Члены Hox семе1йства транскрипционных факторов экспрессируются в ограниченных доменах вдоль оси тела и во многих развивающихся органах, при этом они играют критическую роль в спецификации клеточных характеристик (reviewed in Maconochie et al.,1996; Pearson et al.,2005, Iimura and Pourquie,2007; Guthrie,2007; Dasen and Jessell,2009; Tumpel et al.,2009). В последние годы, огромное количество данных показало, что эти белки управляют формированием паттерна нервной системы на многих уровнях, от регионализации спинного мозга до спецификации субпопуляций индивидуальных нейронов (Bell et al.,1999; Jungbluth et al.,1999; Ensini et al.,1998; Lance-Jones et al.,2001; Dasen et al.,2003,2005; Shah et al.,2004; Wu et al.,2008; Jung et al.,2010). Остается вопрос, как индивидуальные Hox факторы передают сегмент- или регион-специфические инструкции, принимая во внимание, что большинство связывает сходные сайты распознавнаия на ДНК благодаря высоко законсервированному гомеодомену (reviewed in Gehring,1994; Hoey and Levine,1988; Desplan et al.,1988). Такая избыточность указывает на то, что некоторые специфические нижестоящие эффекты экспрессии Hox продиктованы межбелковыми взаимодействиями, использующими не-гоме5одоменовые регионы Hox транскрипционных факторов.

Среди партнеров Hox известны те, что модифицируют специфичность связывания Hox-ДНК и влияют на формирование паттерна сегментов как в нервной, так и не в нервной ткани, это два члена гомеодоменового семейства TALE, Pbx и Meis/Prep (reviewed in Mann and Affolter,1998; Moens and Selleri,2006). Дефекты формирования паттерна, наблюдаемые у мышей с мутациями Pbx1 или disruptions в доменах взаимодействия Hox:Pbx , воспроизводят фенотипы потери функции Hox в скелете, краниальных нервах, глоточных карманах и заднем мозге (Selleri et al.,2001; Cooper et al.,2003; Medina-Martinez and Ramirez-Solis,2003; Manley et al.,2004; Remacle et al.,2004; reviewed in Moens and Selleri,2006). Meis1 участвуе т в формировании паттерна в конечностях, спинном мозге и заднем мозге (Mercader et al.,1999; Dasen et al.,2005; Stedman et al.,2009) и, как полагают, изменяет функцию Hox благодаря гетеромерным взаимодействиям как с белками Hox, так и Pbx1 (Knoepfler et al.,1997; Berthelsen et al.,1998). Однако несмотря на изобилие фенотипических доказательств in vivo биохимические исследования ставят вопросы, как в целом TALE кофакторы влияют на избирательность мишеней ДНК факторами Hox. Напр., Hox:Pbx взаимодействия, по-видимому, более важны для функции Hox факторов, которые экспрессируются в передних сегментах скорее, чем в задних (LaRonde-LeBlanc and Wolberger,2003), подтверждая, что эти задние факторы базируются на альтернативных средствах, чтобы идентифицировать и связывать специфические мишени ДНК. Далее, близко родственные Hox белки в комплексе с Pbx1 все соединяются с высоким сродством с теми же самыми сайтами распознавания на ДНК in vitro (Neuteboom and Murre,1997). Т.о., точные механизмы, c помощью которых эти кофакторы ведут к активации или репрессии уникальных, сегмент-специфичных нижестоящих мишеней, остаются отчасти непостижимыми.

Вклады собственных гомеодоменов в функциональную специфичность Hox остаются столь же неоднозначны. У позвоночных исследования in vivo специфичности Hox гомеодоменов часто претворяются в экспериментальный образец, в котором гомеодомен-кодирующие регионы двух Hox генов реципрокно обменивались (Sreenath et al.,1996; Zhao and Potter,2001,2002; Williams et al.,2006; Yallowitz et al.,2009), но результаты этих экспериментов по обмену сильно варьировали в разных экспериментальных системах. Напр., мыши, экспрессирующие измененную форму Hoxa11, в которой её гомеодомен был замещен таковым из Hoxa13, обнаруживали фенотипы формирования паттерна, напоминающие таковые в моделях с избыточной экспрессией Hoxa13 (Zhao and Potter,2001), подтверждая, что гомеодомен Hoxa13 сам по себе является носителем способности, специфицировать некоторые аспекты качественных особенностей сегментов. Напротив, мыши, экспрессирующие форму Hoxa4, в которой гомеодомен был замещен таковым от Hoxc8, не обнаруживали аномалий в развитии позвонков (Sreenath et al.,1996), указывая тем самым, что два гомеодомена функционально взаимно заменяемы. Интересны некоторые исследования, также подтвердившие, что непосредственное связывание гомеодомена с ДНК фактически безразлично для некоторых аспектов Hox функции (Caronia et al.,2003; Williams et al.,2005).

