kruse et al., 2004; Kicheva et al., 2007; Schwank et al., 2011; Zhou et al., 2012). Градиент Dpp образуется из локального источника и формирует паттерн крыловых имагинальных дисков [эпителиальную ткань крыловых предшественников, которая первоначально плоская, а позднее приобретает легкую кривизну и множественные складки (Sui et al., 2012)] в течение нескольких денй во время личиночной стадии развития Drosophila (Entchev et al., 2000; Teleman and Cohen, 2000). Перемещение флюоресцентно меченного Dpp наблюдалось непосредственно в эксплантированных крыловых дисках дрозофилы и множественные транспортные модели были предложены для объяснения образования градиента Dpp.

    Localization of Dpp


    Dpp присутствует как внутри клеток, так и вне клеток, но его относительные уровни в разных местах спорны (Entchev et al., 2000; Teleman and Cohen, 2000; Belenkaya et al., 2004; Schwank et al., 2011). Несколько линий доказательств подтверждает, что Dpp в основном внеклеточный. Напр., инкубация интактных крыловых дисков с proteinase K ведет к перевариванию большинства зрелых Dpp-GFP (Teleman and Cohen, 2000). Это подтверждает, что Dpp доступен вне клеток, хотя это может указывать на то, что proteinase K может быть интернализована с помощью эндоцитоза и поэтому может также деградировать внутриклеточный Dpp. Дополнительным подтверждением внеклеточного расположения является то, что инкубация dpp-GFP-экспрессирующих крыловых дисков с anti-GFP антителами приводит к экстенсивному внеклеточному мечению Dpp-GFP (Belenkaya et al., 2004; Kruse et al., 2004; Schwank et al., 2011). Хотя эти эксперименты согласуются с внеклеточной локализацией Dpp-GFP, они не показывают, является ли эта фракция Dpp подвижной, как этого требует модель внеклеточной диффузии. Напротив, остается неясным, может ли внутриклеточный Dpp высвобождаться, как того требует модель трансцитоза, или если Dpp передается к и транспортируется с помощью клеточных выпячиваний, как того требует to цитонемная модель.

