Хотя все мышцы тела эмбрионов амниот происходят из эпителиальных сомитов, развитие скелетных мышц происходит несколько отличными путями (Evans et al.,2006). Клетки мышечных предшественников или дифференцируются внутри сомитов, чтобы сформировать сегментированные миотомы, которые затем прогрессивно увеличиваются как дорсо-медиально (epaxially), так и вентро-латерально (hypaxially), или они мигрируют, чтобы достичь места, где они будут дифференцироваться, или они воспринимают программу развития, которая является комбинацией этих двух процессов (Kalcheim et al.,1999; Hollway and Currie,2005; Evans et al.,2006).
Вскоре после их образования, сомиты подвергаются компартментализации, давая склеротом (источник позвонков, ребер и сухожилий мышц спины) и эпителиальный дермамиотом (источник скелетных мышц, дермы, некоторого эндотелия, гладких мышц и предшественников коричневого жира; Kalcheim and Ben-Yair,2005; Buckingham,2006; Christ et al.,2007; Seale et al.,2008). Предшественники миграторных мышц отсоединяются от гипаксиальной губы дермамиотома на специфическом осевом уровне и мигрируют в свое финальное место назначения (напр., конечности, диафрагму). Только после достижения своих мишеней, они вступают в реализацию миогенной программы, активируя экспрессию myogenic regulatory factors (MRFs) Myf5, MyoD, MRF4 и myogenin, которые контролируют их детерминацию и дифференцировку (Buckingham et al.,2003). Затем миобласты удлиняются и сливаются, чтобы сформировать мышечные трубки, в конечном итоге созревающие в мышечные волокна. Напротив, мышечные предшественники, которые дифференцируются внути миотомного компартмента сомитов высвобождаются из губ дермамиотома непосредственно в пространство миотома на всех уровнях оси тела (Ben-Yair and Kalcheim,2005; Hollway and Currie,2005). Они запускают миогенную программу in situ и образуют сегментированные мышечные массы, миотомы. На поздней стадии, новый пул пролиферирующих мышечных предшественников, экспрессирующих Pax3 и Pax7, проникает в миотом из центральной части дермамиотома (Ben-Yair and Kalcheim,2005; Gros et al.,2005; Kassar-Duchossoy et al.,2005; Relaix et al.,2005), внося вклад в рост миотома. Удивительно, у эмбрионов амниот миотом всего лишь временная структура и не иннервируется (Deries et al.,2008). Скорее всего, сегментированные миотомы трансформируются: epaxially в комплекс глубоких мышц спины и hypaxially в межреберные мышцы и мышцы стенки тела (Christ et al.,1983; Tremblay et al.,1998; Kalcheim et al.,1999; Deries et al.,2010).
Все эти события происходят в контексте сложного внешнего окружения, состоящего из соседних клеток, диффундирующих сигнальных молекул ими продуцируемых и окружающего extracellular matrix (ECM). ECM состоит из макромолекул, прежде всего из гликопротеинов и протеогликанов (Frantz et al.,2010). Они участвуют в тканевой дифференцировке и развитии не только как механическая поддержка, но и также как передающие биомеханические и биохимические сигналы, обеспечиваемые с помощью трансмембранных рецепторов, таких как интегрины (van der Flier and Sonnenberg,2001; Barczyk et al.,2010; Rozario and DeSimone,2010).
Figure 1. Developmental stages of the epaxial dermomyotome and myotome. Four key stages of epaxial dermomyotome/myotome development (DMM stages 1–4) are shown from the formation of the myotome to the dissociation of the central dermomyotome (A–D). Only the axis levels from forelimb to hindlimb were studied. A: DMM stage 1: Appearance of the first fully differentiated myocytes. B: DMM stage 2: Growth of the dermomyotome in the dorso-medial to ventro-lateral direction compared with stage 1, but epaxial lip still rounded; accumulation of differentiated myocytes. C: DMM stage 3: Dermomyotome has grown further, and epaxial lip has become oblong. Fully differentiated myocytes have increased in number and nonelongated myoblasts, derived from the Pax3/Pax7 precursors entering the myotome from the central dermomyotome, are seen between the myotome and dermomyotome. D: DMM stage 4: Central dermomyotome sheet has de-epithelialized, but epaxial dermomyotome lip is still epithelial; epaxial-most myocytes have started to translocate; presence of a large number of nonelongated myoblasts within the muscle mass. E: The stage of early epaxial muscles is depicted to show the end of the dermomyotome/myotome as a morphological unit; it shows the full disappearance of the dermomyotome and the transformation of the myotome. For simplicity, the caudal and rostral lips of the dermomyotome are not drawn. The illustrations are schematic and are not intended to be to scale with each other. DMM, dermomyotome/myotome; C, caudal; D, dorsal; L, lateral; M, medial; R, rostral; V, ventral; TS, transversospinalis unisegmental muscles; LG, longissimus muscle; IC, iliocostalis muscle; NT, neural tube; FL, forelimb level; HL, hindlimb level; IL, interlimb level; MHC, myosin heavy chain; MRFs, myogenic regulatory factors.