Растет количество работ, подтверждающих важность Hox транскрипционных факторов в формировании паттерна субтипов двигательных нейронов в спинном мозге (Dasen et al.,2003,2005; Shah et al.,2004; Wu et al.,2008; Jung et al.,2010). Спинной мозг птиц организован с столбы двигательных нейронов, которые занимают ограниченные регионы вдоль передне-задней оси. Нейроны, которые иннервируют осевую мускулатуру и мышцы стенки тела составляют medial motor column (MMC), который распространяется на всю длину спинного мозга. lateral motor column (LMC) доминирует в плечевом и lumbosacral (LS) регионах спинного мозга и представлен нейронами, которые проецируются в мускулатуру передних и задних конечностей. Он, свою очередь, подразделяется на латеральное (LMCl) и медиальное подразделения (LMCm), содержащие dorsal-проецирующиеся и ventral-проецирующиеся нейроны, соотв. Во время развития моторного столба (ст.17-29 of Hamburger and Hamilton,1951), LMC собирается способом изнутри наружу, при этом позднее возникающие двигательные нейроны мигрируют за пределы своих более рано появившихся предшественников и занимают более латеральные позиции (Fig. 1A). Двигательные нейроны, предназначенные для каждого столба, могут быть идентифицированы во время и после этой фазы миграции по своей экспрессии членов семейства LIM-HD транскрипционных факторов, включая Lim1, Isl1, Isl2 и Lim3 (Tsuchida et al.,1994) и winged-helix/forkhead транскрипционного фактора Foxp1 (Dasen et al.,2008; Rousso et al.,2008).

Распределение в виде столбов двигательных нейронов также варьирует внутри индивидуальных регионов спинного мозга. Напр., передняя часть LS сегментов содержит немалое количество LMCl, но эта популяция, также как LMC в целом, снижается в более задних LS сегментах (Fig. 1A). Наша предыдущая работа установила тонкий контроль размеров столбов в LS тяже осуществляется за счет действия двух Hox транскрипционных факторов, Hoxd10 и Hoxd11. Hoxd10 экспрессируется на наивысших уровнях в LS сегментах 1-4, где LMCl самый крупный; Hoxd11, напротив, экспрессируется только в сегментах кзади от LS4 (Fig. 1B-E). Ранее мы описали эффект от изменения уровней экспрессии Hoxd10 и Hoxd11 в LS двигательных нейронах (Misra et al.,2009). Избыточная экспрессия Hoxd10 в передних LS двигателных нейронах при использовании in ovo электропортации, сдвигает пропорции субтипов двигательных нейронов в направлении передних латеральных фенотипов, обнаруживаемых по их экспрессии LIM-HD транскрипционного фактора Lim1 и их иннервации дорсальных, передних мышц, но не влияет в целом на общий размер LMC, как было определено по экспрессии LMC-специфического маркера Foxp1 (Fig. 1G, I). В прямой оппозиции к Hoxd10, эктопическая экспрессия Hoxd11 в передних LS сегментах сдвигает пропорции подтипов в направлении Lim1-негативных и Foxp1-негативных медиальных фенотипов обычно многочисленных в задних LS сегментах (Fig. 1H,J).

Противоположные эффекты Hoxd10 и Hoxd11 на спецификацию субтипов двигательных нейронов неожиданны в свете высокой степени сходства аминокислотных последовательностей между их домеными, взаимодействующими с ДНК; два гомеодомена обнаруживают 68% идентичных аминокислот и 88% сходство (Fig. 1K). Принимая во внимание это кажущееся противоречие, мы предприняли попытку исследовать относительны вклад гомеодоменовых в противовес не гомеодоменовым регионам этих транскрипционных факторов, чтобы изменить фенотипы двигательных нейронов, вызываемые неправильной экспрессией. Мы сконструировали гибридные формы Hoxd10 и Hoxd11 сзаменой гомеодоменов, а также формы Hoxd10 с мутациями в аминокислотах в критической для связывания ДНК областью или для взаимодействия с Pbx . Используя in ovo электропортацию, мы неправильно экспрессировали эти измененные Hox белки в LS регионе спинного мозга эмбрионов кур и оценивали их эффекты на развитие множественных субтипов моторных нейронов. Наши результаты подтвердили противоположную функциональность этих двух транскрипционных фактороров, исходя из комбинированных свойств обоих гомеодоменовых и не гомеодоменовых областей.