    Experimental evidence for Dpp diffusion


    FCS и pair-correlation function (pCF) микроскопический анализ (see Box 5) показывают, что фракция флюоресцентно меченного Dpp движется с коэффициентом локальной диффузии ~20 m2/s dj внеклеточном пространствеe (Zhou et al., 2012). Эти измерения подтверждают модель внеклеточной диффузии, но не позволяют сделать отличия между свободной и с препятствиями диффузией. Сходным образом, современные данные по кинетике формирования градиента (Entchev et al., 2000; Teleman and Cohen, 2000) не позволяют отличать между механизмами свободной диффузии и диффузии с препятствиями (Fig. 5A-C). Fig. 5.
    Как обсуждалось выше, ключевым предсказанием модели свободной диффузии является быстрая очистка морфогена: в ходе образования градиента свободно диффундирующий Dpp д. быстро удаляться из мобильного пула с периодом полужизни менее 15 сек. (Zhou et al., 2012). Скорость очистки Dpp не была измерена экспериментально (Kicheva et al., 2012b), но такой низкий период полужизни д. возникать в результате быстрого и необратимого связывания с рецепторами или др. иммобилизующими внеклеточными молекулами (Lander et al., 2002). Альтернативно, высокие скорости клеточного потребления могут быстро очищать от Dpp, но этот сценарий, скорее всего, менее вероятен т.к. интернализация лиганда в др. системах может длиться несколько минут (Lander et al., 2002).
    Так, вследствие быстрой очистки лишь очень небольшая фракция Dpp-GFP д. быть подвижной вне клеток (Fig. 2A). В соответствие с этой идеей, пульсовая метка Dpp не обнаруживалась в движении в экспериментах fluorescence spreading after photoconversion (FSAP) (see Box 6; Fig. 5D) (Zhou et al., 2012). FSAP эксперименты подтверждают модель свободной диффузии для транспорта Dpp, но они также согласуются с моделью диффузии с препятствиями, с захватом за счет потребления клетками или с постоянной иммобилизацией (see Fig. 5D-F for details).
    Ключевым предсказанием модели диффузии с препятствиями является то, что глобальная диффузия д. быть существенно снижена за счет извилистости и временного связывания. Базируясь на FRAP экспериментах, было предположено, что Dpp-GFP обладает низкой глобальной эффективной диффузией в ~0.1 m2/s в крыловом диске (Table 1) (Kicheva et al., 2007). Почти на 95% ниже коэффициент эффективной диффузии (Wartlick et al., 2011) был предположен для более мелких гальтерных имагинальных дисков (предшественников малых крылоподобных органов, необходимых для балансировки), возможно из-за более высокой концентрации регуляторов диффузии в этой ткани (Crickmore and Mann, 2006; de Navas et al., 2006; Crickmore and Mann, 2007; Makhijani et al., 2007). Однако, эти заключения ставятся под вопрос недавними экспериментами (Zhou et al., 2012), которые подтверждают, что кинетика флюоресцентного восстановления Dpp-GFP доминирует не за счёт диффузии, а за счет скорости захвата и деградации низких уровней высоко подвижных Dpp (Fig. 5G).
    Обусловлена ли кинетика медленного восстановления Dpp-GFP диффузией с препятствиями или свободной диффузией может быть определена с помощью экспериментов по гнездовому FRAP (Fig. 5G; see Box 6). В модели свободной диффузии низкие уровни мобильных молекул д. быстро перемещаться в обесцвеченном окне и заполнять его почти униформно. Захват мобильных молекул д. приводить к гомогенным изменениям в возрастании флюоресценции в окне обесцвечивания вдоль градиента со временем. Напротив, диффузия с препятствиями предсказывает, что мобильные молекулы движутся медленно в окне обесцвечивания, вызывая восстановление флюоресценции в наружном окне прежде внутреннего окна. Т.о., диффузия с препятствиями предсказывает задержку в восстановлении во внутреннем окне, тогда как свободная диффузия предсказывает, что восстановление в в обоих окнах будет экспериментально неотличимо в ранние времена. Такие эксперименты смогут различить между моделями свободно диффузии и с препятствиями, но, неожиданно разные группы получили противоречивые результаты в экспериментах с гнездовым FRAP (Kicheva et al., 2007; Zhou et al., 2012).
    В соответствии с моделью диффузии с препятствиями для транспорта FGF, рассмотренного выше, временное связывание Dpp с HSPGs может замедлять диффузию Dpp (Panganiban et al., 1990a; Fujise et al., 2003; Belenkaya et al., 2004; Han et al., 2004; Takei et al., 2004; Akiyama et al., 2008; Dejima et al., 2011). Редуцированные уровни Dpp обнаруживаются в тканях, дефицитных по HSPG (Fujise et al., 2003; Belenkaya et al., 2004; Han et al., 2004; Takei et al., 2004; Akiyama et al., 2008), а повышенные уровни HSPGs в источнике приводят к значительно более крутому градиенту Dpp (Fujise et al., 2003). Т.о., HSPGs может действовать в качестве регулятора диффузии Dpp, что задерживает перемещение Dpp по ткани.

    Is Dpp diffusion incompatible with tissue architecture?