Хотя хорошо известно, что ECM играет важную роль на некоторых ступенях миогенеза, картина его взаимодействия с клетками развивающихся мышц далека от завершения (Thorsteinsdottir et al.,2011). Чтобы понять роль ECM во время эмбриогенеза, важно знать точную организацию этого матрикса в отношении развивающейся ткани. Нет исследований, адресованных трехмерной (3D) организации ECM во время разных фаз морфогенеза миотомов. Большинство исследований анализировало паттерн распределения компонентов ECM или с помощью анализа изображений низкого разрешения в целом или на срезах тканей с высоким разрешением с недостаточными искажениями ткани и ограниченной 3D пространственной организацией в деталях. Получение конфокальных изображений целых иммунофлюоресцентно окрашенных эмбрионов делает возможной 3D реконструкцию (Martins et al.,2007) с вявлением ценных деталей в сложной 3D архитектуре ткани и её ECMs.
Использование этого подхода к эмбрионам мышей, позволило нам картировать организацию fibronectin, tenascin и laminin матрикса вокруг и внутри дермамиотом и миотома в 3D и связать эту организацию с локализацией и морфологией клеток дермамиотома и миотома. Мы сконцентрировались исключительно на epaxial области между осевыми уровнями между передними и задними конечностями, поскольку механизмы их развития довольно хорошо известны и не меняются в этой области.
Fibronectin является главным гликопротеином интерстициального матрикса у ранних эмбрионов (Duband et al.,1987; Ostrovsky et al.,1988; Cachaco et al.,2005), а отсутствие fibronectin ведет к дефектам сомитогенеза и морфогенеза нервной трубки (George et al.,1993; Georges-Labouesse et al.,1996; Rifes et al.,2007; Martins et al.,2009; Rozario and DeSimone,2010). Более того, fibronectin, как было установлено, играет роль во время развития миотома у рыбок данио (Snow et al.,2008).
В отличие от fibronectin, tenascin, по-видимому, ограничен очень специфическими областями во время эмбриогенеза (Riou et al.,1992; Jones and Jones,2000). Он впервые обнаруживается после гаструляции и наблюдается вокруг сомитов. Затем он присутствует во время развития мышц, но снижается во время поздней беременности и оказывается ограниченным сухожилиями (Crossin et al.,1986; Saga et al.,1992; Wang et al.,1995).
Laminins являются основными гликопротеинами базальных мембран. Они формируются за счет комбинации трех цепочек , ?, ? и ? (Durbeej,2010). Некоторые laminins важны для эмбриогенеза и их сборка является первой ступенью образования базальных мембран и также необходимым условием для включения др. компонентов базальных мембран (Smyth et al., 1999; Miner and Yurchenco, 2004; Yurchenco and Patton, 2009; Durbeej,2010). Laminin 111 и 511 является частью базальной мембраны эпителиальных сомитов, дермамиотома и миотома (Bajanca et al.,2006; Anderson et al.,2009; Thorsteinsdottir et al.,2011). Laminin 211 и 221 экспрессируются позднее и являются основными ламининами базальной мембраны скелетных мышц (Cachaco et al.,2005; Durbeej,2010). Их присутствие в базальной мембране мышечных трубок важно для стабильности мышечных трубок во время сокращений, а отсутствие цепи laminin ?2 ведет к мышечной дистрофии (Guo et al.,2003; Huh et al.,2005).