DISCUSSION

Hox белки, как полагают, играют доминирующую роль в определении субтипов спинальных двигательных нейронов, вызывая экспрессию транскрипционных факторов, специфичных для субтипов нейронов (Dasen et al.,2003,2005; Wu et al.,2008; De Marco Garcia and Jessell,2008; Jung et al.,2010; reviewed in Carpenter,2002; Dasen and Jessell,2009). Пока молекулярные механизмы, как индивидуальные Hox белки инициируют и поддерживают уникальные характеристики двигательных нейронов, остаются неясными, особенно в свете высокой степени гомологии между Hox гомеодоменами и ДНК распознающими последовательностями (Gehring et al.,1994; Mann,1995).

Differing Requirements for Homeodomain and Non-Homeodomain Regions in Two Closely-Related Hox orthologs

Наша предыдущая работа установила, что два Hox транскрипционных фактора, Hoxd10 и Hoxd11, действуют противоположно, чтобы детерминировать количество и положение LMCl двигательных нейронов в LS спинного мозга птиц (Shah et al.,2004; Misra et al.,2009). Мы установили, что неправильная экспрессия Hoxd10 в LS спинного мозга индуцирует эктопическое развитие латеральных, проецирующихся дорсально мотонейронов (LMCl), тогда как неправильная экспрессия Hoxd11 супрессирует их развитиеи вместо этого способствует спецификации медиальных субтивов двигательных нейронов, которые проецируются в вентральные и аксиальные мышцы (LMCm and MMC). Разные и различимые эффекты Hoxd10 и Hoxd11 позволяют оценить относительные вклады взаимодействий, зависимых и независимых от гомеодоменов, в функциональную специфичность Hox в контексте развития двигательных нейронов.

В настоящем исследовании мы использовали in ovo электропортацию, чтобы вызывать экспрессию мутантных форм Hoxd10 и Hoxd11 в LS спинного мозга эмбрионов кур и затем количественно оценивали пропорции субтипов двигательных нейронов,используя иммунологическое окрашивание маркеров, специфичных для субтипов. Мы сначала экспрессировали химерные формы двух транскрипционных фактороров, в которых обменяли гомеодоменовые регионы. Возникающие в результате изменения в двигательных нейронах подтвердили предположение, что способность Hoxd10 индуцировать развитие LMCl-тип а моторных нейронов базмируе6тся как специфических свойствах его нативного гомеодомена и молекулярных свойств не гомеодоменовых регионов, включая не гомеодоменовый остаток триптофана, важный для межбелковых взаимодействий с Hox кофактором Pbx1 (Shen et al.,1997). Ни химерные белки Hoxd10d11HD и Hoxd11d10HD, ни триптофановый мутант Hoxd10W/Q не были способны увеличивать количество клеток LMCl. Напротив, эффекты Hoxd11, по-видимому, управляются не гомеодоменовыми регионами белка. Экспрессия Hoxd11d10HD воспроизводит фенотипы при избыточной экспрессии Hoxd11 за счет уменьшения пропорций двигательных нейронов, экспрессирующих Lim1, Foxp1 и эндогенный Hoxd10 , также за счет увеличения количества клеток, экспрессирующих Lim3 и Chx10-. Следовательно, эти близко родсnвенные Hox ортологи, скорее всего, действуют c помощью разных молекулярных механизмов, чтобы управлять спецификацией подтипов двигательных нейронов.

Homeodomain-DNA Interactions During LMCl Motoneuron Specification

Наблюдение, что функция Hoxd10 во время спецификации LMCl нуждается в своем нативном гомеодомене согласуется с некоторыми недавними анализами высокого разрешения предпочтений связывания гомеодоменов, которые предсказали, что даже очень близкие Hox белки могут предпочитать слегка отличные последовательности распознавания (Noyes et al.,2008; Berger et al.,2008). Многие ранние исследования гомеозисных генов селекторов у Drosophila , что остатки в неструктуированном N-терминальном плече гомеодомена могут выступать ключевыми детерминантами специфичности связывания ДНК, способными модулировать "характерные для определенного класса" гомеодомен-ДНК взаимодействия между третьей ? спиралью гомеодомена и последовательностью, богатой AT (Lin and McGinnis,1992; Ekker et al.,1992; Chan and Mann,1993; Furukubo-Tokunaga et al.,1993; Zeng et al.,1993; Phelan et al.,1994). Недавний структурный анализ подтвердил, этот вывод и далее показал, что модуляция специфичности связывания управляется взаимодействиями между остатками N-терминального плеча гомеодомена и малой бороздой ДНК в специфической последовательности распознавания (LaRonde-LeBlanc and Wolberger,2003; Joshi et al.,2007,2010).