    Считается, что "gradient formation based on passive diffusion is incompatible with the [...] geometries of the biological systems that use morphogen gradients to regulate their growth and patterning" (Roy and Kornberg, 2011) и что диффузия "is an unlikely mechanism to move morphogens for long distances in the plane of the epithelium if it cannot prevent them from moving even a short distance out of the plane" (Kornberg and Guha, 2007). В контексте формирования Dpp градиента в крыловых дисках Drosophila, это подразумевает, что перемещения Dpp д. быть ограничены в плоскости эпителия и что внеклеточная диффузия не может удерживать Dpp (see Box 3 for other perceived weaknesses of diffusion-based models). Вместо этого, механизмы дисперсии, базирующиеся на клетках, такие как трансцитоз и цитонемы (discussed below), д. быть необходимы для ограничения перемещений Dpp в плоскости эпителия.
    Крыловой диск является эпителиальным слоем (диск собственно), который покрыт апикально заполненным жидкостью пространством, сходен по геометрии с показанным на Fig. 2A. Интуитивно можно рассматривать, что когда секретируется морфоген и движется прочь от источника, то он будет теряться в пространстве, заполненном жидкостью (Kornberg, 2012). Это понимание не корректно: связующие взаимодействия могут предупреждать потерю морфогена и сохранять большинство молекул внутри плоскости, даже нли движения не ограничены плоскостью. Чтобы использовать аналогию с пьяными моряками, моряки могут сталкиваться с полосой пабов (эпителием), расположенным по соседству с открытым полем (заполненным жидкостью пространством; Fig. 6A). Перемещения моряков не ограничены полосой, но моряки засиживаются в пабах и это мешает их перемещению. Как следствие большинство моряков обнаруживается внутри пабов в течение времени скорее, чем в открытом поле. Аналогично градиент моряков может формироваться, если имеется локальный источник моряков (Fig. 6B,C). Fig. 6.
    Эта модель подтверждается моделированием, показавшим, что комбинация (1) локальной продукции морфогена, (2) диффузии как в собственно диске, так и в пространстве, заполненном жидкостью и (3) связыванием и удалением в собственно диске приводят к формированию градиента морфогена в плоскости собственно диска (Fig. 2A,B). Градиент низкого уровня образуется также в заполненном жидкостью пространстве благодаря 'абсорбирующему' эффекту связывания в собственно диске. Вдали от собственно диска молекулы морфогена распределены почти униформно, но распределение в заполненном жидкостью пространстве в основном безразлично, поскольку концентрации морфогена очень низки, а рецепторы морфогена присутствуют только в собственно диске. Важно, что большинство молекул связано с собственно диском градированным способом. Т.о, градиенты на дальние расстояния в плосткости эпителия могут формироваться за счет диффузии, несмотря на неограниченные перемещения как внутри, так и вне плоскости.

    Experimental evidence for transcytosis of Dpp


    Трансцитоз был предположен в качестве механизма транспорта Dpp и некоторых др. морфогенов (Dierick and Bejsovec, 1998; Entchev et al., 2000; Kruse et al., 2004; Bollenbach et al., 2007; Gallet et al., 2008). Специфические доказательства в подтверждение трансцитоза получены в экспериментах, которые влияли на эндоцитоз и Dpp рецептор Tkv: Dpp-GFP накапливается внеклеточно вокруг клонов, лишенных Tkv, а клоны, которые не могут осуществлять эндоцитоз, обнаруживают временное снижение уровней Dpp внутри и вне клонов (Entchev et al., 2000). Более того, глобальное, но временное ингибирование эндоцитоза может предупреждать наблюдаемое распространение Dpp-GFP, которое восстанавливается, если восстанавливается эндоцитоз (Kicheva et al., 2007). Эти находки подтверждают идею, что рецепторами обеспечиваемый эндоцитоз необходим для перемещения Dpp. Однако этот вывод подрывается заключением, что tkv мутантные клоны скорее аномальны (Schwank et al., 2011). В самом деле, tkv мутантные клоны обычно элиминируются благодаря активности транскрипционного фактора Brinker, а Dpp может перемещаться через регионы, свободные от рецептора, которые мутантны и по tkv и brinker (Schwank et al., 2011). Эти результаты подтверждают, эндоцитоз, обеспечиваемый рецепторами, не играет роли в перемещениях Dpp. Всё ещё возможен, однако, независимый от рецепторов способ интернализации (напр., потребление жидкой фазы или интернализация, стимулируемая альтернативным соединением с партнером, связанным с мембраной) обеспечивающей трансцитоз.
    Дополнительные доказательства против трансцитоза связаны с отсутствием выявляемого распределения Dpp во время FSAP экспериментов, описанных выше (Zhou et al., 2012) (Fig. 5D), несмотря на утверждение, что существенная фракция внутриклеточного Dpp д. перемещаться за счет трансцитоза. Наконец, ключевое предсказание модели трансцитоза, т.к. повторяющиеся клеточное потребление и высвобождение не обнаружены ни для одного из морфогенов.