Для точного анализа взаимоотношений между клетками и ECM во время развития дермамиотома и миотома, мы впервые установили 4 стадии развития (DMM стадии 1-4), которые предоставляют удобный инструмент для изучения развития дермамиотома и миотома. Наш детальный 3D анализ показал, что fibronectin формирует обильный матрикс во всех интерстициальных пространствах и располагается также на границе между сомитами. где он может в комбинации с tenascin, выполнять подобную сухожилиям функцию для удлиняющихся миоцитов. В подтверждение этой гипотезы, мы установили, что ?v-integrins, которые могут служить в качестве рецепторов fibronectin и tenascin, обогащены на кончиках миоцитов. Пучки fibronectin и tenascin распространяются также вдоль миоцитов миотома, т.е. занимают подходящую позицию для обеспечения поддержки элонгации клеток, расположения и позднее даже для слияния и транслокации. Laminin матрикс обнаруживает неожиданно динамический паттерн; они сначала собираются в ансамбли, а затем разбираются во время развития миотома и продуцируются снова при формировании мышечных масс. Интересно, что матрикс базальных мембран, выстилающих дермамиотом и миотом никогда не обнаруживают полной непрерывности, скорее всего, из-за временной природы обоих этих компартментов, но их природная прерывистость может дополнительно делать возможными прямые контакты с соседними клетками. Этот детальный 3D анализ предоставляет новую информацию о потенциальной роли fibronectin, tenascin и laminin матрикса во время развития миотомов и морфогенеза epaxial мышц.
Figure 8. Model of the laminin, fibronectin, and tenascin matrices distribution pattern during DMM stages 1–4. This scheme summarizes the distribution patterns of laminin (purple), fibronectin (green), and tenascin (light blue) at the four DMM stages analyzed in this study. For clarity, the intersegmental border is only shown on the caudal border of each segment and the fibronectin present on the lateral side of the dermomyotome (between dermomyotome and ectoderm) is not drawn. A: At DMM stage 1, a discontinuous laminin basement membrane lines the dermomyotome and the myoblasts entering the myotome are assembling laminin on the medial side of the myotome. Fibronectin and tenascin matrices are present in the intersegmental border (although tenascin is not abundant at this stage) and on the medial side of the myotome. B: At DMM stage 2, the laminin basement membranes have expanded with the growth of the dermomyotome and the myotome, but are still discontinuous. The tenascin matrix is now thicker at the intersegmental borders and along the myocytes. The fibronectin matrix is abundant at the intersegmental borders and on the medial side of the myotome and a few fibronectin bundles are visible between the dermomyotome and the myotome. C: At DMM stage 3, the laminin basement membranes have reached their densest state but are still discontinuous. The tenascin matrix has grown in thickness and in number of bundles. The fibronectin matrix is even denser than at the previous stage and is now clearly present between the dermomyotome and the myotome and generally runs along the elongated myocytes. D: At DMM stage 4, both laminin basement membranes have undergone a dramatic disassembly. The only basement membrane visible is lining the epaxial lip of the dermomyotome, the last remnant of the epithelial dermomyotome. A few spots of laminin are seen within the muscle mass. The tenascin matrix has the same pattern as that of the earlier stages, but is denser. The fibronectin matrix is now even more abundant, filling all the spaces around and between the myocytes. The illustrations are schematic and not to scale with each other. DMM, dermomyotome/myotome; C, caudal; D, dorsal; L, lateral; M, medial; R, rostral; V, ventral; NT, neural tube; MHC, myosin heavy chain; MRFs, myogenic regulatory factors.
Итак, мы картировали трехмерную организацию fibronectin, tenascin, и laminin с помощью иммунофлюоресценции во время раннего epaxial миогенеза у эмбрионов мыши. Мы определили 4 стадии развития дермамиотома и миотома и выявили 3D организацию миогенных клеток с их ECM во время этих стадий. Fibronectin обилен во всех интерстициальных тканях, тогда как tenascin ограничивается границами между сегментами. Пучки fibronectin и tenascin также проникают в миотом, возможно способствуя расположению миоцитов. Ламининовый матрикс вычленяет дермамиотом и миотом и подвергается динамическим изменениям, коррелирующими с ключевыми онтогенетическими событиями. Когда сегментированные миотомы трансформируются в epaxial мышечные массы, то ламининовый матрикс разбирается и миоциты используют обильный фибронектиновый матрикс для достижения своей финальной организации.