Поскольку гомеодомен Hoxd10, необходимый для спецификации LMCl, по-видимому, недостаточен. Наш анализ также указывает на участие не гомеодоменового элемента, триптофанового остатка, важного для взаимодействий с Pbx1, критического также для функции Hoxd10 . Эта находка согласуется со структурным анализом, показавшим, что формирование комплексов Hox/кофактор является существенным для паралог-специфичных взаимодействий между гомеодоменом и малой бороздой (Joshi et al.,2007,2010). В том же исследовании было подтверждено, что присутствие или отсутствие кофактора может предопределять, приведет ли связывание Hox к активации или репрессии гена мишени. Интересно, мы установили, что эктопическая экспрессия химерного белка Hoxd10d11HD и Hoxd10W/Q, мутантного, лишенного триптофанового остатка, важного для взаимодействия Hox:Pbx, оба они снижают пропорцию клеток, экспрессирующих Lim1. Мы полагаем, что эти эктопические факторы, которые способны формировать "generic" гомеодомен-ДНК взаимодействия, но не специфичные Pbx1-стабилизирующие гомеодомен-ДНК взаимодействия, могут осуществлять "доминантный негативный" эффект за счет конкуренции с эндогенным Hoxd10 за сайты связывания и затем репрессировать нижестоящие мишени (see also LaRonde-LeBlanc and Wolberger,2003).

Находки, что Hoxd10^IQN/AAA, конструкция, несущая мутации в трех аминокислотных остатках, критических для взаимодействий Hox:ДНК, была неспособна активировать транскрипцию in vitro, но была способна воспроизвести эффекты иззбыточно1й экспрессии Hoxd10 in vivo оказались неожиданными . Результаты экспериментов о обменую гомеодоменами, описанные выше, подтвердили, что гомеодомен Hoxd10 необходим для спецификации LMCl, но эта потребность, по-видимому, не связана с его способностью соединяться с ДНК посредством третьей α спирали. Этот результат ставит интригующий вопрос относительно важности канонических гомеодомен_ДНК взаимодействий для функции Hox. Одним из возможных объяснений является то, что Pbx1-стабилизирующие взаимодействия между N-терминальным плечом гомеодомена и минорной бороздой ДНК достаточны для осуществления активации Hoxd10's обычных транскрипционных мишеней. Альтернативно, гомеодомен может вносить вклад в межбелковые взаимодействия с др. факторами, которые, в свою очередь, контролируют транскрипцию, напр., совместные транскрипционные факторы, подобные Pbx1, Meis1, Pax2 и Eya1 (reviewed in Moens and Selleri,2006; Gong et al.,2007). В самом деле, ряд предыдущих исследований открыл возможность не транскрипционной роли Hox белков в формировании сегментного паттерна. Напр., эктопическая экспрессия мутантной, не соединяющейся с ДНК формы Hoxd13 в конечностях частично воспроизводит эффекты эктопического дикого типа гена Hoxd13, вызывая укорочение проксимальных частей длинных костей (Caronia et al.,2003, Williams et al., 2005b). Кроме того, исследования микромассивов идентифицировали ряд факторов, чья экспрессия активируется как Hoxd13, так и с не соединяющейся с ДНК формой Hoxd13 (Williams et al.,2006).

В противоположность Hoxd10,функция Hoxd11, по-видимому, управляется целиком не гомеодоменовыми регионами белка; замена его нативного гомеодомена таковым из Hoxd10 не обнаруживает эффекта на функцию Hoxd11 в контексте спецификации субтипов двигательных нейронов. Эктопическая экспрессия Hoxd11d10HD, подобно экспрессии Hoxd11, ведет к снижению Lim1⁺ двигательных нейронов, увеличению Lim3⁺ двигательных нейронов и к общему снижению экспрессии Hoxd10 внутри моторного столба. В самом деле, способность Hoxd11d10HD репрессировать Lim1 может быть прямым следствием репрессии Hoxd10. С обеими конструкциями мы также отметили увеличение промежуточных нейронов Chx10⁺V2 , но эти клетки оказывались расположенными преимущественно выше моторных столбов и экспрессировали очень немного EGFP, маркер трансфекции, на исследуемой стадии (ст. 29). Эта находка открывает возможность клеточного неавтономного эффекта, правда раннее клеточно автономное влияние возможно; некоторые предшественники двигательных нейронов могут быть репрограммированы, чтобы принять отличительные особенности промежуточных нейронов V2, но при этом теряют экспрессию EGFP на ст. 29. Независимо от наблюдаемых эффектов Hoxd11 и Hoxd11d10HD на промежуточные нейроны, согласующихся с предыдущими исследованиями, было показано, что эктопическая экспрессия Hox в развивающемся заднем мозге ведет к изменениям экспрессии Irx3 (Guidato et al,2003), белка, считающегося важным в спецификации промежуточных нейронов V2 (see for review Briscoe and Novitch,2008).