    Experimental evidence for cytoneme-mediated transport of Dpp


    Хорошо известно, что похожие на филоподии отростки могут обеспечивать передачу сигналов между удаленными клетками (see Box 4), но было подтверждено, что эти структуры также необходимы для траспорта морфогенов и образования градиента. Напр., филоподии в культивируемых клетках млекопитающих м. транспортировать сигналы в тело клетки (Lidke et al., 2004; Lidke et al., 2005). Филоподия-подобные выпячивания, наз. цитонемами, исходящие от клеток мишеней в крыловых дисках Drosophila и проецирующиеся на источник Dpp (Ramirez-Weber and Kornberg, 1999; Hsiung et al., 2005; Roy et al., 2011). Было предположено, что Dpp переносится в и доставляется вдоль цитонем, приводя к образованию градиента Dpp (Roy et al., 2011). Имеются четкая связь между цитонемами и передачей сигналов Dpp: образование цитонем нуждается в передаче сигналов Dpp; эктопические источники Dpp могут ориентировать цитонемы; а пузырьки, содержащие Dpp рецепторы (Tkv) обнаруживаются вдоль всей длины цитонем (Fig. 7). Эти наблюдения подтверждают роль Dpp в образовании цитонем и полярности, но неясно, участвуют ли цитонемы в формировании градиента Dpp. Напр., неизвестно, ассоциирует ли Dpp с и транспортируется ли цитонемами крыловых дисков (Hsiung et al., 2005; Demontis and Dahmann, 2007), и отсутствуют доказательства, что цитонемы необходимы для формирования градиента Dpp. Fig. 7.
    Как можно протестировать роль цитонем в формировании градиента? Единственная возможность блокировать или снизить образование цитонем и определить, будет ли формироваться градиент. Такой эксперимент оказался выполнимым путем наблюдения, что униформный Dpp вызывает образование коротких дезориентированных цитонем (Fig. 7B) (Ramirez-Weber and Kornberg, 1999; Hsiung et al., 2005; Roy et al., 2011). Если цитонемы необходимы для образования градиента, то униформная экспрессия немеченного Dpp должна не только блокировать образование длинных цитонем, но и также предотвращать образование градиента (или существенно снижать шкалу длин градиента) Dpp-GFP, экспрессируемого из эндогенного источника Dpp (Fig. 7C). Этот эксперимент еще не проведен на Drosophila, но у эмбрионов рыбок данио градиенты Nodal-GFP формируются собственно даже, когда немеченный Nodal экспрессируется повсеместно (Muller et al., 2012).

    Shuttling of Dpp in the early Drosophila embryo


    Dpp формирует паттерны не только в личиночных крыловых дисках, но и вдоль дорсо-вентральной оси во время раннего эмбриогенеза. В этом контексте, dpp РНК экспрессируется дорсо-латерально в широком домене, но Dpp белок образует острый градиент с пиком в дорсальной части (Fig. 8A). Это указывает на то, что этот градиент образуется с помощью челноков для молекул Dpp в направлении дорсальной стороны. В противовес моделям транспорта, при которых морфогены экспрессируются от локального источника, челночные движения делают возможным образование градиента в отсутствие локального источника морфогена. Fig. 8.
    Перемещению Dpp у ранних эмбрионов мешает строгое соединение с ассоциированным на клеточной поверхности коллагеном (Wang et al., 2008; Sawala et al., 2012). Dpp может быть освобожден от коллагена и стать подвижным благодаря связыванию с секретируемым Short gastrulation (Sog) комплексом (the shuttle). Протеаза Tolloid расщепляет Sog и высвобождает Dpp из этого комплекса на дорсальной стороне эмбриона. Dpp , как полагают, затем повторно ассоциирует с неподвижным коллагеном. Поскольку Sog экспрессируется в более вентральном домене, чем Dpp, то повторные раунды образования комплексов, быстрая диффузия и расщепление Sog ведут к накоплению Dpp на дорсальной стороне эмбриона (Fig. 8A; Fig. 1E,F). Поразительно, Dpp-GFP, экспрессируемый в полоске перпендикулярно своему эндогенному домену экспрессии, также перераспределяется на дорсальной стороне, строго подтверждая челночную модель (Wang and Ferguson, 2005).
    Сходный механизм может действовать и при передаче сигналов BMP-Chordin у лягушек (Reversade and De Robertis, 2005; Ben-Zvi et al., 2008; Francois et al., 2009). Более того, вариация темы челноков, при которой локальный источник молекул челноков генерируется за счет самоорганизации, была недавно описана для системы морфогена Spatzle (Haskel-Ittah et al., 2012), которая формирует паттерн вдоль дорсо-вентральной оси у Drosophila перед началом формирования системы паттерна Dpp (see Fig. 8B,C for details). Несмотря на элегантность челночной модели, прямая визуализация и биофизические измерения диффузии Dpp/BMP или Spatzle и челночного перемещения всё ещё недоступны (см Box 9).



    Box 9. Biophysical evidence for shuttling

    Direct biophysical measurements of diffusion and shuttling in the Dpp/BMP and Spatzle morphogen systems are currently lacking. However, biophysical evidence supporting the shuttling model exists for other cell fate determinants that do not act as classical morphogens (Tenlen et al., 2008; Daniels et al., 2009; Daniels et al., 2010; Griffin et al., 2011). For example, a gradient of the cell fate determinant MEX-5 patterns the anterior-posterior axis in Caenorhabditis elegans embryos. At the one-cell stage, MEX-5 is initially distributed uniformly throughout the embryo and bound to RNA, which hinders its diffusion (D?0.07 ?m2/s) (Griffin et al., 2011). Phosphorylation by the kinase PAR-1 prevents MEX-5 from binding to RNA and therefore increases its diffusivity (D?5 ?m2/s). Thus, RNAs act as negative diffusion regulators, whereas PAR-1 acts as a positive diffusion regulator of MEX-5. Shortly after fertilization, the kinase PAR-1 becomes localized in a gradient that peaks on the posterior side of the embryo, whereas a phosphatase that dephosphorylates MEX-5, and thereby allows reassociation with largely immobile RNAs, is uniformly distributed throughout the embryo. Conceptually similar to Dpp and Spatzle shuttling, repeated rounds of RNA binding, phosphorylation, rapid diffusion and dephosphorylation lead to the concentration of MEX-5 on the anterior side (Griffin et al., 2011).


    Conclusions and perspectives


    The morphogen concept was conceived more than a century ago, and the distribution of a morphogen (Bicoid, see Box 7) within an embryo was first visualized 25 years ago (reviewed by Rogers and Schier, 2011). Over the last ten years, biophysical research has started to explore the dynamics of morphogen movement and gradient formation to reveal potential modes of morphogen transport. Our analysis of the currently available data leads us to favor diffusion-based models of morphogen transport: morphogens move through tissues by diffusion that is slowed down by tortuosity and hindered (and in some cases facilitated) by transient binding to extracellular molecules.
    Future research will address the following questions. Does a universal morphogen transport mechanism exist, or do morphogens use unique dispersal strategies depending on developmental context (Kornberg, 2012)? Why do signaling ranges differ widely between morphogens and tissue contexts [including the apical and basal surfaces of the same epithelium (Ayers et al., 2010)]? How is morphogen movement affected by the growth and morphogenesis of target tissues? What factors regulate morphogen movement and signaling range? What does the environment through which morphogens move look like, and how does that environment affect dispersal? What are the nanometer to micrometer scale transport mechanisms that together lead to macroscopic gradient formation (Muller and Schier, 2011)?
    Answers to these questions might be found using quantitative imaging and modeling techniques, such as single-plane illumination microscopy FCS (SPIM-FCS) (Sankaran et al., 2010; Wohland et al., 2010; Capoulade et al., 2011), single-particle tracking (Duchesne et al., 2012) and multi-scale modeling approaches (Kavousanakis et al., 2010; Sample and Shvartsman, 2010; Daniels et al., 2012), to analyze transport over different time and length scales (Grimm et al., 2010). Such approaches will help to reveal more clearly how morphogen gradients form during development.