Функциональная эквивалентность Hoxd11 и Hoxd11d10HD в спецификации спинальных нейронов сходна с таковой, ранее наблюдаемой в осевом скелете, почках и бранхиальных дугах после эктопической экспрессии определенных Hox факторов с не нативными гомеодоменами (Sreenath et al,1996; Zhao and Potter,2002; Yallowitz et al.,2009). Hoxd11 отличается от Hoxd10 тем, что принадлежит подкластеру более задних 5' Hox генов (Hox11-13), которые не взаимодействуют с кофактором Pbx1 (Shen et al.,1997) и лишены критического триптофанового остатка, необходимого для таких взаимодействий. Hoxd10 и Hoxd11-13 также обнаруживают разные регуляторные роли в морфогенезе как почек, так конечностей (reviewed in Di-Poi et al.,2007; Zakany and Duboule,2007), это ставит вопрос, действуют ли они посредством сходных дивергентных механизмов внутри этих органов.

Identifying Downstream Targets of Hoxd10 and Hoxd11 During Motoneuron Specification

Важно отметить, что изменения в пропорциях подтипов двигательных нейронов, вызываемые эктопической экспрессией Hox, могут возникать или в результате избирательной гибели одного из подтипов или в результате специфического превращения одного подтипа в другой. У эмбрионов избыточно экспрессирующих Hoxd10 или Hoxd10IQN/AAA, количество моторных нейронов Lim1⁺ увеличивается, несмотря на небольшое уменьшение общего количества двигательных нейронов, что подтверждает последнюю гипотезу. Сходным образом, у Hoxd11 и Hoxd10d110HD эмбрионов, уменьшение Lim1⁺ двигательных нейронов значительно выше, чем общая потеря двигательных нейронов после электропортации, подтверждая, что некоторые, должны быть LMCl нейронами, перепрограммированными, чтобы принять характеристики LMCm/MMC нейронов. У Hoxd11d10HD и Hoxd10W/Q эмбрионов, однако, уменьшение Lim1⁺ двигательных нейронов приближается к общему уменьшению двигательных нейронов, оставляя открытой возможность, что избирательная потеря клеток играет роль в сдвиге пропорций субтипов. Идентификация непосредственных нижестоящих мишеней для Hoxd10 и Hoxd11 д. помочь сделать выбор между этими двумя механизмами.

Hox белки,как было установлено, регулируют экспрессию ряда критических транскрипционных факторов, ассоциированных со спецификацией подтипов нейронов, включая членов семейств Pax и Irx (Pruitt,1994; Theokli et al.,2003). Сильные эффекты эктопической экспрессии Hox и/или потери функции, связаны с широким кругом известных или потенциальных нижестоящих мишеней, подтверждая, что Hox белки занимают позицию вблизи или на верхушке сигнальных иерархий, ответственных за формирование паттерна заднего и спинного мозга. Недавнее исследование функции Hox Yallowitz с сотр. (2009) идентифицировало общий энхансерный сайт, используемый двумя разошедшимися Hox факторами, Hoxa2 и Hox11 паралогами, чтобы репрессировать или активировать, соотв., экспрессию нижестоящего транскрипционного фактора Six2 (see also Gong et al.,2007). Способность репрессировать или активировать в данном случае была детерминирована полностью c помощью не гомеобоксных регионов двух Hox факторов, и их специфических взаимодействий с кофакторами, подтверждая высокую степень функциональной эквивалентности между гомеодоменами. В отличие от Hoxa2 и Hox11, гомеодомены Hoxd10 и Hoxd11 не полностью функционально взаимозаменяемы. Это может быть важным для будущих исследований по определению в точности, какие мишени они контролируют и является ли субнабор этих мишеней общим во время спецификации двигательных нейронов.

Hox transcription factors influence motoneuron identity through the integrated actions of both homeodomain and non-homeodomain regions Mala Misra, Emily Sours, Cynthia Lance-Jones Developmental Dynamics Volume 241, Issue 4, pages 718–731, April 2012

Hox transcription factors influence motoneuron identity through the integrated actions of both homeodomain and non-homeodomain regions
Mala Misra, Emily Sours, Cynthia Lance-Jones
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 4, pages 718–731, April 2012